Abstract
Визуализация биологических образцов с использованием флуоресцентной микроскопии существенно продвинулись с новыми технологиями по преодолению разрешения барьер дифракции света, позволяя супер-разрешение живых образцов. Есть в настоящее время три основных типа методов супер-разрешения - стимулировали истощение выбросов (STED), одной молекулы локализации микроскопии (в том числе таких методов, как пальма, STORM, и GDSIM), и структурированный освещение микроскопия (SIM). В то время как методы локализации STED и одиночных молекул показать наибольший рост резолюции, они не сразу предложить повышенные скорости получения изображения. Трехмерная SIM (3D-SIM) является флуоресценции техника микроскопии широкого поля, который предлагает ряд преимуществ по сравнению как локализации одиночных молекул и STED. Разрешение улучшается, с типичными боковых и осевых резолюций 110 и 280 нм, соответственно и глубины выборки до 30 мкм от покровного стекла, что позволяетизображений из целых клеток. Последние достижения (быстрая 3D-SIM) в технологии увеличивая скорость захвата необработанных изображений позволяет быстро захвата биологических процессов, происходящих в секундах, при значительном снижении фото-токсичность и фотообесцвечивание. Здесь мы опишем использование одного из таких методов, чтобы изображение бактериальные клетки, несущие флуоресцентно меченных cytokinetic FtsZ белок, чтобы показать, как анализируются клетки и тип уникальной информации, что эта техника может обеспечить.
Introduction
Ряд различных технологий обработки изображений были использованы на протяжении многих лет, чтобы изучить бактерии в том числе различных электронных и оптических методов микроскопии. В то время как электронная микроскопия предлагает очень высокое разрешение, вплоть до нанометра, потребность в вакууме и использование контрастных агентов имеет ограниченную эту технику, чтобы основной и встроенных образцов. Артефакты могут быть также введены в связи с длительной пробоподготовки и опытный практикующий необходим для приготовления образцов, и для анализа и интерпретации полученных изображений. Оптическая микроскопия предлагает преимущества простой пробоподготовки и применение нескольких этикеток с относительной легкостью по сравнению с электронной микроскопией. Использование флуоресцентных белков и конъюгаты краситель, способности к обучению живые клетки с флуоресцентной микроскопии также возможно. С улучшением стабильности флуорофором и флуоресцентного белка размера / структуры ведущих к снижению клеточной токсичности, а также достижения в области технич обнаружения камерыгии, флуоресцентная микроскопия с использованием широкого поля и конфокальной системы визуализации значительно расширил наше понимание пространственной динамики клеток. Используя эти методы, наши знания о бактериальной клетки в течение последних 20 лет значительно продвинулись в гораздо более детального просмотра, который показывает высокий уровень структурной и белка организации в течение бактериальной клетки 1.
Тем не менее, традиционные методы оптической микроскопии являются дифракции ограничена, это означает, что присуще разрешение составляет около половины длины волны возбуждающего света используется. Следовательно, даже при самом оптимальном традиционной системе оптической микроскопии, лучшее боковое разрешение составляет около 220-250 нм, а разрешение осевое составляет около 500 нм (для обзора см Schermelleh и соавт. 2). Для бактериальных биологов клеток, в частности, это по-прежнему серьезно ограничивает наше понимание пространственной организации этих крошечных клеток; быть только 1-2 мкм в диаметреметр и 1-10 мкм в длину. Существует также потребность в более высоких методов разрешения, которые можно выполнить на живые клетки, где динамическое пространственное поведение белка могут быть проанализированы, чтобы дополнить в пробирке данные.
За последние десять лет, несколько методов визуализации флуоресценции супер-разрешения были разработаны. Супер-разрешение микроскопия описывает методы визуализации, что, по крайней мере в два раза больше латерального разрешения получены с обычной световой микроскопии, тем самым преодолевая дифракционную барьер. Эти методы манипулирования освещения и / или анализ излучаемого света, чтобы создать реальное повышение кажущейся резолюции. Есть в настоящее время три основных типа методов супер-разрешения - я) стимулировали истощения выбросов микроскопии 3 (STED); II) локализация одиночных молекул микроскопия, в том числе таких методов, как локализации фотоактивация микроскопии 4,5 (PALM), стохастической оптической микроскопии реконструкции
Трехмерное структурированного освещения микроскопии (3D-SIM) представляет собой метод широко поле, которое улучшает и бокового и осевого разрешение в результате чего решениями приблизительно 110 и 280 нм, соответственно. Глубина выборки до 30 мкм от покровного стекла, что позволяет визуализации целых клеток. Изменение 3D-SIM разработан Sedat, Agard, и на Gustaffsson (OMX) платформы оптического микроскопа включает в себя экспериментальные освещения образца с известной сетке, которая перемещается в 15 различнойпозиции в каждой плоскости г 9-11. Полосы в результате муар, которые создаются в частотном пространстве за пределами наблюдаемой области измеряются. Информация от частотного пространства вычислительно реконструированный для генерации видимого супер-разрешением изображения 10,11. Относительная скорость, с которой исходные изображения могут быть получены с помощью этой техники позволяет изображений живых клеток. Тем не менее, важно отметить, что для биологических процессов, протекающих на временной шкале секунд, скорость сбора данных из необработанных изображений по-прежнему слишком медленно, чтобы захватить динамических изменений. Для временных рядов со скоростью захвата секунд, повторяется приобретение без достаточного времени восстановления может привести к фототоксичности и фотообесцвечивания, особенно во время живого изображения мелких бактериальных клеток.
