Introduction
Supervisión de la actividad neuronal en un animal de alerta participando activamente en una tarea de comportamiento es crítica para la comprensión de la función y la organización del sistema nervioso. Registro extracelular de la actividad eléctrica de las unidades neuronales individuales ha sido durante mucho tiempo una herramienta básica de la neurociencia de sistemas y es todavía ampliamente en uso en la actualidad. Una variedad de tipos de electrodos y configuraciones están disponibles en función de las exigencias científicas y técnicas de un experimento particular. Crónicamente implantados microdrives o conjuntos de electrodos se utilizan a menudo en animales con libertad de movimientos, incluyendo aves, roedores y primates no humanos 1.4. Alternativamente, las penetraciones agudos con microelectrodos de metal o de vidrio a través de un micromanipulador externa se utilizan a menudo para grabar a partir de animales anestesiados o cabeza-restringido. Electrodos de micropipeta de vidrio tienen la ventaja de que pueden ser utilizados en el juxtacellular o "célula unidos" configuración para aislar de manera inequívoca laactividad de las neuronas individuales sin las complicaciones de pico post-hoc de clasificación 5. Estos electrodos permitan, además, la grabación a partir de células o lugares anatómicamente identificadas, ya que pueden ser utilizados para inyectar pequeños depósitos de tinte o neuroanatómicas trazadores, o incluso para llenar el individuo célula registrada. Esta configuración se ha aplicado con éxito en ratas, ratones y aves 10.6. La técnica descrita actualmente centra en el seguimiento juxtacellular y los depósitos de tinte extracelular en alerta, ratas cabeza-restringido. Tenga en cuenta que una sola célula a diferencia de juxtacellular llena, estos depósitos de tinte no proporcionan información sobre la morfología celular o proyecciones axonales 11, pero permitirá la localización anatómica exacta a aproximadamente 50 micras y, críticamente, tienen un rendimiento significativamente mayor en los animales de alerta. La información relativa a una sola célula juxtacellular llena, sin embargo, se proporciona como una estrategia alternativa para el etiquetado anatómica.
En resumen, elprotocolo consta de tres fases principales. En la primera fase, la rata se aclimataron a la restricción del cuerpo en un calcetín de tela (Figura 1) durante un período de 6 días. En la segunda fase, un aparato de apoyacabezas (Figura 2) y la cámara de grabación se implantan quirúrgicamente de tal manera que la rata se puede mantener en el plano estereotáxico durante múltiples sesiones de grabación posteriores (Figura 3); este procedimiento permite al experimentador de centrarse en las regiones subcorticales del cerebro para el estudio electrofisiológico basado en referencia estándar coordina 12. La tercera fase consiste en la colocación de la rata en una plantilla adecuada para la realización de los experimentos de comportamiento y electrofisiológicos (Figura 4), la construcción del electrodo de un tubo capilar de cuarzo (Figura 5), por lo que las grabaciones neuronales juxtacellular que sin ambigüedades aíslan unidades individuales 6-9, y marcando los locati anatómicasen el sitio de la grabación con Chicago Sky colorante azul (Figuras 6 y 7). Las grabaciones se realizaron con monitorización simultánea de comportamiento; sin embargo, los detalles técnicos de la conducta dependerán de los objetivos científicos de cada experimento y por lo tanto más allá del alcance de un solo protocolo. Después de la terminación del procedimiento experimental, que se puede repetir en varios días, el animal es sacrificado. El cerebro se extrae y se procesa de acuerdo con las técnicas neuroanatómicas estándar utilizando cualquiera de campo claro o microscopía de fluorescencia.
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Protocol
Los protocolos experimentales se realizaron en ratas Long Evans hembras (250-350 g) de acuerdo con las directrices de cuidado y uso de animales prescritos por el gobierno federal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en San Diego.
1. Acclimating la Rata a cuerpo de sujeción
NOTA: Coloque la rata en una dieta restringida. Alimentar a la rata una vez al día inmediatamente después de cada sesión de manejo diario para aclimatarse a la rata para el sistema de retención (descrito a continuación). Proporcionar suficiente de alimentación para mantener al animal en 80% de su peso inicial. Esta cantidad es de aproximadamente 6 gramos de alimento por día para un 250 g mujeres de largo Evans rata.
