Introduction
Überwachung der neuronalen Aktivität in einem Alert Tier aktiv an einer Verhaltensaufgabe engagiert ist entscheidend für das Verständnis der Funktion und Organisation des Nervensystems. Die extrazelluläre Aufnahme der elektrischen Aktivität von einzelnen neuronalen Einheiten ist seit langem ein Grundnahrungsmittel Werkzeug für Systemische Neurowissenschaften und ist immer noch weit verbreitet in Gebrauch heute. Eine Vielzahl von Elektrodentypen und Konfigurationen sind abhängig von den wissenschaftlichen und technischen Anforderungen einer bestimmten Experiment. Chronisch implantierten Microdrives oder Elektroden-Arrays werden häufig in sich frei bewegenden Tieren, darunter Vögel, Nagetiere und Primaten 1-4 verwendet. Alternativ werden akuten Durch mit Metall- oder Glasmikroelektroden über einen externen Mikromanipulator oft verwendet, um von narkotisierten oder Kopf-zurückhaltende Tiere aufnehmen. Glasmikroelektroden haben den Vorteil, dass sie in der juxtacellular oder verwendet werden "Zelle angebracht" Konfiguration eindeutig zu isolierenAktivität einzelner Nervenzellen, ohne die Komplikationen der Post-hoc-Spike-Sortier 5. Diese Elektroden weiter erlauben die Aufnahme von anatomisch-identifizierten Zellen oder Standorte, wie sie verwendet werden, um kleine Ablagerungen von Farbstoff oder neuroanatomische Tracer injizieren oder sogar zum Ausfüllen der einzelnen Zelle aufgezeichnet werden. Diese Konfiguration wurde erfolgreich bei Ratten, Mäusen und Vögeln 6-10 angelegt. Die hier beschriebene Technik konzentriert sich auf juxtacellular Überwachung und extrazelluläre Farbstoffablagerungen in Alarm, Kopf-zurückhaltende Ratten. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu Einzelzell juxtacellular füllt diese Farbstoffablagerungen bieten keine Informationen über die Zellmorphologie oder axonalen Projektionen 11, aber sie exakte anatomische Lokalisation auf ca. 50 & mgr; m zu ermöglichen und, entscheidend, eine deutlich höhere Ausbeute bei der Benachrichtigung Tiere. Informationen zur Einzelzell juxtacellular füllt wird dennoch als eine alternative Strategie für anatomische Kennzeichnung versehen.
Kurz gesagt, dieProtokoll besteht aus drei Hauptphasen. In der ersten Phase wird die Ratte Körperhaltung in einem Tuch Socke (Figur 1) über einen Zeitraum von 6 Tagen akklimatisieren. In der zweiten Phase wird eine Kopfrückhaltevorrichtung (Abbildung 2) und Aufnahmekammer chirurgisch implantiert, so dass die Ratten in der stereotaktischen Flugzeug bei mehreren nachfolgenden Aufnahmen (Abbildung 3) gehalten werden; Dieses Verfahren ermöglicht es dem Experimentator insbesondere subkortikalen Regionen des Gehirns, die für elektrophysiologische Untersuchung Ziel basierend auf Standardreferenzkoordinaten 12. Die dritte Phase umfaßt das Anordnen der Ratte in einer entsprechenden Spannvorrichtung für die Durchführung der Verhaltens- und elektrophysiologischen Experimenten (Figur 4), die Konstruktion der Elektrode von einem Quarz Kapillarrohr (5), so dass juxtacellular neuronalen Aufnahmen, eindeutig einzelnen Betriebseinheiten 6-9 zu isolieren, und Markieren der anatomischen locatian der Aufzeichnungsstelle mit Chicago Sky Blue Farbstoff (6 und 7). Die Aufnahmen werden bei gleichzeitiger Verhaltensüberwachung durchgeführt; jedoch werden die technischen Einzelheiten des Verhaltens auf den wissenschaftlichen Ziele jedes Experiments abhängt und damit über den Umfang eines einzelnen Protokolls. Nach Beendigung der Versuchsdurchführung, die an mehreren Tagen wiederholt werden kann, wird das Tier getötet. Das Gehirn ist nach Norm neuroanatomische Methoden entweder mit Hellfeld-Fluoreszenzmikroskopie oder extrahiert und verarbeitet.
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Protocol
(- 350 g 250) in Übereinstimmung mit staatlich vorgeschriebene Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Kalifornien San Diego genehmigten Versuchsprotokolle wurden an weiblichen Long-Evans-Ratten durchgeführt.