Для преодоления этих проблем, недавние достижения для быстрой 3D-SIM (F3D-SIM) были разработаны. Здесь мы опишем один, известный как OMX Blaze 16, который был яntroduced в конце 2011 г. Эта технология создает рисунком освещения без использования физического сетки, который был использован в более ранних системах. Использование вмешательства световые лучи и новые технологии затвора позволяет создании узорной света на образце в очень быстрым способом. Скорость получения изображения было более усиливается с введением научно дополняют полупроводниковых оксидов металлов (sCMOS) камер, особенно по сравнению с существующими EMCCD камер. Эти изменения привели к возможной скорости захвата изображений из одного кадра в секунду в течение глубине дискретизации 1 мкм (512 х 512 пикселей, 9 г-ломтиками), позволяет осуществлять мониторинг состояния динамических изменений внутри клеток, которые происходят в течение нескольких секунд 16. Уменьшение видимых экспозиции (возбуждение) раз в живые клетки, используя этот метод позволяет либо широким разбросом по времени, чтобы быть захвачен или увеличение скорости захвата.
Здесь мы опишем применение F3D-SIM микроскопии для обследоватьэлектронной структуры и динамичное движение в cytokinetic Z кольца в клетках двух видов бактерий: палочкообразных модель организма Сенная палочка и коккоподобной человека возбудителя золотистого стафилококка. FtsZ является тубулина-как цитоскелета белок, который играет ключевую роль в делении клеток у бактерий 17,18. Это локализуется на сайт подразделения набирать не менее 20 других белков деления, образуя аппарат деления 17,18, и, как полагают, чтобы обеспечить силу для клеток сужения 19-23. Этот метод показывает, что FtsZ гетерогенно распределены вокруг кольца Z в обоих организмов в расположении борта-подобные; решения давней вопрос о том, Z кольцо является непрерывным однородным пояс вокруг клетки, как визуализировать с помощью обычного широкого поля флуоресцентной микроскопии, или прерывистой структуры в соответствии с предложением электронного крио-томографии (ECT) 24. Мы покажем, как способность 3D-SIM может значительно улучшить пространственное рассмотрение крошечный (1Диаметр мкм) округлые клетки, как S. стафилококк, что разделить на три последовательных перпендикулярных плоскостях (х, у, г). Покадровой исследования с использованием этих методов показывают, что структура Z кольца является динамическим, с грубыми изменениями организации в ринге, а не молекул FtsZ движущихся в и из фиксированной эшафот 24.
Protocol
1 Подготовка образцов
- Подготовка B. Сенная Клетки для визуализации
- Посев 10 мл Penassay бульона (PAB, также известный как антибиотическую среду 3) с одной колонии B. Сенная штамм SU570 (168 trpC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-спецификации) 16. Расти в течение ночи в низкой скорости (100 оборотов в минуту) шейкере при 30 ° С.
- Развести ночной культуры до 0,05 A 600 (измеряли поглощение при 600 нм) в пресной PAB при 30 ° С с высокой скоростью (215 оборотов в минуту) встряхивания и не растут до середины экспоненциальной фазы (A 600 ~ 0,4).
- Добавить 2 г электрофорез класса агарозы в 100 мл 1x роста среды (PAB) в стеклянной бутылке с завинчивающейся крышкой. Растворите агарозы в автоклаве. Это можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев, и при необходимости в микроволновой печи, чтобы расплавить агарозу. Разрешить, чтобы установить при комнатной температуре.
- Прикрепите клейкую кадр (65 мкл потенциала; смотрите таблицу материалов) на к стандартному GLAсс микроскопа. Для этого, снять тонкую полиэфирную лист (каждый клей рамка расположена между двумя полиэфирных листов, один тонкий и один толстый, и имеет центр площади удален) и применить открытую клейкую поверхность рамы к поверхности стекло микроскопа. Это эффективно создает квадратное скважины в верхней части слайда. Оставьте полиэфирной лист, прикрепленный к раме, так как это позволит предотвратить покровное приклеить к нему на последующих стадиях.
- не Растопить раствора агарозы в микроволновой печи до кипения и пипетки 67 мкл в липкой кадра. Сразу же место покровное на вершине, чтобы создать плоскую поверхность и оставить при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Удалить покровное в течение 1-2 мин, а образец собирают.
- Урожай с 1 мл аликвоты образца и центрифуге при 5900 х г в течение 30 сек. Слейте супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл свежей PAB.
- Возьмем 2,5 мкл концентрированного образца и пипеткой на предварительно прекрасный агарозном площадку. Распространение образец равномерно вдоль плоской поверхности агарозном площадку. Удалите клейкую кадр из стекло микроскопа, используя пинцет, а не касаясь агарозном площадку.
- Перенести агарозном площадку от предметное стекло в 35 мм диаметр чашки Петри с покровным стеклом дне. Инвертируем агарозном площадку, так что суспензию клеток покровное и в чашке Петри находятся в непосредственном контакте друг с другом. Дно чашки Петри имеет показатель преломления от 1,525 для изображения с высоким разрешением.
- Подготовка Живая S. стафилококк Клетки для визуализации
- Посев 10 мл L-бульона с одной колонии S. стафилококк штамм SA94 (SH1000 содержащий пахотных FtsZ-GFP и pGL485; Эм г, Cm г) 25. Расти в течение ночи в низкой скорости (100 оборотов в минуту) ротационном шейкере при 37 ° С.
- Развести ночной культуры до 0,05 A 600 (измеряли поглощение при 600 нм) в пресной L-бульона с 0,05 мМ IPTG (изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид), чтобы индуцировать выработку слитого белка.
- Инкубировать при 37 ° C с высокой скоростью (215 оборотов в минуту) встряхивания и не растут до середины экспоненциальной фазы (A 600 ~ 0,4).
- Выполните шаги 1.1.3 - 1.1.8, как описано для B. Сенная подготовка живых клеток.
Примечание: Добавить соответствующую концентрацию индуктора в раствор агарозы в шаге 1.1.3 для штаммов, экспрессирующих флуоресцентный белок слияния под контролем индуцируемого.
