Introduction
مراقبة نشاط الخلايا العصبية في حيوان في حالة تأهب تشارك بنشاط في مهمة السلوكية أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفة وتنظيم الجهاز العصبي. وقد تم تسجيل خارج الخلية من النشاط الكهربائي من وحدات الخلايا العصبية واحدة لفترة طويلة أداة الأساسية لنظم علم الأعصاب وما زال على نطاق واسع في استخدام في الوقت الحاضر. تتوفر مجموعة متنوعة من أنواع القطب وتكوينات اعتمادا على المطالب العلمية والتقنية للتجربة معينة. مزروع مزمنة ميكرودريفيس أو وغالبا ما تستخدم صفائف الكهربائي في الحيوانات تتحرك بحرية، بما في ذلك الطيور والقوارض، والرئيسيات غير البشرية 1-4. بدلا من ذلك، وغالبا ما تستخدم الاختراقات الحادة مع المعدن أو الزجاج الميكروية عبر مياداة مجهرية الخارجي لتسجيل من الحيوانات تخدير أو تقييد الرأس. زجاج كهربائي ممص مكروى لديها ميزة أنها يمكن أن تستخدم في juxtacellular أو "خلية المرفقة" التكوين لعزل لا لبس فيهنشاط الخلايا العصبية واحدة دون مضاعفات ارتفاع اللاحق الفرز 5. هذه الأقطاب مزيد يسمح التسجيل من الخلايا التي تم تحديدها تشريحيا أو المواقع، لأنها يمكن أن تستخدم لحقن دائع صغيرة من الصبغة أو تشريحي عصبي استشفاف، أو حتى لملء سجلت الفرد الخلية. وقد تم تطبيق هذا التكوين بنجاح في الجرذان والفئران والطيور 6-10. وتركز تقنية وصفها حاليا على مراقبة juxtacellular والودائع صبغ خارج الخلية في حالة تأهب، الفئران ضبط النفس الرأس. لاحظ أنه على عكس خلية واحدة juxtacellular يملأ، هذه الودائع صبغ لا تقدم معلومات حول مورفولوجيا الخلايا أو إسقاطات محور عصبي 11، لكنها تمكين التوطين التشريحي الدقيق إلى ما يقرب من 50 ميكرون، وخطيرة، ولها عائد أعلى بكثير في الحيوانات تنبيه. المعلومات المتعلقة خلية واحدة juxtacellular يملأ مع ذلك يتم توفير كاستراتيجية بديلة لوضع العلامات التشريحية.
وباختصار، فإنيتكون البروتوكول من ثلاث مراحل رئيسية. في المرحلة الأولى، وتأقلم الفئران على ضبط النفس في الجسم جورب القماش (الشكل 1) على مدى فترة من 6 أيام. في المرحلة الثانية، وهو جهاز مساند الرأس (الشكل 2) وغرفة تسجيل تزرع جراحيا مثل هذه أن الفئران يمكن الحفاظ في الطائرة التجسيمي خلال عدة جلسات تسجيل اللاحقة (الشكل 3)؛ يتيح هذا الإجراء المجرب لاستهداف مناطق معينة دون القشرية من الدماغ للدراسة الكهربية على أساس مرجعية معيارية تنسق 12. المرحلة الثالثة تتضمن وضع الفئران في رقصة المناسبة لإجراء التجارب السلوكية والكهربية (الشكل 4)، بناء القطب من أنبوب الكوارتز الشعرية (الشكل 5)، مما يجعل التسجيلات العصبية juxtacellular أن عزل لا لبس فيه وحدة واحدة 6-9، و بمناسبة locati التشريحيةعلى الموقع تسجيل مع شيكاغو السماء الزرقاء صبغ (أرقام 6 و 7). يتم تنفيذ التسجيلات مع الرصد السلوكي في وقت واحد. ومع ذلك، فإن التفاصيل الفنية للسلوك يعتمد على الأهداف العلمية من كل تجربة، وبالتالي فهي خارج نطاق بروتوكول واحد. بعد الانتهاء من إجراء التجارب، والتي يمكن أن تتكرر في أيام متعددة، والموت الرحيم للحيوان. يتم استخراج الدماغ ومعالجتها وفقا للتقنيات القياسية تشريحي عصبي باستخدام الحقل مشرق أو مضان المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ البروتوكولات التجريبية خارجا على إناث فئران لونغ إيفانس (250-350 ز) وفقا لرعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية المنصوص عليها اتحاديا وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو.
1. التأقلم الفئران على الجسم ضبط النفس
ملاحظة: ضع الفئران على نظام غذائي مقيدة. إطعام الفئران مرة واحدة يوميا مباشرة بعد كل دورة المعالجة اليومية للتأقلم الفئران على ضبط النفس (موضح أدناه). توفير تغذية كافية للحفاظ على الحيوانات في 80٪ من وزنه الأولي. هذا المبلغ هو ما يقرب من 6 غرامات من الأعلاف يوميا لمدة 250 غ أنثى طويل ايفانز الفئران.