1. acclimating den Rat zur Körperrückhalte
HINWEIS: Setzen Sie die Ratte auf einer eingeschränkten Diät. Führen Sie die Ratte einmal am Tag unmittelbar nach jedem täglichen Umgang Sitzung, um die Ratte auf die Zurückhaltung (siehe unten) zu akklimatisieren. Geben Sie genug Futter, um das Tier bei 80% des Ausgangsgewicht zu halten. Diese Menge ist ungefähr 6 Gramm Futter pro Tag für einen 250 g weibliche Long Evans Ratten.
- Akklimatisieren die Ratte, die von den Menschen behandelt werden. Zurückhalten vorsichtig die Ratte mit der Hand für einen Zeitraum von ca. 5 s alle 30 sec. Tun Sie dies für 15 Minuten ein Tag, an 2 aufeinander folgenden Tagen. Überwachen Sie die Ratten täglich auf Anzeichen von Stress während der Ausbildungszeit. Symptome sind kämpfen in Reaktion auf Zurückhaltung, Stimmgebung und zahn Rattern.
- Am 3. Tag, legen Sie die Ratte in einem Körper-beschränke Stofffutteral (Bild 1) für 15 Minuten pro Tag an zwei aufeinander folgenden Tagen.
- Am 5. Tag, legen Sie die Ratte in der Socke, und legen Sie die Socke in einem starren Rohr auf der Versuchsvorrichtung (Abbildung 4). Verlassen Sie die Ratte in der Röhre für 15 Minuten ein Tag, an 2 aufeinander folgenden Tagen.
- Feed the rat unmittelbar nach jeder Trainingseinheit. Am Ende der letzten Sitzung (6. Tag) erhalten freien Zugang zu Nahrung. Wählen Sie für die Implantation nur die Ratten, die keine Zeichen einer übermäßigen Betonung auf der letzten Trainingstag zeigen müssen.
Hinweis: Obwohl Auswahl von Ratten implantiert ist subjektiv, in der Hand über 90% der Ratten gefunden wurden, die auf die Gewöhnung und fähig Implantation sein.
2. Implantation des Aufnahmekammer und Kopfstützenmechanismus
- Machen Sie eine WiederKonferenz Draht durch Löten blanken Edelstahldraht mit einem Pin-Anschluss. Schneiden Sie den Draht, so dass 3-5 mm verbleibt durch den Stift aufgedeckt. Autoklavieren den Referenzdraht, zusammen mit allen chirurgischen Instrumenten.
- Verwalten Ketamin / Xylazin Anästhesie. Verabreichen 95 mg / kg Ketamin mit 5 mg / kg Xylazin intraperitoneal gemischt. Die Anfangsdosis dauert 1 ½ bis 2 Stunden. Ergänzen Sie die Betäubung jedes 30-45 Minuten danach, je nach Bedarf. Augen des Tieres Schmieren mit einer Augensalbe.
- Überprüfen Sie die Zehen Rückzug Reflex auf die Ebene der Anästhesie zu bestimmen und Aufrechterhaltung einer Narkose wie nötig.
- Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Halterahmen mit Ohr Bars (3A). Rasieren Sie die Haare auf dem Kopf und desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod (10% ige Lösung). Darauf achten, dass die Ohr Bars angemessen einzusetzen, so dass sie nicht das Trommelfell beschädigen. Ear-Bars mit stumpfen Spitzen sind zu bevorzugen.
- Einen Einschnitt mit einem Skalpell Angleirungsweise entlang der Mittellinie des Schädels vom rostro-kaudale Ebene der Augen nach hinten von den Ohren. Mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie eine 2-3 mm Hautstreifen auf beiden Seiten des Einschnitts.
- Kratzen Sie die Knochenhaut, um die Oberfläche des Schädels aus, um den seitlichen Rillen schützen. Decken Sie die freiliegende Schädel mit dünnen Sekundenkleber.
- Bohren Sie ein kleines Loch, mit einem etwas kleineren Durchmesser als 0-80 Schrauben, mit einem Bohrer Grat ½ mm Durchmesser (siehe Materialien Abschnitt). Bohren Sie das Loch unmittelbar posterior, wo der Bregma Naht trifft die seitliche Kante, und in einem 30-45 ° -Winkel in den Schädel, so dass die Schraube mit dem oberen Seiten mehr als den Grund zu gehen in.
- Schrauben Sie in einem 0-80 Flachboden-Maschinenschraube in das Loch (ca. 3 Umdrehungen), bei 30 bis 45 ° -Winkel. Darauf achten, dass Schrauben in zu tief, um eine Beschädigung der darunter liegenden Hirngewebe.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für 6 zusätzliche Schrauben in der Konfiguration gezeigt
- Legen Sie eine Spritzennadel in der stereotax Manipulator. Messen Sie von der Bregma Naht und eine Delle in den Schädel mit der Nadel in der Nähe, aber außerhalb des gewünschten Kraniotomie Lage als Referenzmarke.