2 Получение микроскопа
Этот метод использует DeltaVision OMX (оптический микроскоп, экспериментальный) 3D-SIM системы визуализации, оснащенный модулем Blaze. Для описано эксперименты, только один лазер и одна камера используются. Освещение и путь света описаны на рисунке 1. Этот метод предполагает, что микроскоп имеет соответствующую калибровку, оптической передаточной функцией (OTF)файлы и мелкий ремонт коллимации выполняется.
- Для живых экспериментов изображений клеток, убедитесь, что сцена отопление прикрепляется к керамической стадии и цель нагрева воротник крепится к цели (60X 1,42 NA масло объективной).
- Включите объективных и сценических нагревателей по крайней мере 4 часа до контрольного изображений и медленно наращивать температуру до необходимого параметра при максимальной скоростью 5 ° C / час. Рекомендуется, чтобы начать этот процесс вечер до визуализации и нарастить на 3 ° C / 4 час. Для экспериментов живых клеток с B. зиЫШз, большинство эксперименты проводили при 30 ° С. Для S. стафилококк, все эксперименты проводили при 37 ° С.
- В день эксперимента, включить систему, по крайней мере 1 часа до обработки изображений, чтобы позволить системе и лазеры, чтобы полностью стабилизировать. Загрузите малой сцене блюдо вставку на нагретую этапе подогрева.
- Включите станции мастер контроллера.
- Включите обработки изображений workstatионный.
- Включите охладитель камеры, расположенной на полу за пределами корпуса микроскопа.
- Включите все камеры sCMOS (даже если они не все будут использовать).
- Внутри лазерного и корпус для электроники, включите:
- Инструмент управления шасси.
- Nanomotion шасси.
- Йена контроллер для Z пьезо.
- Все контроллеры 4 Galvo двигателя.
- Первичный модуль лазерного контроля.
- Вторичный модуль лазерного контроля.
- Все камеры рабочие станции.
- OMXIC рабочая станция.
- На рабочей станции мастер контроллера, откройте программное обеспечение OMX, нажав на значок. Установите путь к файлу для сохранения в соответствующей папке данных данных.
- Для инициализации оборудования, перейдите в меню Hardware, выберите Оборудование и нажмите кнопку Restart оборудования. Закрыть окно.
- Запустите softWoRx software.Turn на лазеров, необходимых для экспериментов (488 нм).
- Включите замок зажигания для лазерной защитной блокировкой.
- Убедитесь правильный дихроичным фильтром ящик вставляется под цели. Для GFP, это стандарт (или фиксированный) ящик.
- В OMX SF, перейдите в меню Файл выберите Настройки и выберите Fixed ящик из выпадающего меню Ящика. Закрыть окно.
- Выполните следующие действия с главного экрана программного обеспечения, в разделе Легкие Параметры:
- Активируйте соответствующую камеру для лазера возбуждения и фильтр твердых (FITC) камеры от выбора канала.
- Проверьте изображение режима установлен в последовательном.
- Проверьте Light Path установлен в СИ.
- Проверьте режим установлен в 95 МГц.
- Проверьте 488 лазера выбирается в возбуждении.
- Установите
- На вкладке эксперимента, обеспечить Тип установлен в СИ из выпадающего меню.
- Убедитесь, Секционирование активируется и что расстояние между оптической части установлен в 0,125.
- Убедитесь, фокусной точки, когда начинается сканирования является средний.
3 Image Acquisition
- Нанесите каплю масла на верхней части объектива. Для 37 ° С, рекомендуется, начиная масло имеет показатель преломления от 1,518 наиболее подходящий для преломления площадку гель используется для монтажа бактериальных клеток при 37 ° С (обратитесь к шагу 1.1.3).
- Поместите образец чашку Петри, содержащую готовые клетки в стадии вставке и накрыть круговой отопления крышкой. Опустите этап, пока масло не коснется днаобразец чашку Петри.
- Разрешить блюдо, чтобы нагреть в равновесие в течение 15 мин в стадии. Используя низкую настройку экспозиции из 5 мс или меньше (расположенной в разделе Легкие Параметры), сосредоточиться на образце с помощью нано позиционирования сценические элементы управления (DZ, расположенной в разделе Nano Positioning). Фокус вверх и вниз через образец, чтобы определить, свет распространяется равномерно сверху и снизу образца фокальной плоскости. Если функция размытия точки даже не (сферической аберрации), очистить дно образца блюдо и цель с хлороформом. Замените масло и повторить этот шаг до тех пор, подходит не будет найдено совпадение между нефтяной и образца показателя преломления, чтобы минимизировать сферическую аберрацию.
- Использование 0,5 мкм DZ размеры шагов, отметьте верхнюю и нижнюю часть стека изображений. Возвращение в середине образца. Нажмите кнопку Получить Толщина на вкладке эксперимент, чтобы установить толщину приобретения образец. Keeр, что высота стопки до минимума то время будьте осторожны, чтобы не отрезать верхнюю и нижнюю часть Z-колец. Типичная толщина для B. Образцы SUBTILIS являются 2-3 мкм.
- Определите максимальное значение интенсивности (Макс) изображения образца с текущими параметрами экспозиции и% T. Это значение находится ниже окна изображения. Для покадровой обработки изображений, настраивать экспозицию и% T, чтобы получить максимальную интенсивность 1,100-1,400 выше фона для изображения. Минимальная интенсивность 1000 вышеизложенного необходимо получить реконструкции изображения. Для единовременного изображения, увеличить максимальную интенсивность в 4000-5000.
- Активируйте раздел Покадровый на вкладке эксперимента. Установить необходимое частоту кадров и общее время. В файл данных, введите соответствующее имя файла. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать сканирование изображения.
Примечание: Получение изображений завершена, когда гReen Индикатор завершена и появится файл журнала для установленных в соответствующей папке данных данных.