- تأقلم الفئران ليجري التعامل معها من قبل البشر. بلطف كبح جماح الفئران باليد لفترات من حوالي 5 ثانية كل 30 ثانية. القيام بذلك لمدة 15 دقيقة يوميا في 2 أيام متتالية. مراقبة الفئران يوميا لعلامات الإجهاد أثناء فترة التدريب. وتشمل علامات تكافح طاستجابة ن إلى ضبط النفس، والنطق، والأسنان الثرثارة.
- في يوم 3 الثالثة، وضع الفئران في قطعة قماش جورب-يقيد الجسم (الشكل 1) لمدة 15 دقيقة يوميا على يومين متتاليين.
- في يوم 5 الجاري، وضع الفئران داخل جورب، ووضع جورب داخل أنبوب جامدة على رقصة التجريبية (الشكل 4). ترك الفئران في الأنبوب لمدة 15 دقيقة يوميا في 2 أيام متتالية.
- إطعام الفئران مباشرة بعد كل دورة تدريبية. في نهاية الدورة الأخيرة (ال يوم 6) منح حق الوصول غير المقيد إلى الغذاء. اختر لزرع فقط تلك الفئران التي لا تظهر عليها علامات الإجهاد المفرط في اليوم التدريب الأخير.
ملاحظة: على الرغم من اختيار الفئران لزرع هو ذاتي، في أيدينا تم العثور على أكثر من 90٪ من الفئران أن تكون استجابة لالتعود وقادرة على الخضوع لزرع.
2. غرس غرفة تسجيل وجها لضبط النفس آلية
- جعل إعادةسلك املؤمتر عن طريق لحام أسلاك مكشوفة الفولاذ المقاوم للصدأ لموصل دبوس. قطع الأسلاك بحيث تبقى 3-5 ملم كشفت من قبل دبوس. الأوتوكلاف السلك إشارة، جنبا إلى جنب مع جميع الأدوات الجراحية.
- إدارة الكيتامين / زيلازين التخدير. إدارة 95 ملغم / كغم من الكيتامين مختلطة مع 5 ملغ / كغ زيلازين البريتونى. الجرعة الأولي يستمر لمدة 1½ إلى 2 ساعة. تكملة التخدير كل 30-45 دقيقة بعد ذلك، حسب الحاجة. تليين عيون الحيوان مع مرهم للعين.
- تحقق منعكس اصبع القدم انسحاب لتحديد الطائرة من التخدير، والحفاظ على التخدير عند الضرورة.
- وضع الفئران في إطار عقد التجسيمي بقضبان الأذن (الشكل 3A). حلق الشعر على الرأس وتطهير مكان الجرح مع بوفيدون اليود (حل 10٪). احرص على إدراج القضبان الأذن بشكل مناسب بحيث لا تضر طبلة الأذن. القضبان الأذن مع نصائح صريحة هي الأفضل.
- إجراء شق مع مشرط يقاربالمطاف على طول خط الوسط من الجمجمة من مستوى rostro الذيلية للعيون إلى الجزء الخلفي من الأذنين. استخدام مقص لقطع وإزالة 2-3 ملم شريط من الجلد على جانبي الشق.
- كشط بعيدا السمحاق لفضح سطح الجمجمة إلى التلال الجانبية. تغطية الجمجمة يتعرض مع طبقة رقيقة من superglue.
- حفر حفرة صغيرة، وقطره أصغر قليلا من 0-80 مسامير، وذلك باستخدام ½ مم لدغ الحفر (انظر قسم المواد). حفر حفرة الخلفي فورا إلى حيث تجتمع خياطة bregma الحافة الجانبية، وبزاوية 30-45 درجة في الجمجمة، بحيث المسمار يمكن أن تذهب في مع الجزء العلوي الجانبي أكثر من القاع.
- برغي في المسمار 0-80 آلة مسطحة القاع إلى الحفرة (تقريبا 3 أدوار)، في 30-45 درجة زاوية. يجب الحرص على عدم المسمار في عميق جدا لتجنب إتلاف أنسجة الدماغ الكامنة.
- كرر هذا الإجراء لمدة 6 مسامير إضافية في تكوين معروضة
- وضع إبرة حقنة في تتلاعب stereotax. قياس من خياطة bregma، وإحداث تأثير في الجمجمة مع الإبرة القريب، ولكن خارج موقع حج القحف المطلوب، كعلامة مرجعية.
ملاحظة: في هذه التظاهرة، الإحداثيات التجسيمي للعلامة هي 3 ملم الخلفي و 1 مم الجانبية للخياطة bregma. - بمناسبة دنت مع علامة دائمة. ملاحظة إحداثيات التجسيمي للعلامة، لأنها سوف تكون بمثابة نقطة مرجعية التجسيمي (الشكل 3B).