HINWEIS: In dieser Demonstration, die stereotaktischen Koordinaten der Marke sind 3 mm posterior und 1 mm lateral zum Bregma Naht. - Markieren Sie die Delle mit einem wasserfesten Stift. Beachten Sie die stereotaktischen Koordinaten der Marke, da sie als stereotaktischen Referenzpunkt dienen (3B).
- Einen Kraniotomie auf den gewünschten Koordinaten (3 mm posterior und 3 mm lateral zum Bregma in diesem Beispiel) zentriert ist. Verlassen Sie die Dura mater intakt. Decken die Kraniotomie mit modifizierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (125 mM NaCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM MgCl 2, pH 7,4), 13 (3C). Schneiden Sie ein 0,2 ml-Zentrifugenröhrchen, um 4 - 5 mm in der Länge, und schneiden Sie die Kappe. Das Röhrchen wird auf dem Schädel und zentrieren es über die Kraniotomie.
- Anwenden Zahnzement auf der Unterseite des Rohres, um den Boden des Rohres zum Schädel abzudichten. Achten Sie darauf, Zement in die freigelegte Schädel (3D) auslaufen.
- Bohren Sie ein anderes kleines Loch (ca. ½ mm Durchmesser) in der Gegenschädelplatte und sorgfältig legen Sie die Referenzdraht. Konstruieren Sie die Referenzdraht durch Löten einen Stift, der mit dem Aufzeichnungsverstärker bis zum Ende des Drahtschnittstellen (siehe Ausstattung Abschnitt). Den Referenzdraht nicht bewegen, sobald es im Gehirn, da dies zu Schäden.
- Sekundenkleber auf das Loch, in dem der Draht eingeführt wird. Dadurch wird der Bolzen und Draht anstelle vorübergehend zu versiegeln.
- Man vermischt die beiden Teile des Silikongels Kit (siehe Materialien Abschnitt) in etwa gleichen Teilen. Warten Sie zwei Minuten Mischen und fill die Zentrifugenröhrchen etwa ⅓ voll mit Gel.
- Befestigen Sie einen rechten Winkel Stützenklemme (siehe Materialien Abschnitt) an der Kopfstütze bar. Befestigen der Kopfplatte (2A) auf die Halteleiste (2B) in einem 45 ° Anstellwinkel so dass die Unterseite der Platte in Richtung auf die Nase des Tieres. Es ist hilfreich, einen Neigungsmesser zu verwenden, um den Neigungswinkel eingestellt, dass der Versuchsvorrichtung (Abbildung 4) entsprechen.
- Befestigen Sie die Haltestange an die stereotax Manipulatorarm so dass die Stange parallel zu den Ohr Bars ist. Senken Sie die Bar und Platte, so dass die Platte posterior der Lambdanaht und anterior der Schwanz äußersten Schraube.
- Ziehen Sie die vordere Kopfschraube (eine 8-32 Bolzen oder Schrauben, siehe Materialien Abschnitt) bei ca. 45 ° Winkel mit einer helfenden Hände Arm und Klemme, so dass der Kopf der Schraube nach unten zeigt und in Richtung der Schwanz des Tieres. Senken Sie die Schraube, so dass es die Ameise berührterior 0-80 Schrauben (3F, G).
- Sichern Sie die Schraube und Platte an Ort und Stelle mit Zahn Acryl. Anwenden Dentalacryl um die Knochenschraubenköpfe Referenzstift, und um die Seiten des Zentrifugenrohrs. Warten Sie ca. 10 Minuten für die Dentalacryl trocknen (3H).
- Eine Schicht Zahnzement an den Rändern des Zahn Acryl-, Zementieren der Haut an das Implantat. Warten Sie, bis der Zement trocknet.
- Poke mehrere Löcher in der Kappe des Zentrifugenröhrchens, und setzen Sie die Kappe auf dem Rohr.
- Entfernen Sie die helfenden Hände Klammer. Dann entfernen Sie vorsichtig den Kopf-Haltestange aus dem stereotax und entfernen Kopfplatte von der Bar (3I).
- Nehmen Sie das Tier von der stereotax und zu verwalten, postoperative Pflege und Überwachung im Einklang mit allen geltenden Vorschriften, Bestimmungen und Gesetze (zB Buprenorphin 0,02 mg / kg, jede 8-12 Stunden für mindestens 24h). Wenn Entzündung entwickelt sich um die Kanten des Implantats, eine dünne Schicht von antibiotischen Salbe auf die betroffene Stelle täglich bis gelöst.
3. Juxtacellular Überwachung der neuronalen Einheiten
- Ziehen Quarzkapillare Schlauch auf einem Kohlendioxid-Laser-Mikropipettenzieher (siehe Ausstattungsteil) mit Spitzendurchmessern von weniger als 1 um (5A).