4 Проверка качества данных
- В начале получения изображения, обратите внимание, максимальное значение интенсивности изображения в начале получения изображения для первого кадра временного ряда. В конце приобретения первого кадра, проверить, что там не было больше, чем 10% снижение интенсивности сигнала через Z-стека для этого первого кадра. Если прошло более этого уровня фотообесцвечиванию в первой точке времени, данные через временного ряда будет недостаточного качества для анализа и приобретение раз серия может быть остановлен.
- В конце приобретения временного ряда, откройте полученный файл необработанного изображения с .DV суффикса и установить уменьшение максимальной интенсивности сигнала от начала временного ряда до конечного изображения. Откажитесь от любых временных точек, где есть пчелун более 30% фотообесцвечивание.
5. Восстанавливающий 3D-SIM изображения
- В меню Process, активировать окно С.И. Реконструкция. Используйте уже существующие настройки для всех параметров.
- Нажмите на кнопку, Удельная OTF использования канала, и устанавливается в стандартный набор фильтров. Активируйте конкретного использования канала KO углов кнопку и установить в стандартный набор фильтров.
- Перетащите сырой (.DV) файл на вход файлового пространства. Нажмите Сделайте это. Выходной файл будет иметь то же имя, как входной файл с _SI добавляется в конце.
Примечание: Этот процесс реконструкции может быть запущен в качестве задачи с помощью функции Задание Builder в меню Process, если несколько файлов должны быть обработаны.
6 Экспорт и анализ данных
- Используйте Imaris визуализировать 3D-изображения в режиме и экс превзойтиДанные портовые изображение как TIFF (300 точек на дюйм) или AVI файлов (без сжатия). Измерения в дюймах в Imaris могут быть выполнены с помощью инструмента измерений в режиме превзойти.
- Создание 3D графики интенсивности Z кольца от данных изображения 3D-SIM:
- Изучить распределение FtsZ вокруг Z кольца и для создания 3D-графики интенсивности
- Откройте 3D-файл изображения для просмотра отдельных Z-срезов. Используйте инструмент объем просмотра, расположенную на вкладке меню Вид, чтобы обрезать область интереса.
- Введите номер окна для этого 3D-изображения в окне ввода и ввести новое и неиспользуемый номер окна в окне вывода. Кнопка выбора регион станет доступен обрезать индивидуальный Z кольцо интереса от первоначального 40 × 40 мкм поле зрения.
- Отрегулируйте необходимую ось и угол поворота на вкладке вращения. Нажмите кнопку Do It. Прокрутка объема, чтобы получить желаемую перспективу Z кольца.
- Используйте инструмент инспектор данные и приспособить тон размеры колонки / строки, чтобы создать новую область интереса вокруг отдельного Z кольца. Нажмите центр изображения позиционировать эту новую область интереса. Данные Текст изображение автоматически стол, который отображает интенсивность флуоресценции каждого пикселя в интересующей области.
- Нажмите кнопку 3D графика, чтобы изначально смотреть сюжет интенсивности.
- В качестве альтернативы данные текстовых изображений могут быть экспортированы, нажав на кнопку Сохранить данных таблицы, в меню файла.
- Скопируйте данные изображения из сохраненного текстового файла в новый электронную таблицу. Выберите все ячейки в электронной таблице и создать новый 3D-поверхности график. Форматирование 3D участок интенсивность график для публикации.
- Для повторения данных покадровой шаги 6.2.1.1 - 6.2.1.7 на каждом из различных временных точках из файла 3D изображения.
- Изучить распределение FtsZ вокруг Z кольца и для создания 3D-графики интенсивности
- Отслеживание средней интенсивности флуоресценции с течением времени
- Используйте данные изображение текста для отслеживания fluorescenИнтенсивность CE с течением времени в интересующей области.
- Выделите ячейки, которые соответствуют интересующей области.
- Рассчитать среднюю интенсивность флуоресценции в каждый момент времени для этой области, представляющей интерес.
- Используйте средние значения интенсивности флуоресценции для создания отдельной линии графика.
Representative Results
В этом исследовании мы визуализировали бактериальной деление клеток белок FtsZ, выразил в живых клетках в качестве FtsZ-GFP слияния, чтобы проиллюстрировать мощные преимущества F3D-SIM по сравнению с обычными флуоресцентной микроскопии для изучения бактериальной локализацию белка и динамики. FtsZ является тубулин-цитоскелета, как белок, который полимеризуется в динамической структуре кольца по окружности клетки. Z кольцо имеет важную функцию в делении клеток: его сборка отмечает будущий сайт деления, он вербует все белки деление клеток на этом сайте, и Z кольцо сужение представляется, обеспечивает силу, чтобы внутрь движения клеточной оболочки во время клеточного деления 17 , 18.
При визуализировали с помощью обычного широкого поля флуоресцентной микроскопии, Z кольцо выступает в качестве одной поперечной полосы флуоресценции в палочковидные бактерии, в том числе наиболее хорошо изучен организмов, таких как B. зиЫШз (2А), <EM> E. палочка, и C. crescentus. Важно отметить, что интенсивность флуоресценции всей этой группы, кажется, более или менее однородной, и картина локализации предлагает очень мало понимания в структурной организации и распределения FtsZ полимеров в рамках Z кольца. Когда те же самые клетки исследовали с помощью метода F3D-SIM, описанный здесь (фиг.2В), однако, преимущества данной методики являются сразу. Во-первых, вращение изображения 3D-SIM вокруг оси позволяет визуализацию Z кольца в качестве подлинного кольцевой структуры в трехмерном пространстве (Цифры 2C и 3A). Вместе с увеличением разрешения, это показывает, что распределение FtsZ в кольце Z, на самом деле весьма неоднородны (фиг.3). Улучшение разрешения также позволяет нам видеть Z кольца, которые начали процесс сужения сформировать разделением перегородку (обозначается инвагинации клеточной мембраны в <сильная> фиг.2С и 2D).