- Aclimatarse a la rata a ser manipulado por los seres humanos. Frenar suavemente la rata a mano por períodos de aproximadamente 5 segundos cada 30 segundos. Haga esto durante 15 minutos al día en 2 días consecutivos. Monitorear las ratas diariamente para detectar signos de estrés durante el período de formación. Los signos incluyen luchando in respuesta a la moderación, la vocalización, y diente-parloteo.
- En el día 3 rd, coloque la rata en un cuerpo que restringe su calcetín de tela (Figura 1) durante 15 minutos al día durante dos días consecutivos.
- En el 5º día, coloque la rata dentro del calcetín, y colocar el calcetín dentro de un tubo rígido en la plantilla experimental (Figura 4). Deja la rata en el tubo durante 15 minutos al día en 2 días consecutivos.
- Alimentar a la rata inmediatamente después de cada sesión de entrenamiento. Al final de la última sesión (día 6) dar acceso sin restricciones a los alimentos. Seleccione para su implantación sólo aquellas ratas que no muestran signos de estrés excesivo en el último día de entrenamiento.
NOTA: Aunque la selección de las ratas para la implantación es subjetiva, en nuestras manos más del 90% de las ratas se encontró que ser sensible a la habituación y capaz de someterse a la implantación.
2. Implantación del Mecanismo de Cámara Grabación y reposacabezas
- Hacer una realambre Conferencia soldando alambre de acero inoxidable desnudo a un conector pin. Corte el cable de manera que 5.3 mm restos descubiertos por el pasador. Autoclave el cable de referencia, junto con todas las herramientas quirúrgicas.
- Administrar ketamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de ketamina se mezcla con 5 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal. La dosis inicial tiene una duración de 1 ½ a 2 horas. Complementar la anestesia cada 30-45 min a partir de entonces, según sea necesario. Lubricar los ojos del animal con una pomada oftálmica.
- Compruebe el reflejo de retirada del dedo del pie para determinar el plano de la anestesia, y mantener la anestesia según sea necesario.
- Coloque la rata en un marco de soporte estereotáxica con barras de oído (Figura 3A). Afeitarse el pelo en la cabeza y la desinfección de la zona de la herida con povidona-yodo (solución al 10%). Tenga cuidado de insertar las barras de oído adecuadamente de modo que no dañen el tímpano. Barras de oído con puntas romas son preferibles.
- Hacer una incisión con un bisturí aproxidamente a lo largo de la línea media del cráneo desde el nivel rostro-caudal de los ojos a la parte posterior de las orejas. Utilice unas tijeras para cortar y retirar una tira de 2-3 mm de piel en cada lado de la incisión.
- Raspe el periostio para exponer la superficie del cráneo a los rebordes laterales. Cubra el cráneo expuesta con fina capa de pegamento.
- Perforar un agujero pequeño, con un diámetro ligeramente menor que 0-80 tornillos, usando un taladro rebabas ½ mm de diámetro (véase la sección de Materiales). Perforar el agujero inmediatamente posterior a bregma, donde la sutura se encuentra con el canto lateral, y en un ángulo de 30-45 ° en el cráneo, de modo que el tornillo puede entrar con la parte superior más lateral de la parte inferior.
- Enrosque un tornillo 0-80 máquina de fondo plano al agujero (aproximadamente 3 vueltas), en 30 a 45 ° de ángulo. Tenga cuidado de no enroscar demasiado profundamente para evitar dañar el tejido cerebral subyacente.
- Repita este procedimiento para 6 tornillos adicionales en la configuración que se muestran
- Coloque una aguja de la jeringa en el manipulador stereotax. Mida desde la sutura bregma, y hacer un hueco en el cráneo con la aguja cerca, pero fuera de la ubicación craneotomía deseada, como una marca de referencia.