Hinweis: Die Heizungsparameter entsprechend der jeweiligen Instrument variieren, und dass die erforderliche Halsdurchmesser ist abhängig von der Struktur des Gehirns von Interesse variieren. Für Aufnahmen in Ratten Thalamus, haben Mikro Hälse von 5-7 mm. - Sichern Sie die Pipette an Ort und Stelle unter einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskop mit großem Arbeitsabstand Ziele ausgestattet. Verwenden Knetmasse, um die Pipette an Ort und Stelle auf der Bühne des Mikroskops zu halten.
- Bewegen Sie einen Glasblock (0,5-1 cm stark; ein Stück Glas für mak verwendeting ultra Mikrotommessern ist praktisch) in das Sichtfeld mit der Pipettenspitze. Mit der Bühne Mikromanipulator, sanft berühren die Pipettenspitze auf das Glas, wodurch es zu brechen. Bei Bedarf wiederholen, bis die Pipettenspitze Außendurchmesser beträgt zwischen 1-3 um (5B, C). Stellen Sie sicher, dass diese Mikropipetten haben Impedanzen zwischen etwa 5 bis 15 MOhm.
- Bereiten extrazellulären Salzlösung (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 mit NaOH) 8 und mit 2% (w / v) Chicago Sky Blue. Unter Verwendung einer Spritze mit einer 30 G-Nadel oder kleiner ist, füllen die Hinterende der Pipette mit der Lösung. Alternativ können für einzelne Zelle juxtacellular Kennzeichnung mit 2% (w / v) Neurobiotin oder biotinylierte Dextran Amin (BDA-3000 oder BDA-10000) mit der Kochsalzlösung anstelle von Chicago Sky Blue.
- Legen Sie die Ratte in der Tuch Socke innerhalb des starren Rohr auf einem geeigneten Versuchs jig (
- Befestigen Sie die Kopfhalteplatte an der Ratte mit dem entsprechenden Teil an der Vorrichtung. Dazu stecken Sie die erste Kopfstützenplatte an Ort und Stelle, und befestigen Sie es mit einem 4-40 Schraube dann. Achten Sie darauf, warten Sie, bis das Tier ruhig, um zu vermeiden übermäßigen Drehmoments auf den Kopf. Als nächstes legen eine 8-32 Mutter an der Kopfrückhaltebolzen, die an der Ratte implantiert wird. Schrauben Sie dann in einer Gewindeedelstahlstange auf den Kopf-Schraube. Das Anbringen der Stange mit dem experimentellen Einspannvorrichtung derart, dass sie an Ort und Stelle angezogen werden (Figur 4).
HINWEIS: Die Sicherung der Tier mit Kopf-Schraube sowie der Kopfstütze Platte minimizes Biegen der Vorrichtung und verbessert die Aufzeichnungsstabilität. In den meisten Fällen kann die Aufnahme am ersten Tag beginnen das Tier Kopf-verhalten. Allerdings, wenn das Tier zappelt mäßig oder vokalisiert, liefern einen Tag Kopfstütze Gewöhnungstraining vor Beginn von Aufnahmen. In diesem Fall lassen Sie das Tier auf der Spannvorrichtung für 15 Minuten und setzen Sie ihn wieder in seinem Käfig dann. Wiederholen Sie diesen Schritt am nächsten Tag und mit dem Protokoll.- Öffnen Sie die Aufnahmekammer und entfernen Sie das Silikon-Gel. Reinigen Sie die Kraniotomie mit feinen Pinzette, wenn Gewebe in der Kraniotomie erneut gewachsen.
- Befestigen Sie die Pipette auf die motorisierten Mikromanipulator, und stecken Sie den heads Vorverstärker.
HINWEIS: In der vorliegenden Demonstration wird eine kleine Relaisschaltung auf der heads verwendet, um zwischen den Verstärkerleitungsdrähten und einer externen Stromquelle mit hoher Compliance (6A-C) zu wechseln. Beachten Sie, dass einige Verstärker eine entsprechende integrierte Hoch Einhaltung Quelle haben(Siehe Diskussion und Materialien Abschnitte).- Verwenden Sie den motorisierten Mikromanipulator, um die Spitze der Pipette auf die stereotaktisch identifiziert Zeichen in der Aufnahmekammer zu bewegen. Beachten Sie die Koordinaten des Standortes. Achten Sie darauf, die Spitze der Pipette auf den Schädel zu brechen.
- Bewegen Sie die Pipette auf die gewünschte Aufzeichnungsstelle in der anterior-posterioren und medio-lateralen Achsen. Dann voran die Pipette ventral durch die Dura, bis es etwa 500 & mgr; m Rücken zu der vorgesehenen Aufzeichnungs Lage.