Дополнительные примеры B. Сенная Z кольца визуализированы с помощью этого метода показаны на рисунке 3Bi - 3Biv и показать, как интенсивность флуоресценции вокруг Z кольца никогда не то же самое. Кроме того, регионы очень низкой интенсивности флуоресценции часто наблюдаются. Мы называем эти регионы как пробелы (белые стрелки). Мы наблюдаем эти пробелы в 15% всех Z колец обследованных (п = 84) и преимущественно в Z колец, имеющих диаметр 800 - 900 нм (93%). Для количественной оценки этих наблюдений, 3D графики интенсивности были созданы из Z кольца и показаны на рисунке 3Ci и 3Cii использованием Z кольца, показанные на рис 3Biii и 3Biv. Интенсивность графики показывают, что, как правило, количество флуоресценции в Z кольца может меняться до 3 - 4 раза в разных регионах B. Сенная Z кольцо. Кроме 3D-графики интенсивности показывают, что гапс флуоресценции внутри Z кольца почти читать базовые уровни фоновой флуоресценции (черная стрелка на рисунке 3Ci). Приведенные выше примеры относятся хорошие реконструкций Z кольца и зависят от достаточно свет, излучаемый из образца без значительного фотообесцвечивания. Это достигается с помощью яркости GFP флуорофором слитого с FtsZ и обилием в клетке в этих условиях (высокая сигнала к шуму). В других клетках, где отношение сигнал-шум низок реконструкция изображения оставляет желать лучшего. Для имитации этого явления с FtsZ-GFP, на сумму эмиссионного сигнала, собранной из B. SUBTILIS клетки была снижена за счет снижения энергии возбуждения. Как показано на рисунке 3D на 100 кратное снижение результатов энергии возбуждения в образе Z-кольца, который имеет значительные артефакты. Это происходит в результате недостаточного местного контраст между FtsZ-GFP сигнала и фона, ведущей к пуг реконструкция изображения.
Интересно, что Б. Сенная Z кольца показали более выраженные пробелы и неоднородность в верхней и нижней областях кольцо, но не в сторонах кольца (Рисунок 3В). Это происходит вследствие разницы в разрешении, достигнутый этом варианте 3D-SIM в латеральной плоскости по сравнению с осевой плоскости. Это приводит к верхней и нижней регионах Z кольца (латеральной плоскости) изображаемого с оптимальным разрешением. Пробелы в Z-кольца слишком малы, чтобы быть обнаружены в сторонах Z кольца, как визуализируются в осевой плоскости, которая имеет около половины разрешение латеральной плоскости. Бактерии, имеющие кокковидные морфологию, такие как S. стафилококк, у Z кольца, которые расположены во всех плоскостях. Так визуализации Z кольцо, когда она лежит в латеральной плоскости (или близкой к ней) предоставляет возможность изображения все регионы кольца с оптимальным разрешением. Воспользовавшись этим, мы рассмотрели структуруZ кольцо в живом S. стафилококк клетки, используя штамм, который содержит плазмиду-несущий FtsZ-GFP слияние. Производство этого синтеза находится под контролем Р УПП индуцируемого промотора (смотри шаг 1.2.1). При полученную с в осевой плоскости, S. стафилококк Z кольца появились идентичны B. SUBTILIS Z кольца, которые присутствуют в той же плоскости (рисунок 4AI). Тем не менее, изображения Z кольца в боковой плоскости подтвердил, что вся Z кольцо появилось как шарик-как и неоднородны. Около 26% из этих колец также показал хотя бы один видимый "пробел" флуоресценции (Рисунок 4Aii, 4Б). Подобно В. Сенная FtsZ, интенсивности флуоресценции графики показывают, что интенсивность флуоресценции в Z кольца варьируется целых 4 - 6 раз в разных районах S. стафилококк Z кольцо (Рисунок 4C).
Длина и ширина гранул могут быть измерены (см также рисунок 4D). Это показало, что 80% из Z колец (N = 43), которые были рассмотрены имел длину валика 200 нм, достигая максимальную длину 400 нм. Ширина шариков, а с другой стороны, измеренный до 200 нм. Был в среднем 12 ± 2 (SEM) FtsZ шариков на Z кольца. Аналогичные данные локализации наблюдалось, когда родной FtsZ визуализировали с помощью этих методов с использованием иммунофлуоресцентного микроскопа (IFM), показывающий, что это гетерогенным и шарик, как образец был локализации подлинным, а не искажение, вызванное за счет экспрессии FtsZ-GFP, в дополнение к нативной FtsZ (данные не показано). Это продвижение 3D-SIM сможет показать, что Z кольцо появляется как гетерогенной структуры и, возможно, прерывистый характер.
Для решения вопроса о том, как это гетерогенная Z-кольцевая структура претерпевает сужение и облегчает клеточное деление, покадровой анализ динамики Z кольцевых может быть выполнена. Одной из основных проблем, сфлуоресцентной микроскопии покадровой исследования находится в минимизации образца фотообесцвечивания и фототоксичности во время съемки. 3D-SIM-требуется большое количество необработанных изображений, чтобы получить это означает, что фотообесцвечиванию образца с течением времени приводит к плохим отношением сигнал-шум, ведущей к недостаточной сигнала, чтобы соответствующие реконструкции изображения. Применение новой технологии сводит к минимуму количество энергии возбуждения, используемый для каждого воздействия и, следовательно, к уменьшению энергии, поступающей в живые клетки. Она делает это путем сочетания света интерферометрии пучка, чтобы создать структурированный шаблон на образец и использование научных камер CMOS, которые увеличивают чувствительность и квантовую эффективность. Такое сочетание приводит к приобретению г-стека 1 мкм в секунду (512 × 512 пикселей х 8 Z-срезов) по сравнению с 1 мкм на 5-8 сек (512 х 512 пикселей х 8 г-ломтиками), полученного с нашей предыдущей итерации 3D-SIM (описано в Riglar соавт. 26).Уменьшение времени захвата изображений и настройки экспозиции также может помочь минимизировать фототоксичность живых клеток, что особенно актуально в покадровой исследований. Новая технология, представленная здесь также рассматриваются еще одну проблему в визуализации живых клеток, что мы называем «размытость», который в этом контексте относится к локализации белков изменяющихся во захвата изображений. Уменьшая время захвата изображений количество 'размытость' минимизируется создавая тем самым более точную реконструкцию изображения.