NOTA: En esta demostración, las coordenadas estereotáxica de la marca son 3 mm posterior y 1 mm lateral a la sutura bregma. - Marque la abolladura con un marcador permanente. Tenga en cuenta las coordenadas estereotáxica de la marca, ya que servirá como punto de referencia estereotáxica (Figura 3B).
- Hacer una craneotomía centrado en las coordenadas deseadas (3 mm posterior y 3 mm lateral al bregma en este ejemplo). Deje la duramadre intacta. Cubrir la craneotomía con líquido cefalorraquídeo artificial modificada (NaCl 125 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM de MgCl 2, pH 7,4) 13 (Figura 3C). Cortar un tubo de 0,2 ml centrífuga para 4 - 5 mm de longitud, y le cortó la tapa. Se coloca el tubo en el cráneo y centrarlo sobre la craneotomía.
- Aplique el cemento dental alrededor de la parte inferior del tubo para sellar la base del tubo en el cráneo. Tenga cuidado de no tener fugas de cemento en la craneotomía expuesto (Figura 3D).
- Perforar otro agujero pequeño (alrededor de ½ mm de diámetro) en la placa craneal contralateral e inserte con cuidado el cable de referencia. Construir el cable de referencia por la soldadura de un pasador que se conecta con el amplificador de grabación para el extremo del alambre (ver sección Equipment). No mueva el cable de referencia una vez que está en el cerebro, ya que esto puede causar daños.
- Aplicar pegamento en el agujero en el que se insertó el alambre. Esto sellará el pasador y el cable en su lugar temporalmente.
- Mezclar las dos partes del kit de gel de silicona (véase la sección de Materiales) en porciones aproximadamente iguales. Espere dos minutos para mezclar y fill el tubo de centrífuga aproximadamente ⅓ completo con gel.
- Acople una abrazadera posterior ángulo recto (véase la sección de Materiales) de la barra de reposacabezas. Coloque la placa de cabeza (Figura 2A) a la barra de retención (Figura 2B) en un ángulo de 45 ° de tono de modo que la parte inferior de la placa es hacia la nariz del animal. Es útil usar un inclinómetro para ajustar el ángulo de paso para que coincida con la de la plantilla experimental (Figura 4).
- Coloque la barra de sujeción al brazo manipulador stereotax para que la barra es paralela a las barras de oído. Bajar la barra y la placa de modo que la placa es posterior de la sutura lambda y anterior a la caudal más-tornillo.
- Sujete la cabeza del perno delantero (un perno o tornillo 8-32, véase la sección de Materiales) a unos 45 ° ángulo con un brazo manos ayudar y abrazadera, de manera que la cabeza del tornillo quede hacia abajo y hacia la cola del animal. Baje el tornillo de modo que toque la hormigaerior 0-80 tornillos (Figura 3F, G).
- Asegure el perno y la placa en su lugar con acrílico dental. Aplicar acrílico dental alrededor de las cabezas de los tornillos de hueso, el pasador de referencia, y alrededor de los lados del tubo de centrífuga. Espere aproximadamente 10 min para el acrílico dental se seque (Figura 3H).
- Aplicar una capa de cemento dental alrededor de los bordes del acrílico dental, consolidando la piel para el implante. Espere a que el cemento se seque.
- Meter varios agujeros en la tapa del tubo de centrífuga, y colocar el tapón en el tubo.
- Retire la abrazadera manos ayudando. A continuación, retire con cuidado la barra de la cabeza de retención de la stereotax, y luego retire la placa de la cabeza de la barra (Figura 3I).
- Quite el animal del stereotax y administrar cuidados postoperatorios y de seguimiento de conformidad con todas las reglas, reglamentos y leyes (por ejemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, cada 8 a 12 horas durante un mínimo de 24hr). Si la inflamación se desarrolla alrededor de los bordes del implante, aplicar una capa fina de pomada antibiótica al sitio afectado diariamente hasta que se resuelva.
3. Monitoreo Juxtacellular de unidades neuronales
- Tire tubo capilar de cuarzo en una micropipeta láser de dióxido de carbono extractor (ver sección Equipment) con diámetros de punta de menos de 1 m (Figura 5A).