- Langsam voran die Pipette beim Hören zum Aufstocken Ereignisse auf einer Audio-Monitor der verstärkten Spannung zwischen der Pipettenspitze und der Referenzdraht erfasst. Sobald Spick Ereignisse festgestellt werden, weiterhin die Pipette 0-100 & mgr; m bis positive Spannung Biegungen von mehr als etwa 500 & mgr; V eingehalten werden zu bewegen.
HINWEIS: Die Elektrodenwiderstand um einen Faktor von etwa 1,5-10 wh erhöhenen dies geschieht.- Beginnen Sie die Aufnahme, sobald ein Gerät wie gemäß Schritt 3.11, zusammen mit allen anderen Verhaltens- und physiologische Messungen von Interesse isoliert. In der vorliegenden Demonstration werden selbst erzeugte vibrissa Bewegungen mit hoher Geschwindigkeit Videografie überwacht (siehe Materialien Abschnitt).
- Um die Aufnahme vor Ort zu kennzeichnen, schalten Sie die Elektrode führt zu einer mit der Stromquelle verbinden. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu tun, entweder mit einer Relaisschaltung (6A - C), eine eingebaute Stromquelle des Verstärkers, oder manuell (6D, siehe Schritt 3.8 und Diskussion). Geben -4 uA mit 2 sec Impulse bei 50% Einschaltdauer für 4 Minuten iontophoretisch injizieren Chicago Sky Blue durch die Pipette.
- Töte und versorgen die Tier nach mehreren Markierungsverfahren nach den üblichen Richtlinien. Abschnitt des Gehirns und Gegenfärbemittel wie nötig, um zu identifizieren die anatomische Lage des Aufzeichnungs sitzene. Gegenfärbung des Gewebes für Cytochromoxidase Reaktivität nach 14. Alternativ identifizieren die Chicago Sky Blue Ablagerungen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
HINWEIS: Um zwischen verschiedenen markierten Einheiten genau zu unterscheiden, ist es wichtig, dass alle Etiketten werden mit der gleichen Pipette am selben Tag gemacht, ohne Lösen der Pipette zwischen Etiketten. In diesem Fall können die Aufnahme-Websites durch ihre relativen Positionen in Post-hoc-Histologie mit der erwähnten Manipulator Koordinaten jeder Seite unterschieden werden (siehe Schritt 3.9). Zur eindeutigen Identifizierung, markieren die Etiketten mindestens 200 & mgr; m voneinander entfernt, und nicht mehr als 3-5 Etiketten pro Hirnregion. - Befestigen Sie die Kopfhalteplatte an der Ratte mit dem entsprechenden Teil an der Vorrichtung. Dazu stecken Sie die erste Kopfstützenplatte an Ort und Stelle, und befestigen Sie es mit einem 4-40 Schraube dann. Achten Sie darauf, warten Sie, bis das Tier ruhig, um zu vermeiden übermäßigen Drehmoments auf den Kopf. Als nächstes legen eine 8-32 Mutter an der Kopfrückhaltebolzen, die an der Ratte implantiert wird. Schrauben Sie dann in einer Gewindeedelstahlstange auf den Kopf-Schraube. Das Anbringen der Stange mit dem experimentellen Einspannvorrichtung derart, dass sie an Ort und Stelle angezogen werden (Figur 4).
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Representative Results
Neuronal Einheiten in ventralen posterioren medialen (VPM) Thalamus codieren die Phase vibrissa Bewegung während selbsterzeugten wischend 15,16. 7A zeigt Probe Spikeaktivität eines VPM thalamic Einheit eine Ratte aktiv wischend. 7B zeigt ein Histogramm der Spike Zeiten zur Momentanphase vibrissa Bewegung 17 ausgerichtet ist. Es gibt mehr Spitzen während der Rückzugsphase der wischend. Nach der Aufzeichnung wurde die Position der Einheit mittels Iontophorese von Chicago Sky Blau-Farbstoff markiert, wie in 7C gezeigt. Das Gewebe wird für Cytochrom-Oxidase-Aktivität gegengefärbt, um die neuroanatomische Grenzen VPM Thalamus offenbaren. Eine ähnliche Version dieses Protokolls wurde kürzlich angewendet, um wischend bezogene Mehrfach neuronale Aktivität (10-20 um Durchmesser Pipettenspitzen) in bestimmten Hirnstammkerne 18 zu überwachen.
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Abbildung 1: Stoff einstweilige Socke (A) Fotographie eines Ratten Socke mit Kordelzug und Kordelzug Klammern.. Das kleine Ende wird fest um das Brustbein und dem großen Ende um den Schwanz platziert. (B) Design-Muster für die Socke in Platte 1A. Abmessungen in mm.