Предыдущие исследования, которые адресованы как FtsZ организован в рамках Z кольца не смогли показать, как структура Z кольцо меняется со временем. Для исследования этого аспекта мы провели цейтра- используя F3D-SIM. Это позволило приобретение 3D-SIM образа Z кольца в B. зиЫШз каждые 5-10 секунд в течение 50 сек, которое было ранее невозможно на этой временной шкале. Показано на рисунке 5А является examplе быстрых изменений в распределении FtsZ в пределах Z кольца с течением времени (диаметр 890 нм). Другие Z кольца, которые были заметно в процессе сужения Было также показано, имеют аналогичные динамики, которые влияют на распределение FtsZ вокруг Z кольца (не показано). 3D графики интенсивности также может быть создан для каждого из временных точек для количественного и оценить постоянные изменения интенсивности флуоресценции и, таким образом, относительное обилие FtsZ в различных регионах Z кольца на шкале времени секунд (Рисунок 5Б). Интересующие регионы могут быть идентифицированы из этих участков интенсивности, чтобы отслеживать колебания интенсивности флуоресценции (фиг.5С). Отслеживание этих изменений в Z кольцевой структуры в этих условиях будет практически невозможно без передовых технологий F3D-SIM. Кроме того, эта работа показала, что в S. стафилококк динамический движение FtsZ является такой же, наблюдается в B. Сенная. С. клетки стафилококка RN4220 прoducing FtsZ-GFP были обследованы 50 сек при 10 часовых сек интервалами. Изменения в неоднородности Z кольца в S. стафилококк с F3D-SIM были также похожие на B. Сенная (см наконечники стрел и стрелки на рисунке 6). Эти упущения времени исследования подтверждают модель Z кольца сужение (итеративной модели щипать), что было предсказано путем изучения фиксированной C. crescentus клетки, но не может быть продемонстрировано в связи с необходимостью изучения динамики Z-кольца в живых клетках 27.
Рисунок 1 Схема оптической конфигурации F3D-SIM, используемых в данном исследовании. Лазерный свет от лазерного таблице направляется через SIM волокна к коллимирующей линзы и фиксированной решетки, а затем в модуль управления фазой, что создает и определенную длину волны Оптимальное расстояние между ое на ± 1-й порядка лучей от центрального луча нулевого порядка и этапов фазовых для сбора SIM. Балки затем введите модуль управления угол, где лучи отражаются в 3 различных кластеров для создания 3 углы освещения. Балки затем введите микроскоп и путь, как показано света (Modified с разрешения Пола Гудвина, API).
Рисунок 2 Сравнение обычной флуоресценции широкого поля и визуализации 3D-SIM от B. Сенная клетки, экспрессирующие FtsZ-GFP. (А) Обычная широкого поля флуоресценции визуализации B. Сенная клетки, экспрессирующие FtsZ-GFP (SU570; зеленый) как единственном экземпляре были также окрашивали мембранного красителя FM4-64 (красный). Шкала бар = 5 мкм. Снимок был получен с помощью вертикально флуоресцентного микроскопа.(Б) 3D-SIM-изображений одного и того же В. Сенная штамм выражая FtsZ-GFP, окрашивали FM4-64. Интересующие регионы от изображения может быть выбран (пунктирная окно) для увеличения. Изображение также может поворачиваться вокруг оси, чтобы просмотреть, кольца 3D FtsZ в осевой плоскости. (C, D) удаление не посещающих фокусировки и улучшенный разрешение изображения обеспечивается 3D-SIM позволяет четкую визуализацию Z колец (в том числе те, которые стягивающий) и внутренней клеточной мембраны во время разделения (обозначены белыми стрелками). Обратите внимание, что текст протокола описывает визуализацию одного флуорофором. Тем не менее, эта процедура может быть приспособлена для получения до четырех различных длинах волн одновременно. Эта цифра была перепечатана от Штрауса и др 16.
Рисунок 3. Типичные изображения на Z кольца в живых палочковидных клеток бактерий (B. Сенная), выражающей FtsZ-GFP с использованием 3D-SIM. (Ai) Z кольцо наблюдается в виде полосы флуоресценции перпендикулярно длинной оси клетки, которая находится в плоскости ху. (Aii) Образ был повернут вокруг оси Z с помощью программного обеспечения Imaris 3D визуализации (обратитесь к протоколу шаг 6,1) так, что один смотрит в кольцевой структуры четко видеть, как FtsZ распространяется в Z кольца. Этот образ, в настоящее время в серии ZX плоскости показывает, что кольцо имеет неоднородное распределение FtsZ с регионами нет или очень мало флуоресценции (белые стрелки). Изображение должно быть повернут соблюдать эти «пробел» регионы флуоресценции. Би-Biv показать дальнейшие примеры повернутых Z колец, которые сейчас лежат в гх плоскости. Z кольца в (би-III) имеют диаметр ~ 0,9 мкм. (BIV) показывает Z кольцо с диаметром ONLу 0,65 мкм проходит сужение. (C) Это типичный профиль интенсивности 3D иллюстрирует интенсивность флуоресценции (т.е. концентрации) различия в FtsZ-GFP вокруг Z кольца, имеющего диаметр 0,85 мкм (смотри протокол шаги 6.1-6.3). Уровень флуоресценции в этих пробелов низка и приближается фоновые уровни флуоресценции (черная стрелка). (CII) Аналогичный профиль интенсивности 3D из Z кольца в процессе сужения. Концентрация FtsZ-GFP также неравномерное; Диаметр, 0,65 мкм. Панели A, B, CI и Cii были перепечатаны из Штрауса и др 16.