Nota: Los parámetros de calentamiento variarán de acuerdo con el instrumento en particular, y que el diámetro del cuello requerida variará dependiendo de la estructura del cerebro de interés. Para grabaciones en el tálamo de ratas, micropipetas tienen cuellos que van de 5-7 mm. - Asegure la pipeta en el lugar bajo un contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopio equipado con objetivos de larga distancia de trabajo. Use plastilina para sostener la pipeta en su lugar en el escenario del microscopio.
- Lentamente mueva un bloque de vidrio (0,5 a 1 cm de espesor; un pedazo de vidrio utilizado para making cuchillos ultra-micrótomo es conveniente) en el campo de visión con la punta de pipeta. Utilizando el micromanipulador etapa, toque suavemente la punta de la pipeta para el cristal, haciendo que se rompa. Repita según sea necesario hasta que el diámetro exterior de la punta de pipeta está entre 1-3 micras (Figura 5B, C). Asegúrese de que estas micropipetas tienen impedancias entre aproximadamente 5-15 MΩ.
- Preparar solución salina extracelular (NaCl 135 mM, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 con NaOH) 8 y añadir 2% (w / v) Chicago Sky Azul. Usando una jeringa con una aguja de 30 G o menor, llenar el extremo posterior de la pipeta con la solución. Alternativamente, para el etiquetado juxtacellular sola célula añadir 2% (w / v) Neurobiotin o amina dextrano biotinilado (BDA-3000 o BDA-10000) a la solución salina en lugar de Chicago Sky Azul.
- Coloque la rata dentro del calcetín de tela en el interior del tubo rígido en una plantilla experimental apropiado (
- Fije la placa frontal de restricción en la rata a la pieza correspondiente en la plantilla. Para ello, en primer pin de la placa reposacabezas en su lugar y, a continuación, fijarlo con un tornillo 4-40. Asegúrese de esperar hasta que el animal está tranquilo con el fin de evitar la aplicación de un par excesivo a la cabeza. Luego, coloque una tuerca de 8-32 en el perno de cabeza de restricción que se implanta en la rata. Luego atornille en una varilla de acero inoxidable roscado al perno en la cabeza. Colocar la varilla a la plantilla experimental de tal manera (Figura 4) que se puede apretar en su lugar.
NOTA: Asegurar el animal con la cabeza del perno, así como el reposacabezas placa minducir al mínimo la flexión del aparato y mejora la estabilidad de la grabación. En la mayoría de los casos la grabación puede comenzar en el primer día del animal es el jefe-restringido. Sin embargo, si el animal se mueve nerviosamente en exceso o vocaliza, proporcionar un día de entrenamiento habituación reposacabezas antes de comenzar las grabaciones. En este caso, dejar al animal en la plantilla durante 15 minutos y luego se coloca de nuevo en su jaula. Repita este paso el día siguiente y continuar con el protocolo.- Abra la cámara de grabación y quitar el gel de silicona. Limpie la craneotomía utilizando unas pinzas finas si el tejido ha vuelto a crecer en la craneotomía.
- Coloque la pipeta para el micromanipulador motorizado, y conecte el preamplificador cabezal de la platina.
NOTA: En el presente manifestación, un circuito de relé pequeño en el cabezal de la platina se utiliza para cambiar entre los hilos conductores del amplificador y una fuente de corriente externa con alto cumplimiento (Figura 6A-C). Tenga en cuenta que algunos amplificadores tienen un adecuado incorporado fuente de alto cumplimiento(Ver Discusión y Materiales secciones).- Utilice el micromanipulador motorizado para mover la punta de la pipeta a la marca estereotáxicamente identificado en la cámara de grabación. Tenga en cuenta las coordenadas de la ubicación. Tenga cuidado de no romper la punta de la pipeta sobre el cráneo.
- Mueva la pipeta a la ubicación de grabación que desee en los ejes antero-posterior y medio-lateral. Entonces avanzar la pipeta ventralmente a través de la dura hasta que es de aproximadamente 500 micras dorsal a la ubicación de grabación.