- جعل حج القحف تركزت على الإحداثيات المطلوبة (3 ملم الخلفي و3 مم الجانبية لbregma في هذا المثال). ترك الأم الجافية سليمة. تغطية حج القحف مع تعديل السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (125 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES، 3.1 ملي CaCl 2، 1.3 ملي MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4) 13 (الشكل 3C). قطع أنبوب 0.2 مل الطرد المركزي إلى 4-5 ملم في الطول، وقطع الغطاء. وضع أنبوب على الجمجمة ومركز على مدى حج القحف.
- تطبيق الاسمنت الأسنان حول الجزء السفلي من الأنبوب لاغلاق القاعدة من الأنبوب إلى الجمجمة. يجب الحرص على عدم تسرب الأسمنت في حج القحف يتعرض (الشكل 3D).
- حفر ثقب صغير آخر (حوالي ½ مم) في لوحة الجمجمة المقابل وإدراج بعناية السلك المرجعية. بناء الأسلاك إشارة عن طريق لحام دبوس التي واجهات مع مكبر للصوت تسجيل لنهاية السلك (انظر القسم المعدات). لا تتحرك السلك إشارة مرة واحدة هو في الدماغ لأن هذا قد يسبب الضرر.
- تطبيق superglue إلى الحفرة التي تم إدراج السلك. وهذا ختم دبوس والأسلاك في مكانها مؤقتا.
- مزيج شطري عدة هلام السيليكون (انظر قسم المواد) في أجزاء متساوية تقريبا. انتظر دقيقتين لخلط وفيلل أنبوب الطرد المركزي حوالي ⅓ الكامل مع هلام.
- إرفاق آخر زاوية الحق المشبك (انظر قسم المواد) إلى شريط الرأس ضبط النفس. نعلق لوحة الرأس (الشكل 2A) إلى شريط القابضة (الشكل 2B) في زاوية 45 درجة الملعب بحيث الجزء السفلي من لوحة هو نحو الأنف من الحيوان. ومن المفيد لاستخدام الميل لضبط زاوية الملعب في المباراة التي من رقصة التجريبية (الشكل 4).
- إرفاق شريط عقد على الذراع stereotax مناور بحيث شريط موازية للالقضبان الأذن. خفض شريط وصفيحة بحيث لوحة هي الخلفي للخياطة امدا والأمامية إلى الذيلية أقصى المسمار.
- فهم الأمامي رئيس الترباس (وهو 8-32 مسمار أو برغي، راجع قسم المواد) في حوالي 45 درجة زاوية مع يد العون الذراع والمشبك، حتى أن رئيس المسمار يواجه أسفل ونحو ذيل الحيوان. خفض المسمار بحيث أنها تمس النملةerior 0-80 مسامير (الشكل 3F، G).
- تأمين الترباس ولوحة في مكان مع الاكريليك الأسنان. تطبيق الاكريليك الأسنان في جميع أنحاء رؤساء المسمار العظام، دبوس المرجعية، وحول جوانب أنبوب الطرد المركزي. انتظر حوالي 10 دقيقة لالاكريليك الأسنان لتجف (الشكل 3H).
- ضع طبقة من الاسمنت الأسنان حول حواف الاكريليك الأسنان، وتقوية الجلد لعملية الزرع. انتظر حتى يجف الأسمنت.
- كزة عدة فتحات في السقف من أنبوب الطرد المركزي، ووضع غطاء على أنبوب.
- إزالة يد العون المشبك. ثم إزالة بعناية شريط-عقد رئيس من stereotax، ثم قم بإزالة لوحة الرأس من شريط (الشكل 3I).
- إزالة الحيوان من stereotax وإدارة الرعاية والمراقبة اللاحقة للعمليات الجراحية وفقا لكل القواعد واللوائح والقوانين (على سبيل المثال، البوبرينورفين 0.02 مغ / كغ، كل 8-12 ساعة مدة لا تقل عن 24ساعة). إذا التهاب يتطور حول حواف الزرع، وتطبيق طبقة رقيقة من مرهم مضاد حيوي لموقع المتضررين يوميا حتى حلها.
3. رصد Juxtacellular من وحدات الخلايا العصبية
- سحب الكوارتز أنابيب الشعرية على غاز ثاني أكسيد الكربون ممص مكروى الليزر مجتذب (انظر القسم المعدات) بأقطار غيض من أقل من 1 ميكرون (الشكل 5A).
ملاحظة: سوف تختلف المعلمات التدفئة وفقا لأداة معينة، وأن قطر الرقبة المطلوبة سوف تختلف تبعا لبنية الدماغ من الفائدة. للتسجيلات في المهاد الفئران، بال micropipettes لها أعناق تتراوح 5-7 ملم. - تأمين ماصة في مكان تحت المجهر النقيض تدخل الفرق (DIC) مجهزة أهداف العمل الطويلة المسافة. استخدام الصلصال لعقد ماصة في مكان على المسرح المجهر.