Abbildung 2: Mechanischer Aufbau des Kopfrückhaltevorrichtung (A) Mechanischer Aufbau eines Präzisionskopfstützenplatte für Ratten.. Abmessungen in mm. (B) Mechanische Ausführung einer Kopfstütze bar für die Verwendung mit der Platte in Platte 2A. Das Protokoll benötigt zwei dieser Teile, montiert mit rechtwinkligen Post Klemmen gleichzeitig Steigungswinkel._blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Operationsverfahren (A) Ratte in einem stereotaktischen Halterahmen (Protokoll Schritt 2.4).. (B) Chirurgische Website mit implantierten Schrauben und Schädel Markierungen (Protokoll Schritt 2.10). (C) Surgical Site mit einer Kraniotomie (Protokoll Schritt 2.12). (D) Chirurgische Website mit der Aufnahmekammer (Protokoll Schritt 2.14). (E) Chirurgische Website mit dem Referenzdraht und Silikon-Gel (Protokoll Schritt 2.17). (F, G) Chirurgische Website mit Kopfstütze Platte und eine Bar in Position gehalten (Protokoll Schritt 2.20). (H) OP-Standort mit Platte und Bar zementiert statt (Protokoll Schritt 2.21). (I) Schlusskopfstütze und Aufnahmekammer implant (Protokoll Schritt 2.24). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 4: Schematische Darstellung der Versuchs jig Ratte in der mechanischen Spannvorrichtung zur elektrophysiologischen und Verhaltensüberwachung Experimente (Protokoll die Schritte 3,5-3,6). Die Vorrichtung nutzt die Bar und Platte in Abbildung 2.
Abbildung 5: Mikropipette Elektrodenkonstruktion (A) Mikroskopische Aufnahme einer ununterbrochenen Mikropipette (Protokoll Schritt 3.1).. Maßstabsbalken ist wie in Panel C (B) Mikroskopische Aufnahme des ungebrochenen Mikropipette und Glasblock unter dem Mikroskop (Protokoll Schritt 3.2).Die Reflexion der Spitze kann im Glas zu sehen. Maßstabsbalken ist wie in Panel C (C) Mikroskopische Aufnahme des gebrochenen Mikropipette (Protokoll Schritt 3.3). (D) Mikroskopische Aufnahme der Spitze der Mikropipette ungebrochen in der boxed Region Abdeckung A Maßstabsleiste ist wie bei E. Tafel (E) Mikroskopische Aufnahme der Spitze des gebrochenen Mikropipette im boxed Region Panel C. Bitte klicken Sie hier, um sehen eine größere Version dieser Figur.
Abb. 6: Die Ausrüstung für das Umschalten zwischen den Verstärker und Stromquelle (A) einrichten, um die Leitungen vom Verstärker mit der Stromquelle über eine Magnetrelais (optional) zu wechseln. Eine Leiterplatte, die den spannungsgesteuerten Relaisschalter ist attached an den Verstärker Kopfstufe. (B) Layout für die Leiterplatte in Platte 6A. Die Platine verbindet die Verstärkerleitungen und der Stromquelle führt zu den Eingangs-Pins des Relais und die Elektrode führt zu den Ausgangsstiften. Die Elektrode ist entweder an die Stromquelle oder dem Verstärker durch Anwenden entweder 0 oder 5 V an die Relaissteuerstifte verbunden. Ansicht von unten. Abmessungen in mm. (C) Draufsicht auf die Leiterplatten-Layout in Tafel 6B. (D) Setup, um die Kabel vom Verstärker mit der Stromquelle manuell (optional) Schalter erfordert eine offene Pipettenhalter und flexible Schlauchleitung wie die gezeigt (siehe auch: Anlagen Abschnitt) diejenigen. Dieser Ansatz ist eine Alternative zu der Relaisschaltung in Platten 6A-C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 7: Versuchsaufbau und repräsentative Ergebnisse (A) Spikes und vibrissa Bewegung von einer Einheit (Protokoll Schritt 3.12).. (B1) Normalized vibrissa Position gegenüber Phase in der Schneebesen Zyklus. Jede Schneebesen wird normalisiert, so dass die meisten Schwanzposition während des Schneebesen als Null definiert, und die meisten rostral Position als einer definiert. Die Flugbahn die normierte Position gegenüber momentanen Phase in dem Schneebesen Zyklus 17. Alle identifizierten Schneebesen überlagert. (B2) Raster der Phase in dem Zyklus, in dem Quirl Spitzen auftreten. Jeder Versuch auf der vertikalen Achse repräsentiert ein einzelnes wischen. (B3) Histogramm der Spikeraten bezüglich Schneebesen Zyklusphase für das gleiche Gerät. (C1) Location of Chicago Sky Blue Farbstoff mit Cytochromoxidase Gegenfärbung (Protokoll Schritte 3,13-3,14). (C2 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Der Bau des experimentellen jig