- Avance lentamente la pipeta mientras escucha para clavar eventos en un monitor de audio de la tensión amplificada registrado entre la punta de la pipeta y el cable de referencia. Una vez identificados los eventos Rematar, continúan moviendo la pipeta 0-100 micras hasta deflexiones positivas tensión va mayores que se observan alrededor de 500 mV.
NOTA: La resistencia del electrodo se incrementará en un factor de aproximadamente 1,5-10 when esta se produce.- Comienza la grabación una vez una unidad ha sido aislado como de acuerdo al paso 3.11, junto con todas las demás medidas conductuales y fisiológicos de interés. En la presente manifestación, movimientos Vibrisas autogenerados son monitoreados con la videografía de alta velocidad (véase la sección de Materiales).
- Para etiquetar el sitio de registro, cambiar el electrodo lleva a conectarse a la fuente de corriente. Hay varias maneras de hacer esto, ya sea utilizando un circuito de relé (Figura 6 A - C), un sistema incorporado en la fuente de corriente en el amplificador, o manualmente (Figura 6D, consulte el paso 3.8 y Discusión). Pase -4 mu con 2 pulsos por segundo bajo ciclo de trabajo del 50% durante 4 minutos para inyectar iontoforéticamente Chicago Sky azul a través de la pipeta.
- Matar y perfundir el animal después de varios procedimientos de etiquetado según la práctica estándar. Sección del cerebro y de contraste si es necesario para identificar la localización anatómica de la grabación sentarsee. Contratinción el tejido para la reactividad citocromo oxidasa como por 14. Por otra parte, identificar los depósitos de Chicago Sky azul usando microscopía de fluorescencia.
NOTA: Para diferenciar con precisión entre diferentes unidades marcadas es importante que todas las etiquetas están fabricadas con la misma pipeta en el mismo día, sin el desamarre la pipeta entre las etiquetas. En este caso, los sitios de grabación pueden ser diferenciados por su ubicación relativa en la histología post-hoc junto con las coordenadas del manipulador notables de cada sitio (véase el paso 3.9). Para la identificación inequívoca, marque las etiquetas de al menos 200 micras separados unos de otros, y no más de 3-5 etiquetas por región del cerebro. - Fije la placa frontal de restricción en la rata a la pieza correspondiente en la plantilla. Para ello, en primer pin de la placa reposacabezas en su lugar y, a continuación, fijarlo con un tornillo 4-40. Asegúrese de esperar hasta que el animal está tranquilo con el fin de evitar la aplicación de un par excesivo a la cabeza. Luego, coloque una tuerca de 8-32 en el perno de cabeza de restricción que se implanta en la rata. Luego atornille en una varilla de acero inoxidable roscado al perno en la cabeza. Colocar la varilla a la plantilla experimental de tal manera (Figura 4) que se puede apretar en su lugar.
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Representative Results
Unidades neuronal en ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar la fase de movimiento Vibrisas durante auto-generado batiendo 15,16. La Figura 7A muestra la actividad de la muestra spiking de una unidad de talámico VPM como una rata se batiendo activamente. La Figura 7B muestra un histograma de la espiga veces alineados a la fase instantánea de movimiento Vibrisas 17. Hay más espigas durante la fase de retracción de batir. Después de la grabación, la ubicación de la unidad fue etiquetado a través de iontoforesis de Chicago Sky colorante azul, como se muestra en la Figura 7C. El tejido se counterstained para la actividad citocromo oxidasa para revelar las fronteras neuroanatómicos del tálamo VPM. Una versión similar de este protocolo se aplicó recientemente para monitorear relacionados con el bate actividad neuronal multiunit (10-20 micras puntas de pipeta de diámetro) en los núcleos del tronco cerebral específicos 18.
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Figura 1: tela de restricción calcetín (A) Fotografía de un calcetín rata con cordones y broches de cordón.. El extremo pequeño se coloca cómodamente alrededor del esternón, y el extremo grande alrededor de la cola. (B) patrón de diseño para el calcetín en el panel 1A. Las dimensiones están en pulgadas.