- التحرك ببطء كتلة الزجاج (0،5-1 سم سميكة، قطعة من الزجاج تستخدم لماكالسكاكين مشراح جدا جي مريحة) في مجال الرؤية مع طرف ماصة. باستخدام مياداة مجهرية المرحلة، المس بلطف طرف ماصة على الزجاج، الامر الذي ادى الى كسر. كرر حسب الضرورة حتى ماصة قطرها الخارجي هو بين 1-3 ميكرون (الشكل 5B، C). التأكد من أن هذه بال micropipettes لها ممانعات بين ما يقرب من 5-15 MΩ.
- إعداد المالحة خارج الخلية (135 مم كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 1.8 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 5 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم) 8 وإضافة 2٪ (ث / ت) شيكاغو السماء الزرقاء. باستخدام حقنة بإبرة G 30 أو أصغر، وملء نهاية الجزء الخلفي من ماصة مع الحل. بدلا من ذلك، لخلية واحدة وضع العلامات juxtacellular إضافة 2٪ (ث / ت) Neurobiotin أو أمين ديكستران المعقدة البيروكسيديز (BDA-3000 أو BDA-10000) إلى محلول ملحي في مكان شيكاغو السماء الزرقاء.
- وضع الفئران داخل جورب من القماش داخل الأنبوب جامدة على رقصة التجريبية المناسبة (
- نعلق لوحة الرأس زجرية على الفئران على قطعة المقابل على رقصة. للقيام بذلك، أولا يعلقون لوحة وجها لضبط النفس في المكان، ثم ثبته باستخدام 4-40 المسمار. مما لا شك فيه أن تنتظر حتى الحيوان هو الهدوء من أجل تجنب تطبيق عزم الدوران المفرط في الرأس. وبعد ذلك، وضع الجوز 8-32 على الترباس تقييد الرأس الذي هو مزروع على الفئران. ثم المسمار في الخيوط قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ لرئيس الترباس. يضعوا قضيب إلى رقصة التجريبية في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن شددت في مكان (الشكل 4).
ملاحظة: تأمين الحيوان مع رئيس الترباس فضلا عن لوحة وجها لضبط النفس دقيقةimizes الانحناء للأجهزة ويحسن الاستقرار التسجيل. في معظم الحالات يمكن تسجيل تبدأ في اليوم الأول من الحيوان هو-ضبط النفس الرأس. ومع ذلك، إذا يتململ الحيوان بشكل مفرط أو يتذرع، وتوفير يوم واحد من الرأس ضبط النفس التدريب التعود قبل بدء أي تسجيلات. في هذه الحالة، وترك الحيوان على رقصة لمدة 15 دقيقة ومن ثم وضعها مرة أخرى في قفصه. كرر هذه الخطوة في اليوم التالي وتواصل مع البروتوكول.- فتح غرفة تسجيل وإزالة هلام السيليكون. تنظيف حج القحف باستخدام ملقط غرامة إذا الأنسجة وإعادة نمت في حج القحف.
- إرفاق ماصة للمياداة مجهرية الآلية، والمكونات في headstage قبل مكبر للصوت.
ملاحظة: في مظاهرة الحالية، يتم استخدام الدائرة تتابع صغيرة على headstage للتبديل بين أسلاك من الرصاص مكبر للصوت ومصدر الجاري الخارجي مع الامتثال عالية (الشكل 6A-C). لاحظ أن بعض مكبرات الصوت لديها الاقتضاء المدمج في مصدر الامتثال عالية(انظر الأقسام مناقشة والمواد).- استخدام مياداة مجهرية الآلية للتحرك غيض من ماصة لعلامة حددت stereotaxically في غرفة تسجيل. ملاحظة إحداثيات هذا الموقع. يجب الحرص على عدم كسر غيض من ماصة على الجمجمة.
- نقل ماصة إلى الموقع التسجيل المطلوب في المحاور الأمامية-الخلفية وميديو الأطراف. ثم دفع ماصة البطني من خلال الجافية إلى أن ما يقرب من 500 ميكرون الظهرية إلى الموقع تسجيل المقصود.
- تقدم ببطء ماصة أثناء الاستماع لارتفاعه الأحداث على رصد الصوت من الجهد تضخيم سجلت بين طرف ماصة وسلك المرجعية. وبمجرد تحديد ارتفاعه الأحداث، والاستمرار في تحريك ميكرون ماصة 0-100 حتى الانحرافات الإيجابية الذهاب الجهد أكبر من ويلاحظ ما يقرب من 500 μV.