Die Beschreibung der für die Versuchsvorrichtung (4) aufbauen mechanischen Teile von dem Protokoll weggelassen werden, da sie in einer Vielzahl von Arten aufgebaut werden. In dieser Demonstration Standard opto-mechanischen Teilen und Unterstützung Klammern werden verwendet, um die Kopfstütze Bar und die Körperhaltung Rohr (siehe Materialien Abschnitt) zu montieren. Ähnliche opto-mechanische Teile verwendet werden, um den Elektrodenhalter an die motorisierten Mikromanipulator zu montieren. Es ist wichtig, dass die Kopfstütze Bar auf der Spannvorrichtung auf der gleichen Neigungswinkel wie der Bar verwendet, um die Kopfstützenplatte während der Operation implantieren montiert. Wenn die Elektrode entlang dem stereotaktischen Achsen bewegt werden soll, dann wird die x-Achse der Elektrode sollte parallel zum Kopfstützenstange bewegen, und die z-Achse senkrecht zur Ebene, die Lambda und Bregma und parallel zum Boden ( Arten von geeigneten Verstärker und Stromquellen Es gibt eine Vielzahl von kommerziellen Verstärkern und Stromquellen, die für dieses Experiment verwendet werden können. Die meisten extra- und intrazellulären Elektro Verstärker mit einer Stromzange Modus, der eine Gesamtverstärkung von 1,000x erreichen sind angemessen. Für Iontophorese von Chicago Sky Blue mit 1-3 um Pipetten, eine Stromquelle, die bis zu 10 & mgr; A mit einer Auflösung von mindestens 1 & mgr; A und die Einhaltung von mindestens 100 V liefern kann, wird empfohlen. Beachten Sie, dass einige kommerzielle Verstärker verfügen über entsprechende eingebaute Stromquellen (siehe alternative Teile in der Material Abschnitt). Um jedoch das Erfordernis einer entsprechenden kombinierten Verstärker / Stromquelle zu umgehen, kann ein Magnetrelaisschaltung mit dem vorderen Ende des Verstärkers heads (6A - C) befestigt werden. Eine solche Schaltung optional sondern erlaubt es der Experimentator, zwischen dem Verstärker und einer separaten Stromquelle, die Iontophorese Impulse ohne physikalisches Stören der Elektrode zu liefern wechseln. Ein alternativer Ansatz besteht darin, mit solchen, die mit der Stromquelle verbinden manuell ersetzen die Elektrodenleitungsdrähte. In diesem Fall ist es am besten, um eine Pipettenhalter, die nicht eingeschlossen ist die obere (durchgezogene Ende) der Pipette, und flexible Schlauchleitung (6D) zu verwenden. Schritte, die wiederholte Praxis erfordern kann Es gibt mehrere Schritte, die möglicherweise eine Praxis zu meistern. Der Schritt, der die meisten Fingerfertigkeit erfordert, ist brechen Sie die Spitze der Pipette. Es ist hilfreich, um den Rand des Glasblocks zu malen, um die Reflexion von der Spitze in das Glas sichtbar. Dann kann man langsam vorschieben, den Block und die Pipette, bis die Spitze kaum seine Reflexion erfüllt. Advancing Pipette oder Block zu schnell können die Mikropipette zerbrechen und machen den Spitzendurchmesser zu large oder ungleichmäßig. Wir empfehlen die Verwendung von Mikropipetten aus Quarz, wie im Protokoll beschrieben. Quarts Mikro effektiv intakten Ratte Dura in chronisch bereit Kraniotomien ohne Biegen oder Brechen durchdringen. Dies beseitigt die Notwendigkeit für Dura Resektion, was zusätzliche Komplikationen verursachen kann. Borosilikat-Mikropipetten mit Kurzkegel (<5 mm) zu durchdringen auch die Dura, aber ihre Verwendung ist mit der Aufnahme von Oberflächenstrukturen wie die Großhirnrinde oder Striatum begrenzt. Aufnehmen von einem tieferen Strukturen, insbesondere in Thalamus oder Hirnstamm, erfordert lange konische, vorzugsweise Quarzmikropipetten. In einem zweiten Schritt, die Praxis erfordert, ist die Positionierung der Pipette in der juxtacellular Konfiguration. Zu schnell, wenn die Pipette in der Nähe einer Zelle kann die Membran reißen. Daher ist es nützlich, den Widerstand der Pipette zu wissen, wenn die Spitze in der Nähe eines mutmaßlichen Zell überwachen. Veränderungen in der Membranwiderstand von mindestens 2-fache an, dass die Elektrode Near oder Berühren einer Zellmembran. Fallstricke Es gibt einige Fallstricke zu