Рисунок 4. представитель 3D-SIM образы S. стафилококк клетки, продуцирующие FtsZ-GFP. Поскольку эти клетки являются раунд (кокки), Z кольцо будет ВГАэлектронной различные ориентации. Клетки, которые показывают полосу флуоресценции в нормальной ориентации просмотра (то есть, в плоскости ху), как показано на (AI), очень похожи на те, в палочковидных клеток при вращении вокруг оси Z. как для рис 1AI. В (ОКИ) Z кольцо уже в плоскости; боковая ориентация и разрешение является максимальным за весь кольца, которое теперь дает шарик-подобную структуру (B). (C) 3D участок интенсивность относительной численности FtsZ-GFP в Z кольца. (D) Схематическое представление S . стафилококк Z кольцо. Красные стрелки указывают длину борта и ширины (см протокола шагом 6,1). Эта цифра была изменена от Штрауса и др 16.
<сильный> Рисунок 5 F3D-SIM позволяет быстрый анализ локализации FtsZ с течением времени в 3D-SIM. (A) Изменения в распределении FtsZ-GFP в пределах Z кольца в форме стержня В. Сенная клетки могут быть визуализированы, чтобы указать динамику кольца. Время (сек) указывается в верхнем левом углу каждого изображения. (B) интенсивности 3D флуоресценции графики показывают неравномерный и динамическое распределение FtsZ в Z кольца. (C) динамика FtsZ (FtsZ-GFP изменения флуоресценции в кольцо) могут быть также рассмотрены более подробно с помощью количественной оценки интенсивности флуоресценции с течением времени в двух областях, представляющих интерес. Эта цифра была перепечатана от Штрауса и др 16.
Рис.6 F3D-SIM покадровой изображения показывают изменения в локализации FtsZ внутри кольца с течением времени в S.ureus. белого стрелка указывает на разрыв, когда он первоначально обнаружены в Z кольца. Появление и исчезновение пробелов в том же положении (как отмечено белой стрелки) с течением времени, как показано FtsZ перераспределяется вокруг Z-кольца. Белые стрелки указывают на образование зазоров в Z кольца в более поздние моменты времени. Время (сек) показан на верхней стороне левой изображений. Эта цифра была изменена от Штрауса и др 16.
Discussion
Флуоресцентные изображения живых клеток является мощным инструментом, который позволяет изучать динамические изменения в клетках с течением времени. Живая съемка бактериальной клеточной биологии был сложным по причине малого размера ячейки и снижается способность бактериальных клеток противостоять многократным воздействием возбуждающего света. F3D-SIM расширила инструменты, доступные допросить все клеточной биологии, но надо тщательно выполнять эту технику как артефакты могут быть введены, если плохо реализован. Есть ряд важных соображений для успешного использования этой техники. Как это метод визуализации флуоресценции широкого поля, которая опирается на использование функции рассеяния точки излучаемого света, преломления несоответствия и сферической аберрации излучаемого света следует избегать, чтобы позволить точную реконструкцию изображения. Использование покровные от 0,17 мм толщины высокого качества, чтобы избежать изменение интенсивности сигнала вследствие изменчивости толщины стекла в крышкахгубы очень рекомендуется. Крайне важно, чтобы тщательно оценить сферическую аберрацию излучаемого света на начальных этапах всех экспериментов и отрегулируйте погружения индекс масло преломления по мере необходимости. Это может варьироваться от изо дня в день, как это зависит как от температуры и монтажной медиа / субстрата в образце. Использование неправильного масла приведет к ухудшению реконструкции изображений с артефактов, таких как гало и эхо-сигналов.
В конце процесса восстановления изображения, для каждой фазы мера качества реконструкции могут быть получены с помощью "наилучшим образом подходит для угла Ко" для каждой фазы / угле освещения. Если это значение ниже 1 для каждого угла, то качество реконструирован скорее всего, будет высокой. Если это значение выше 6, то, скорее всего, что восстановленное изображение будет содержать артефактов. Общие артефакты включают I) появление полос на изображении, которые соответствуютк одному из углов сетки. Это может быть результатом ниже сигнал с этого угла сетки; II) ореолов вокруг структур. Это может быть результатом очень неровных уровней сигнала от ярких структур по сравнению с окружающими структурами, несоответствие показателя преломления нефти и образец или может быть связано со структурами в образ слишком аморфным и не содержащие достаточно "структуру", чтобы быть обнаружено алгоритмом; III) 'сотовое », которая является результатом низкой сигнал-шум на изображении, как правило, в связи с высокой фонового сигнала; IV) структуры, которые простирались / удлиненные в ху, которые могут быть связаны с показателем преломления несоответствия нефти и образца. Этот артефакт трудно различить для неопытного пользователя. Рекомендуется новые пользователи проконсультироваться у опытного SIM исследователя за советом по интерпретации и анализа изображений, когда начинают использовать эту технику.