ملاحظة: إن المقاومة القطب تزيد بعامل حوالي 1،5 حتي 10 WHأون يحدث هذا.- بدء تسجيل مرة واحدة وقد تم عزل وحدة كما وفقا لخطوة 3.11، جنبا إلى جنب مع جميع التدابير السلوكية والفسيولوجية الأخرى المثيرة للاهتمام. في التظاهرة الحالية، ويتم رصد تحركات شعرة أنفية المولدة ذاتيا مع سرعة عالية بالفيديو (انظر قسم المواد).
- لتسمية الموقع تسجيل، والتبديل القطب يؤدي إلى الاتصال بمصدر الحالي. هناك عدة طرق للقيام بذلك، وذلك باستخدام إما الدائرة تتابع (الشكل 6A - C)، المدمج في مصدر الحالي على مكبر للصوت، أو يدويا (الشكل 6D، راجع الخطوة 3.8 ومناقشة). تمرير -4 أمبير مع 2 البقول ثانية في دورة العمل 50٪ لمدة 4 دقائق لحقن iontophoretically شيكاغو السماء الزرقاء من خلال ماصة.
- قتل ويروي الحيوان بعد عدة إجراءات وضع العلامات وفقا للممارسة القياسية. قسم المخ ومباين الضرورة لتحديد موقع التشريحي للتسجيل الجلوسه. مباين الأنسجة لالسيتوكروم أوكسيديز التفاعل وفقا ل14. بدلا من ذلك، التعرف على الودائع شيكاغو السماء الزرقاء باستخدام المجهر مضان.
ملاحظة: لتفرق بدقة بين وحدات مختلفة وصفت من المهم أن يتم إجراء كافة العلامات مع نفس ماصة في اليوم نفسه، دون unclamping ماصة بين العلامات. في هذه الحالة يمكن التفريق بين مواقع التسجيل عن طريق المواقع النسبية في الأنسجة بعد خاصة مع إحداثيات تتلاعب أشار كل موقع (راجع الخطوة 3.9). لتحديد لا لبس فيه، بمناسبة التسميات لا يقل عن 200 ميكرون وبصرف النظر عن بعضها البعض، وليس أكثر من 3-5 تسميات لكل منطقة في الدماغ. - نعلق لوحة الرأس زجرية على الفئران على قطعة المقابل على رقصة. للقيام بذلك، أولا يعلقون لوحة وجها لضبط النفس في المكان، ثم ثبته باستخدام 4-40 المسمار. مما لا شك فيه أن تنتظر حتى الحيوان هو الهدوء من أجل تجنب تطبيق عزم الدوران المفرط في الرأس. وبعد ذلك، وضع الجوز 8-32 على الترباس تقييد الرأس الذي هو مزروع على الفئران. ثم المسمار في الخيوط قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ لرئيس الترباس. يضعوا قضيب إلى رقصة التجريبية في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن شددت في مكان (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الوحدات العصبية في بطني الخلفي وسطي (VPM) المهاد ترميز مرحلة حركة شعرة أنفية أثناء المولدة ذاتيا الخفق 15،16. ويبين الشكل 7A عينة النشاط ارتفاعه وحدة المهادية VPM كما الفئران والخفق بنشاط. ويبين الشكل 7B الرسم البياني للارتفاع مرات محاذاة إلى المرحلة حظية من شعرة أنفية حركة 17. وهناك المزيد من المسامير خلال مرحلة التراجع من الخفقان. بعد التسجيل، وصفت موقع وحدة عبر الرحلان الشاردي شيكاغو السماء الصبغة الزرقاء، كما هو مبين في الشكل 7C. وcounterstained الأنسجة للنشاط السيتوكروم أوكسيديز للكشف عن الحدود تشريحي عصبي من VPM المهاد. تم تطبيق نسخة مماثلة من هذا البروتوكول مؤخرا لمراقبة المتعلقة الخفقان-نشاط الخلايا العصبية المتعددة الوحدات (10-20 ميكرون نصائح قطرها ماصة) في نوى الدماغ محددة 18.
إعادة 1 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51453 / 51453fig1.jpg "/>
الشكل 1: القماش الزجرية جورب (A) صورة لجورب الفئران مع الأشرطة والمشابك الرباط. يتم وضع نهاية صغيرة بشكل مريح حول القص، ونهاية كبيرة حول الذيل. (ب) نمط تصميم للجورب في لوحة 1A. أبعاد هي في بوصة.