beachten. Erstens, weil der Pipettenspitze ist notwendigerweise sehr nahe an der Zelle, ist es möglich, "verliert" die Zelle, wenn die Pipette wegtreibt Membran. Es ist auch möglich, eine Zelle regt zu werden oder zu Bruch Mitte der Aufnahme. Ist dies der Fall, kann der Dorn Breite und Brenngeschwindigkeit zu erhöhen und die Spitze Amplitude abnehmen. Dies sind Anzeichen dafür, dass die Zelle kann ungesund sein. Tierbewegung wird unweigerlich dazu führen, diese Ereignisse auf einige Teil der Aufnahmen geschehen, aber kann durch das das Tier gut gewöhnt und durch die Vermeidung von unnötigen, plötzliche laute Geräusche oder Vibrationen verursachen, die das Tier erschrecken minimiert werden. Eventuelle Veränderungen des Protokolls Es ist möglich, diese Aufzeichnungs- und Markierungstechnik im Kontext, in dem das Tier verwendenDurchführung einer Vielzahl von Verhaltensaufgaben. Ausbildung für einen bestimmten Verhaltens Aufgabe kann nach der Operation, aber vor Beginn der Aufzeichnung durchgeführt werden. Neuronale Aktivität kann mindestens 1-2 Wochen nach der Herstellung der Kraniotomie aufgezeichnet und iontophoretische Flecken für mindestens 2-3 Tage dauert. Dieser Zeitrahmen ermöglicht eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen, einschließlich der Aufnahme von mehreren Hirnregionen während der separaten Aufnahmesessions. Das Verfahren kann auch modifiziert werden, um die einzelnen Neuronen aus der die Aufnahmen gemacht werden füllen. Diese alternative Strategie juxtacellular Kennzeichnung einzelner Neuronen erfordert eine mechanische Stabilität, die nur dann erreicht wird, wenn das Tier noch oder narkotisiert. Aus diesem Markierungsstrategie ist die Verwendung von BDA über Neurobiotin empfohlen. BDA nicht durch Proteasen, die die Erfolgsquote über Neurobiotin erhöht abgebaut. Kennzeichnung sollte in der letzten Aufnahme-Session vor Perfusion der versucht werdenTier. Beachten Sie, dass eine detaillierte Beschreibung des juxtacellular Protokoll zuvor 6,19 .Während der Technik wurde in Alarm Ratten 8 erfolgreich eingesetzt beschrieben wurde, in unserer Erfahrung iontophoretischen Injektion von Chicago Sky Blue hat einen wesentlich höheren Ertrag. Man beachte, dass sowohl Chicago Sky Blue und Neurobiotin oder BDA Markierung kann im gleichen Tier durchgeführt werden. Diese Technik ist wahrscheinlich für eine Vielzahl von Arten angebracht sein. Man beachte, dass juxtacellular Aufnahmen wurden in kortikalen Regionen Benachrichtigung Mäusen 9 hergestellt worden ist, zum Beispiel. Während des Trainings, Handling und Kopfstützen sind bestimmte Arten sind die besonderen Techniken zur Überwachung und Kennzeichnung in diesem Protokoll beschriebenen gleich bleiben. Schließlich, indem einfach die Größe der Pipettenspitze und die Parameter der Stromimpulse diese Technik kann zur iontophoretischen Injektion einer Vielzahl von Molekülen, einschließlich pharmakologischer Mittel 20,21 verwendet werden. Somit wird dieTechnik könnte auch für neuropharmakologischen Studien, die verhalten Tiere einzubeziehen. Schlussfolgerungen Es ist oft der Fall, dass die Hirnregionen, die sehr nahe zusammen sind, können deutlich unterschiedliche Eigenschaften und / oder Funktionen 22 haben. In solchen Fällen betreffend die Aktivität der einzelnen Neuronen aus anatomisch definierten Regionen organismal Verhalten ist kritisch für das Verständnis der neuronalen Schaltkreise und Berechnung. Die vorliegende Artikel beschreibt ein Protokoll, dies durch eine Kombination von Standardtechniken zu erreichen und beschreibt sensorische Kodierung in VPM Thalamus Neuronen als Beispiel. Die Technik ist wahrscheinlich relevant und machbar in einer Vielzahl von Hirnregionen und Verhaltensparadigmen in verschiedenen Tiermodellen zu sein. Es hat eine wesentlich höhere Erfolgsquote als einzelne Zelle juxtacellular Kennzeichnung animals 6,8 und hat den Vorteil einer besseren anatomischen Auflösung über Techniken, die Multi-ele nutzenctrode Arrays oder Microdrives.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
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