Figura 2: Diseño mecánico de aparatos reposacabezas (A) Diseño mecánico de una placa reposacabezas de precisión para las ratas.. Las dimensiones están en pulgadas. (B) Diseño mecánico de un bar reposacabezas para su uso con la placa en el panel 2A. El protocolo requiere dos de estas piezas, montadas con abrazaderas colocar en ángulo recto con el mismo ángulo de paso._blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento quirúrgico (A) de la rata en un marco de soporte estereotáxica (paso protocolo 2.4).. (B) del sitio quirúrgico con tornillos implantados y marcas craneales (paso protocolo 2.10). (C) del sitio quirúrgico con una craneotomía (paso protocolo 2.12). (D) del sitio quirúrgico con la cámara de grabación (paso protocolo 2.14). (E) del sitio quirúrgico con el cable de referencia y el gel de silicona (paso protocolo 2.17). (F, G) del sitio quirúrgico con placa apoyacabezas y bar mantiene en su lugar (paso protocolo 2.20). (H) del sitio quirúrgico con placa y bar cimentó en su lugar (paso protocolo 2.21). (I) reposacabezas Final y grabación impl cámarahormiga (paso protocolo 2.24). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Jig Experimental Diagrama de rata en la plantilla mecánica para los experimentos de seguimiento electrofisiológicos y de comportamiento (protocolo de los pasos 3.5 a 3.6). La plantilla utiliza la barra y la placa en la figura 2.
Figura 5: Construcción de electrodos Micropipeta (A) Micrografía de una micropipeta ininterrumpida (paso protocolo 3.1).. La barra de escala es como en el panel C. (B) Micrografía de la micropipeta ininterrumpida y bloques de vidrio bajo el microscopio (paso protocolo 3.2).La reflexión de la punta se puede ver en el cristal. La barra de escala es como en el panel C. (C) Micrografía de la micropipeta roto (paso protocolo 3.3). (D) Micrografía de la punta de la micropipeta ininterrumpida en la región en caja de panel de la barra A. La escala es como en el panel E. (E) Micrografía de la punta de la micropipeta roto en la región en caja de panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Equipo para la conmutación entre el amplificador y fuente de corriente (A) Configuración para cambiar los cables desde el amplificador a la fuente de corriente a través de un relé magnético (opcional). Una placa de circuito impreso que contiene el conmutador del relé controlado por tensión es ATTACHed a la etapa de la cabeza amplificador. (B) Disposición de la placa de circuito impreso en el panel 6A. La junta conecta los cables del amplificador y fuente de corriente conduce a las clavijas de entrada del relé, y el electrodo conduce a los pines de salida. El electrodo está conectado a ya sea la fuente de corriente o el amplificador mediante la aplicación de ya sea 0 o 5 V a las clavijas de control de relé. Vista inferior. Las dimensiones están en pulgadas. (C) Vista desde arriba de la disposición de la tarjeta en el panel 6B. (D) Configuración para cambiar los cables desde el amplificador a la fuente actual manualmente (opcional) requiere un soporte de pipetas abierta y cable flexible como las que se muestran (ver también: Sección de Equipo). Este enfoque es una alternativa al circuito de relé en paneles 6A-C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Montaje experimental y resultados representativos Espigas (A) y el movimiento de vibrisas de una unidad (paso protocolo 3.12).. (B1) Normalizado Vibrisas posición frente a las fases del ciclo batidor. Cada batidor se normaliza de manera que la posición más caudal durante el batidor se define como cero y la posición más rostral define como uno. La trayectoria representa la posición normalizada frente fase instantánea en el ciclo de batidor 17. Todos los batidores identificados se superponen. (B2) de la trama de la fase del ciclo de batir a la que ocurren los picos. Cada ensayo en el eje vertical representa una sola batidor. (B3) Histograma de las tasas de pico con la fase del ciclo respecto batidor para la misma unidad. (C1) Ubicación de tinte Chicago Sky azul con counterstaining citocromo oxidasa (protocolo pasos 3.13 a 3.14). (C2 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Construcción de la plantilla experimental