الشكل 2: التصميم الميكانيكي من جهاز مساند الرأس (A) تصميم ميكانيكي لوحة ضبط النفس رئيس الدقة بالنسبة للفئران. أبعاد هي في بوصة. (ب) تصميم ميكانيكي من شريط مساند الرأس للاستخدام مع لوحة في لوحة 2A. يتطلب بروتوكول اثنين من هذه الأجزاء، التي شنت باستخدام المشابك الزاوية اليمنى الزاوية في زاوية الملعب نفسه._blank "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الإجراء الجراحي (A) الجرذ في إطار عقد التجسيمي (بروتوكول خطوة 2.4). (ب) موقع الجراحية مع مسامير زرع وعلامات الجمجمة (بروتوكول خطوة 2.10). (C) الموقع الجراحي مع حج القحف (بروتوكول خطوة 2.12). (D) الموقع الجراحي مع غرفة تسجيل (بروتوكول خطوة 2.14). (E) موقع الجراحية مع السلك المرجعية وهلام السيليكون (بروتوكول خطوة 2.17). (F، G) الموقع الجراحي مع لوحة الرأس ضبط النفس وشريط الذي عقد في مكان (بروتوكول خطوة 2.20). (H) الموقع الجراحي في مع لوحة وشريط رسخ في مكان (بروتوكول خطوة 2.21). (I) النهائي الرأس ضبط النفس وتسجيل impl الغرفةالنمل (بروتوكول خطوة 2.24). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: رقصة التجريبية مخطط من الفئران في رقصة الميكانيكية للتجارب الرصد الكهربية والسلوكية (بروتوكول الخطوات 3،5-3،6). رقصة تستخدم شريط وصفيحة في الشكل 2.
الشكل 5: ممص مكروى البناء القطب (A) صورة مجهرية من ممص مكروى دون انقطاع (بروتوكول خطوة 3.1). شريط النطاق هو كما في لوحة C. (B) صورة مجهرية من micropipette دون انقطاع وكتلة الزجاج تحت المجهر (بروتوكول خطوة 3.2).ويمكن رؤية انعكاس طرف في الزجاج. شريط النطاق هو كما في لوحة C. (C) صورة مجهرية من micropipette كسر (بروتوكول خطوة 3.3). (D) صورة مجهرية من غيض من micropipette متواصلة في المنطقة محاصر في لوحة شريط A. مقياس هي كما في لوحة E. (E) صورة مجهرية من غيض من micropipette كسر في المنطقة محاصر في لوحة C. الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: معدات للتبديل بين مكبر للصوت ومصدر الحالي (A) الإعداد للتبديل يؤدي من مكبر للصوت لمصدر في الوقت الراهن عن طريق التتابع المغناطيسي (اختياري). لوحة الدوائر المطبوعة التي تحتوي على التبديل التتابع التي تسيطر عليها الجهد هو اتاك[هد] إلى مرحلة رئيس مكبر للصوت. (ب) تخطيط لوحة الدوائر المطبوعة في لوحة 6A. مجلس يربط يؤدي مكبر للصوت ومصدر في الوقت الراهن يؤدي إلى دبابيس مدخلات من التتابع، والقطب يؤدي إلى دبابيس الإخراج. يتم توصيل القطب إما إلى مصدر في الوقت الراهن أو مكبر للصوت من خلال تطبيق إما 0 أو 5 V إلى دبابيس تحكم التتابع. رأي السفلي. أبعاد هي في بوصة. (C) أعلى نظرا للتخطيط لوحة في لوحة 6B. يتطلب (D) الإعداد لتبديل يؤدي من مكبر للصوت لمصدر في الوقت الراهن يدويا (اختياري) وحامل ماصة مفتوح ومرن سلك الرصاص مثل تلك التي تظهر (انظر أيضا: قسم المعدات). هذا النهج هو بديل للدائرة تتابع في لوحات 6A-C. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: الإعداد التجريبية ونتائج ممثلة (A) المسامير وحركة شعرة أنفية من وحدة واحدة (بروتوكول خطوة 3.12). (B1) تطبيع شعرة أنفية موقف مقابل مرحلة في دورة خفقت. وتطبيع كل خفقت هذا أن معظم موقف الذيلية خلال خفقت يعرف باسم الصفر، والموقف الأكثر منقاري تعريف واحد. يمثل مسار الموقف تطبيع مقابل مرحلة لحظية في دورة خفقت 17. يتم فرضه كل يخفق التي تم تحديدها. (B2) النقطية للمرحلة في دورة خفقت التي تحدث طفرات. كل محاكمة على المحور الرأسي يمثل خفقت واحد. (B3) الرسم البياني لمعدلات ارتفاع فيما يتعلق خفقت مرحلة دورة لنفس الوحدة. (C1) الموقع شيكاغو السماء الزرقاء صبغ مع السيتوكروم أوكسيديز counterstaining (بروتوكول الخطوات 3،13-3،14). (C2 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بناء رقصة التجريبية