Как и во всех люминесцентных экспериментов изображений живых клеток, это импортмуравей тщательно сбалансировать подачу энергии возбуждения для того, чтобы свести к минимуму степень фотообесцвечиванию и фототоксичность из клеток с достаточной сигнала излучения, необходимого для восстановления изображения с минимальным артефакта. Чрезмерное фотообесцвечивание (больше, чем на 30% по одной приобретение Z-стека) приведет к чередование шаблона в восстановленном изображении. При использовании камер sCMOS, изображения супер-разрешения может быть успешно восстановлены из необработанных изображений с эмиссионного сигнала столь же низко как 1000 количеству выше фона. Это может позволить за очень короткое время экспозиции, тем самым уменьшая фотообесцвечивание и позволяет быстро захвата для каждого кадра. Это также увеличивает количество времени между кадрами для клетки, чтобы оправиться от потребляемой энергии возбуждения. Кроме того, как время захвата для каждого отдельного кадра может быть очень коротким, степень артефакт, введенной 'размытость' во индивидуального захвата уменьшается с использованием этого метода.
Это Варивания из 3D-SIM предлагает ряд других преимуществ по сравнению с другими доступны сверхпроводников и изображений с высоким разрешением технологий для живого изображения бактериальными биологов клеток. Увеличение 2 раза в разрешении во всех 3-х измерениях и способность к изображению до 30 мкм в образце дает визуализации целых бактериальных (и млекопитающих) клеток в процессе эксперимента. Такие методы, как локализация одиночных молекул, которые обычно выполняются в запредельном волны не может достичь глубины проникновения в образец и не предоставляют информацию о целых клеток. Последние достижения, которые позволяют более высокие глубины выборки для этой техники может привести к более высоким разрешением осевой целых клеток. Кроме того, методы локализации одиночных молекул, которые требуют тысячи необработанных изображений, которые будут приобретены также ограничены в частоте кадров, что могут быть захвачены и может потребовать компромисс между частотой кадров захвата и конечной достигнутой пространственным разрешением, как пространственное разрешение зависит от количество наканунеНТС, записанные в течение определенного пространства. Уменьшение количества захваченных кадров приведет к более низким пространственным разрешением, но может быть достаточным для достижения временное разрешение, необходимое для биологического процесса, представляющего интерес. Количество времени восстановления между кадрами может также должны быть увеличены, чтобы минимизировать фототоксичность в живых клетках, тем самым, ограничивающих продолжительность и частоту, с которой временной ряд может быть получена. Методы высокого разрешения, такие как электронная микроскопия (ЭМ) или электронного cryotomography (ДЭХ) предложение увеличилось разрешение над 3D-SIM (и других оптических методов микроскопии сверхвысокого разрешения), но должны быть выполнены на основных образцов. Фиксирующее и обработка может ввести артефакты и отсутствие маркировки может сделать трудным интерпретации. Этикетка свободной ЕСТ имеет слабый контраст и может достигать глубины проникновения образец вокруг 500-200 нм 24, так что даже если представляющий интерес белок может быть идентифицирован, не может быть обнаружено структура белка в целом бактериальной клетки.Даже тогда, когда маркировка может быть использован в EM, например, с immunogold, изображения выполняется только в 2D. 3D достигается только с тонкой срезов и вычислительной реконструкции участков. Тонкая секционирования требуется опытный специалист, но может быть проблематичным и привести к артефакту. С живой или фиксированных клеток, 3D-SIM-не должны быть встроены в определенном порядке, и клетки могут быть быстро подготовлены для визуализации в ближайшем нативном состоянии.
Этот метод относительно легко реализовать с помощью исследователей с минимальным опытом в флуоресцентной микроскопии. Эксперименты могут быть выполнены в средствах массовой информации, которые поддерживают здоровую функцию клеток тех пор, пока она не флуоресцируют или генерировать чрезмерное фоновый сигнал. Для бактериальных клеток, это может позволить использование многих типов сложных и минимальной среде или с использованием твердых или полутвердых сред для контроля бактериальной клеточной подвижности. Многие биологи, которые уже инженерии флуоресцентный белок (FP) слияния и проверенные функциональные возможностиЭти гибриды могут взять на себя эту технологию быстро без дальнейшего проектирования и проверки с новыми фотоактивируемых слияний ПС. Мы нашли, как общее наблюдение, что С. стафилококк был более восприимчивы к фотообесцвечивания во время съемки с ПС слияний, чем B. Сенная. Используя наши оригинальные методы 3D-SIM, где картина сетка, генерируемые физической решетки, мы были не в состоянии выполнять изображений живых клеток с числом S. стафилококк FP слияния. Тем не менее, с этой передовой метод F3D-SIM, мы смогли изображения эти FP слияния и выполнить короткий временной ряд, чтобы захватить динамику этих меченых белков. Это, скорее всего, за счет снижения времени экспозиции, необходимых для работы с изображениями и увеличилось время между кадрами для восстановления клеток.
OMX Blaze 3D-SIM является коммерчески доступная технология, которая может быть относительно легко реализованы в одной лаборатории или объекта ядро визуализации. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы выполнять технику, чтобы избежать Artiфакты, связанные с плохой подготовкой образца или плохой захвата изображения. После того, как этот метод освоен, исследования структуры белка и динамика в небольших организмов, таких как бактерии могут быть выполнены в одном или многоцветной флуоресценции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media. |
| N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
| 1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization. |
| Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving. |
| BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
| Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm). |
| Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22 x 22 No. 1 Thickness |
| 35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol. |
| Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Combined orbital/linear shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
| UV visible spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use. |
| softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
| Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
| DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |
References
- Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison. Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving. Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).
- Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens. Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).
- Urban, N. icolai T., Willig, K. atrin, Hell, S. tefan W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).
- Strauss, M. P., et al. 3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis. PLoS biol. 10, e1001389 (2012).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. J. Advances in understanding E coli cell fission. Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).
- Erickson, H. P. Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).
- Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One. Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).
- Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).
- Murphy, G. E., Jensen, G. J. Electron cryotomography. BioTechniques. 43, 413-415 (2007).
- Liew, A. T. F., et al. A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus. Microbiology. 157, 666-676 (2011).
- Riglar, D. T., et al. Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte. Cell Hos., & Microbe. 9, 9-20 (2011).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).