La descripción de las partes mecánicas utilizadas para construir la plantilla experimental (Figura 4) se omite en el protocolo, ya que se puede construir en una variedad de maneras. En esta norma demostración se utilizan optomecánico partes y las abrazaderas de soporte para montar la barra de reposacabezas y el tubo de sujeción del cuerpo (véase la sección de Materiales). Partes opto-mecánicas similares pueden utilizarse para montar el soporte del electrodo a la micromanipulador motorizado. Es importante que la barra de sujeción cabeza en la plantilla se monta en el mismo ángulo de inclinación que la barra se utiliza para implantar la placa de cabeza moderación durante la cirugía. Si el electrodo se va a mover a lo largo de los ejes estereotáxicas estándar, entonces el eje x del electrodo debe moverse paralelo a la barra de reposacabezas, y el eje z perpendicular al plano que contiene lambda y bregma y paralelo al suelo ( Tipos de amplificadores apropiados y las fuentes de corriente Hay una variedad de amplificadores comerciales y fuentes de corriente que puede ser utilizado para este experimento. La mayoría de los amplificadores de electrofisiología extracelulares e intracelulares con un modo de abrazadera de corriente que alcanzan una ganancia total de 1.000X son apropiados. Para iontoforesis de Chicago Sky azul con 1-3 pipetas micras, una fuente de corriente que puede entregar hasta 10 mu con una resolución de al menos 1 mu y un cumplimiento de al menos 100 V se recomienda. Tenga en cuenta que algunos amplificadores comerciales tienen apropiada incorporado fuentes de corriente (ver partes alternas en la sección de Materiales). Sin embargo, para eludir el requisito de un amplificador / fuente de corriente combinada apropiado, un circuito de relé magnético puede estar unido al extremo delantero del cabezal de la platina amplificador (Figura 6A - C). Tal circuito es Opcional pero permite el experimentador para cambiar entre el amplificador y una fuente de corriente separada para entregar pulsos de iontoforesis sin perturbar físicamente el electrodo. Un enfoque alternativo es reemplazar manualmente los hilos conductores del electrodo con las que se conectan a la fuente de corriente. En este caso, lo mejor es utilizar un soporte de pipetas que no incluye a la parte superior (extremo ininterrumpida) de la pipeta y de utilizar cable flexible (Figura 6D). Pasos que puede requerir la práctica repetida Hay varios pasos que pueden requerir práctica para dominar. El paso que requiere la mayor destreza es romper la punta de la pipeta. Es útil para pintar el borde del bloque de vidrio para visualizar el reflejo de la punta en la copa. Entonces uno puede avanzar lentamente el bloque y la pipeta hasta que la punta apenas cumple con su reflejo. Avanzando pipeta o bloque demasiado rápido puede romperse la micropipeta y hacer que el diámetro de la punta demasiado largcorreo o irregular. Recomendamos el uso de micropipetas de cuarzo, como se describe en el protocolo. Quarts micropipetas penetran eficazmente dura ratas intactas en craneotomías preparados crónicamente sin doblarse o romperse. Esto elimina la necesidad de resección dura, que puede causar complicaciones adicionales. Micropipetas de borosilicato con conos cortos (<5 mm) también penetran en la duramadre, pero su uso se limita a la grabación de las estructuras superficiales como la corteza cerebral o estriado. Grabación desde las estructuras más profundas, sobre todo en el tálamo o el tronco cerebral, requiere largos micropipetas cónicos, preferiblemente de cuarzo. Un segundo paso que requiere práctica es el posicionamiento de la pipeta en la configuración juxtacellular. Traslado de la pipeta demasiado rápidamente cuando está cerca de una célula puede romper la membrana. Por lo tanto, es útil para controlar la resistencia de la pipeta para saber cuando la punta está cerca de una célula putativo. Los cambios en la resistencia de la membrana de al menos 2 veces indican que el electrodo puede ser near o tocar una membrana celular. Errores comunes Hay varios errores comunes a tener en cuenta. En primer lugar, debido a que la punta de la pipeta es necesariamente muy cerca de la célula, es posible "perder" la celda si la pipeta se aleja de la membrana. También es posible para una célula para ser agitado o ruptura a medio camino a través de la grabación. Si lo hace, el ancho de pico y la tasa de disparos puede aumentar y la amplitud de espiga pueden disminuir. Estos son indicios de que la célula puede ser poco saludable. Movimiento de animales causará inevitablemente estos