تم حذف وصف الأجزاء الميكانيكية المستخدمة لبناء رقصة التجريبية (الشكل 4) من البروتوكول، كما أنه يمكن بناؤها في مجموعة متنوعة من الطرق. في هذا المعيار مظاهرة تستخدم البصريات الميكانيكية أجزاء والمشابك دعم لتركيب شريط الرأس ضبط النفس وضبط النفس أنبوب الجسم (انظر قسم المواد). أجزاء مماثلة البصريات الميكانيكية يمكن أن تستخدم لتركيب حامل الكهربائي إلى مياداة مجهرية الآلية. من المهم أن شريط مساند الرأس على رقصة هي التي شنت في زاوية الملعب نفس شريط تستخدم لزرع صفيحة الرأس ضبط النفس أثناء الجراحة. إذا كان القطب هو أن ينتقل على طول محاور التجسيمي القياسية، ثم محور س من القطب يجب أن تتحرك بالتوازي مع شريط الرأس ضبط النفس، وض محور عمودي على الطائرة التي تحتوي على امدا وbregma وموازية على الأرض ( أنواع مكبرات الصوت المناسبة والمصادر الحالية وهناك مجموعة متنوعة من مكبرات الصوت التجارية والمصادر الحالية التي يمكن استخدامها لهذه التجربة. معظم مكبرات الصوت الكهربية خارج الخلية والخلايا مع وضع المشبك الحالي التي تحقق مكاسب الكلي لل1،000X مناسبة. لالرحلان الشاردي شيكاغو السماء الزرقاء مع ماصات 1-3 ميكرون، وهي مصدر في الوقت الراهن التي يمكن أن توفر ما يصل إلى 10 أمبير مع قرار من لا يقل عن 1 أمبير والامتثال من 100 V على الأقل يوصى. لاحظ أن بعض مكبرات الصوت التجارية لها الاقتضاء المدمج في المصادر الحالية (انظر أجزاء بديلة في قسم المواد). ومع ذلك، للتحايل على شرط مكبر للصوت مجتمعة / مصدر في الوقت الراهن المناسب، يمكن أن تعلق الدائرة تتابع المغناطيسية إلى الواجهة الأمامية للheadstage مكبر للصوت (الشكل 6A - C)، ومثل هذه الدائرة هي سptional لكنه يسمح للمجرب للتبديل بين مكبر للصوت ومصدر الحالي منفصل لتقديم البقول الرحلان الشاردي دون تكدير جسديا القطب. نهج بديل هو استبدال الأسلاك الكهربائي الرصاص يدويا مع تلك التي تتصل مصدر في الوقت الراهن. في هذه الحالة، فمن الأفضل لاستخدام حامل ماصة التي لا إحاطة أعلى (النهاية دون انقطاع) من ماصة، واستخدام مرن سلك الرصاص (الشكل 6D). الخطوات التي قد تتطلب الممارسة المتكررة هناك العديد من الخطوات التي قد تتطلب الممارسة لإتقان. الخطوة التي تتطلب معظم البراعة هي كسر غيض من ماصة. ومن المفيد أن ترسم حافة كتلة الزجاج لتصور انعكاس لطرف في الزجاج. ثم واحدة يمكن أن تقدم ببطء كتلة وماصة حتى غيض بالكاد يلبي انعكاسه. تقدم ماصة أو كتلة سريع جدا يمكن تحطيم ممص مكروى وجعل قطر الحافة تأ جداالبريد أو متفاوتة. ونحن نوصي باستخدام بال micropipettes مصنوعة من الكوارتز، كما هو موضح في البروتوكول. ليترات بال micropipettes تخترق بشكل فعال الجافية الفئران سليمة في craniotomies استعداد مزمن دون الانحناء أو كسر. هذا يلغي الحاجة إلى استئصال الجافية، والتي يمكن أن تسبب مضاعفات إضافية. بال micropipettes البورسليكات مع التناقص التدريجي قصيرة (<5 ملم) أيضا اختراق الجافية، ولكن استخدامها يقتصر على تسجيل من الهياكل سطحية مثل قشرة الدماغ أو الجسم المخطط. تسجيل من الهياكل أعمق، ولا سيما في المهاد أو جذع الدماغ، ويتطلب مدبب، ويفضل بال micropipettes الكوارتز طويلة. والخطوة الثانية التي تتطلب الممارسة وتحديد المواقع ماصة في تكوين juxtacellular. يمكن تحريك ماصة بسرعة كبيرة جدا عندما يكون قريبا إلى خلية تمزق الغشاء. ولذلك، فإنه من المفيد لمراقبة مقاومة ماصة لمعرفة متى طرف قريب من الخلية المفترضة. التغيرات في مقاومة الغشاء على الأقل 2 أضعاف تشير إلى أن القطب قد يكون من شمال شرقع أو لمس غشاء الخلية. المخاطر المشتركة هناك العديد من المخاطر الشائعة أن نضع في الاعتبار. أولا، لأن طرف ماصة هو بالضرورة قريبة جدا من الخلية، فمن الممكن أن "فقدان" الخلية إذا ماصة الانجرافات بعيدا عن الغشاء. ومن الممكن أيضا لخلية لتصبح المهتاج أو تمزق في منتصف الطريق من خلال التسجيل. إذا كان كذلك، عرض وارتفاع