eventos sucedan en alguna proporción de las grabaciones, pero puede ser minimizado por tener el animal bien habituado y evitando hacer ruidos fuertes y repentinos innecesarios o causar vibraciones que asustar al animal. Posibles modificaciones en el protocolo Es posible utilizar esta técnica de grabación y etiquetado en contextos en los que el animal serealizar una variedad de tareas de comportamiento. El entrenamiento para una tarea de comportamiento particular puede llevarse a cabo después de la cirugía, pero antes de empezar a grabar. La actividad neuronal se puede grabar por lo menos 1-2 semanas después de la preparación de la craneotomía, y manchas iontoforéticas puede durar por lo menos 2-3 días. Este período de tiempo permite una variedad de manipulaciones experimentales, incluyendo la grabación de múltiples regiones del cerebro durante las sesiones de grabación separadas. La técnica también puede ser modificado para llenar las neuronas individuales a partir del cual se realizan las grabaciones. Esta estrategia alternativa de etiquetado juxtacellular de las neuronas individuales requiere estabilidad mecánica que sólo se consigue cuando el animal está quieto o anestesiado. Para esta estrategia de etiquetado, se recomienda el uso de BDA sobre Neurobiotin. BDA no es degradada por las proteasas, lo que aumenta significativamente la tasa de éxito a lo largo Neurobiotin. Etiquetado debe intentarse durante la última sesión de grabación antes de la perfusiónanimal. Tenga en cuenta que las descripciones detalladas del protocolo juxtacellular han sido descritas previamente 6,19 .Mientras la técnica que se ha empleado con éxito en ratas de alerta 8, en nuestra experiencia inyección iontoforética de Chicago Sky Blue tiene un rendimiento sustancialmente mayor. Tenga en cuenta que tanto los Chicago Sky Azul y etiquetado Neurobiotin o BDA se puede hacer en el mismo animal. Esta técnica es probable que sea apropiado para una variedad de especies. Tenga en cuenta que las grabaciones juxtacellular se han hecho en las regiones corticales de ratones de alerta 9, por ejemplo. Durante el entrenamiento, la manipulación, y reposacabezas son especies específicas, las técnicas particulares de seguimiento y etiquetado descritos en este protocolo debe seguir siendo el mismo. Por último, simplemente cambiando el tamaño de la punta de la pipeta y los parámetros de los impulsos de corriente esta técnica puede ser usada para la inyección iontoforética de una variedad de moléculas, incluyendo agentes farmacológicos 20,21. Por lo tanto, latécnica también podría ser útil para los estudios neurofarmacológicos que involucran animales se comportan. Conclusiones A menudo es el caso de que las regiones del cerebro que son extremadamente cerca juntos pueden tener propiedades marcadamente diferentes y / o funciones 22. En tales casos, que relaciona la actividad de las neuronas individuales de las regiones anatómicamente definidas para el comportamiento del organismo es fundamental para la comprensión de los circuitos neuronales y la computación. El presente artículo muestra un protocolo de lograr esto usando una combinación de técnicas estándar y describe la codificación sensorial en VPM neuronas talámicas como un ejemplo. La técnica es probable que sea pertinente y factible en una variedad de regiones del cerebro y paradigmas de comportamiento en diferentes modelos animales. Tiene una tasa de éxito sustancialmente mayor que celular etiquetado juxtacellular sola en animales de alerta de 6,8, y tiene la ventaja de una mejor resolución anatómica sobre las técnicas que utilizan multi-elearrays ctrode o microdrives.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20 - 40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone gel | Dow Corning | 3-4680 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining, Figure 7 |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 ⅛” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2 ml centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2 - 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figures 3, 4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 ¾” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion, Figure 6A |
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
| Puralube vet ointment | Amazon.com, Inc | NC0138063 |
References
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