معدل إطلاق النار قد يزيد والسعة ارتفاع قد ينخفض. وهذه هي مؤشرات على أن الخلية قد تكون غير صحية. وحركة الحيوان يسبب حتما هذه الأحداث أن يحدث في بعض نسبة من التسجيلات، ولكن يمكن التقليل من وجود هذا الحيوان الذي تعود بشكل جيد وتجنب اتخاذ غير الضرورية، سمع أصواتا عالية مفاجئة أو التسبب في الاهتزازات التي باغت الحيوان. تعديلات محتملة للبروتوكول ومن الممكن استخدام هذا التسجيل ووضع العلامات التقنية في السياقات التي يكون الحيوانأداء مجموعة متنوعة من المهام السلوكية. التدريب لمهمة السلوكية معينة يمكن أن يتم في أعقاب عملية جراحية ولكن قبل البدء في تسجيل. نشاط الخلايا العصبية يمكن تسجيلها 1-2 أسابيع على الأقل بعد إعداد حج القحف، ويمكن أن البقع iontophoretic آخر لمدة 2-3 أيام على الأقل. يسمح هذا الإطار الزمني مجموعة متنوعة من التلاعب التجريبية، بما في ذلك تسجيل من مناطق الدماغ متعددة خلال جلسات تسجيل منفصلة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذه التقنية لملء الخلايا العصبية الفردية التي تصنع منها التسجيلات. هذه استراتيجية بديلة لوضع العلامات juxtacellular من الخلايا العصبية واحدة تتطلب الاستقرار الميكانيكية التي يتحقق فقط عندما يكون الحيوان لا يزال أو تخدير. لهذه الاستراتيجية ووضع العلامات، ويوصى استخدام BDA على Neurobiotin. لا تتحلل BDA التي كتبها البروتياز، مما يزيد بشكل كبير من معدل النجاح على Neurobiotin. يجب أن يكون حاول وضع العلامات خلال تسجيل الدورة الأخيرة قبل perfusing للالحيوانات. ملاحظة وقد وصفت ذلك وصفا تفصيليا للبروتوكول juxtacellular سابقا 6،19. بينما تقنية واستخدمت بنجاح في الفئران التنبيه 8، في منطقتنا حقن تجربة iontophoretic شيكاغو السماء الزرقاء لديها عائد أعلى بكثير. لاحظ أن كلا شيكاغو السماء الزرقاء وNeurobiotin أو BDA وضع العلامات يمكن أن يتم في نفس الحيوان. ومن المرجح أن تكون مناسبة لمجموعة متنوعة من أنواع هذه التقنية. لاحظ أن التسجيلات juxtacellular بذلت في المناطق القشرية من الفئران في حالة تأهب 9، على سبيل المثال. في حين أن التدريب، والمناولة، وجها لضبط النفس وأنواع معينة، يجب على تقنيات معينة لرصد ووضع العلامات الموصوفة في هذا البروتوكول لا تزال هي نفسها. وأخيرا، وذلك ببساطة عن طريق تغيير حجم رأس ماصة والمعلمات من البقول الحالية يمكن استخدام هذه التقنية للحقن iontophoretic من مجموعة متنوعة من الجزيئات، بما في ذلك وكلاء الدوائية 20،21. وبالتالي فإنتقنية يمكن أن تكون مفيدة للدراسات neuropharmacological التي تنطوي على الحيوانات تتصرف أيضا. الاستنتاجات وهذه هي الحالة التي مناطق الدماغ التي هي قريبة جدا معا يمكن أن يكون لها خصائص و / أو وظائف 22 مختلفة بشكل ملحوظ في كثير من الأحيان. في مثل هذه الحالات، فيما نشاط الخلايا العصبية واحدة من مناطق محددة تشريحيا إلى السلوك العضوي أمر بالغ الأهمية لفهم الدوائر العصبية والحساب. وتوضح هذه المادة على بروتوكول لتحقيق ذلك باستخدام مزيج من التقنيات القياسية ويصف الترميز الحسي في VPM الخلايا العصبية المهادية كمثال على ذلك. ومن المرجح أن تكون ذات صلة وممكنا في مجموعة متنوعة من مناطق الدماغ والنماذج السلوكية في نماذج حيوانية مختلفة هذه التقنية. أنه يحتوي على نسبة نجاح أعلى بكثير من خلية واحدة وضع العلامات juxtacellular في الحيوانات تنبيه 6،8، ولها ميزة أفضل قرار التشريحية على التقنيات التي تستخدم متعددة ايلىصفائف ctrode أو ميكرودريفيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , Springer. 197-236 (2006).
- Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fsubstances.html Forthcoming.
- Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: http://kationscientific.com/fdyes.html Forthcoming.
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
