Abstract
Floresan mikroskobu kullanarak biyolojik numunelerin görüntüleme canlı örneklerinin süper çözünürlük sağlayan ışık kırınım çözünürlüğü engeli aşmak için yeni teknolojiler ile büyük ölçüde ilerlemiştir. Uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), (örneğin PALM, FIRTINA ve GDSIM gibi teknikler de dahil olmak üzere) tek-molekül yerelleştirme mikroskopi ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) - süper çözünürlük teknikleri üç ana türü vardır. STED'in ve tek-molekül yerelleştirme teknikleri çözünürlükte büyük artışlar gösterirken, onlar görüntü elde artan hızları sunmak için yavaş olmuştur. Üç boyutlu bir SIM (3D-SIM) tek bir molekül lokalizasyonu ve, her iki STED'in üzerinde bir dizi avantaj sunan bir geniş alan floresan mikroskobu tekniğidir. Çözünürlük için izin, lamel tipik yanal ve eksenel 110 çözünürlükte ve 280 nm, sırasıyla ve en fazla 30 mikron örnekleme derinliği ile geliştirildiBütün hücrelerin görüntüleme. Anlamlı fotoğraf-toksisite ve photobleaching düşürürken ham görüntüleri yakalama oranını artırarak teknolojisindeki son gelişmeler (hızlı 3D-SIM), saniyede meydana gelen biyolojik süreçlerin hızlı yakalamak için izin verir. Burada görüntü hücrelerin analiz edilir göstermek için bir floresan etiketli cytokinetic FtsZ protein ve bu teknik sağlayabilir özgü bilgi tipini barındıran bakteri hücreleri böyle bir yöntemin kullanılmasını tarif eder.
Introduction
Farklı görüntüleme teknolojilerinin çok sayıda çeşitli elektron ve optik mikroskopi teknikleri dahil bakterileri incelemek için yılda kullanılmıştır. Elektron mikroskobu derece yüksek çözünürlüğü sunarken, nanometre aşağı, bir vakum ve kontrast maddelerin kullanımı için ihtiyaç sabit ve gömülü dokulardan için bu tekniği sınırlıdır. Eserler de nedeniyle uzun numune hazırlama ve yetenekli bir uygulayıcı örnekleri hazırlamak, ve elde edilen görüntüleri analiz etme ve yorumlama için gerekli sokulabilir. Optik mikroskopi basit örnek hazırlama ve elektron mikroskopi ile karşılaştırıldığında nispeten kolay bir şekilde birden fazla etiket uygulama avantajları sunar. Floresan proteinler ve boya karışımları, floresan mikroskobu ile canlı hücreleri üstünde çalışılmasını sağlar kullanılması da mümkündür. Kamera algılama Techn hücre toksisitesi, hem de gelişmeler azalmasına yol açan florofor kararlılık ve floresan protein boyut / yapısında iyileştirmelerleology, geniş alan ve konfokal görüntüleme sistemleri kullanılarak floresan mikroskopi anlamlı hücrelerin mekansal dinamiklerini anlamamızı sağlamıştır. Bu teknikler kullanılarak, son 20 yılda bakteri hücresi bilgimizi bakteri hücresi 1 içinde yapısal ve protein örgütün üst seviyede ortaya çok daha detaylı bir görünümüne büyük ölçüde ilerlemiştir.
Bununla birlikte, optik mikroskopi için geleneksel yöntemler doğal çözünürlüğü, kullanılan uyarım ışığının dalga boyu yaklaşık yarısı olan, yani kırılma sınırlıdır. Sonuç olarak, hatta en uygun geleneksel optik mikroskop sistemi ile, en iyi yanal çözünürlük yaklaşık 220-250 nm ve eksenel çözünürlük yaklaşık 500 nm (inceleme için Schermelleh vd. 2 bakınız). Özellikle bakteriyel hücre biyologlar için bu hala ciddi bu küçük hücrelerin mekansal organizasyon anlayışımızı sınırlar; çapı yalnızca 1-2 mikron olmaketresi ve uzunluğu 1-10 mikron. Bir proteinin, dinamik uzaysal davranışı in vitro verileri tamamlamak için analiz edilebilir canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir yüksek çözünürlük teknikleri için bir ihtiyaç söz konusudur.
Geçtiğimiz on yıl içinde, birkaç süper-çözünürlüklü floresan görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Süper çözünürlük mikroskopi geleneksel ışık mikroskopisi ile elde edilebilen en az iki yanal çözünürlüğü, böylece kırılma bariyer üstesinden görüntüleme teknikleri tarif etmektedir. Bu teknikler belirgin çözünürlükte gerçek artış oluşturmak için yayılan ışığın ışık ve / veya analiz işlemek. Süper çözünürlük teknikleri üç ana türü vardır - i) emisyon tükenmesi mikroskobu 3 (STED) uyarılmış; Böyle fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu 4,5 (PALM), Stokastik optik yeniden mikroskop gibi teknikleri de dahil olmak ii) tek-molekül yerelleştirme mikroskopi,
Üç boyutlu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) yaklaşık 110 ve 280 nm, sırasıyla çözünürlüklerde sonuçlanan hem yanal ve eksenel çözünürlüğünü arttıran geniş alan tekniktir. Örnekleme derinliği Bütün hücrelerin görüntüleme için izin lamel 30 um kadardır. Optik mikroskop kullanılarak, deneysel (OMX) platformunda Sedat, Agard ve Gustaffsson tarafından geliştirilen 3D-SIM'in birbirlerinden farklı, 15 hareket eden bir bilinen bir ızgara deseni ile Numuneyi aydınlatan içerirHer bir Z düzlemi 9-11 konumları arasında olabilir. Gözlemlenebilir bölgenin dışında frekans alanı oluşturulur edilen Moire desen saçaklar ölçülür. Frekans uzaydan bilgiler görünür süper-çözünürlüklü görüntü 10,11 oluşturmak için hesaplama yeniden olduğunu. Ham görüntüler bu tekniği kullanarak elde edilebilir hangi göreli hız canlı hücre görüntüleme sağlar. Bununla birlikte, saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde meydana gelen biyolojik süreçler için, ham görüntülerin elde oranı hala dinamik değişiklikleri yakalamak için çok yavaş olduğuna dikkat etmek önemlidir. Saniyelik bir yakalama oranıyla zaman serisi için, yeterli toparlanma süresi olmadan tekrarlanan toplama özellikle küçük bakteri hücreleri canlı görüntüleme sırasında, fototoksisite ve photobleaching yol açabilir.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, hızlı 3D-SIM (F3D-SIM) için son gelişmeler geliştirilmiştir. Burada ben oldu OMX Blaze 16 olarak bilinen birini betimlemekBu teknoloji, önceki sistemlerinde kullanılan gibi fiziksel bir ızgara kullanılmadan desenli aydınlatma 2011 sonlarında oluşturur ntroduced. Işık ışınlarını ve yeni teknoloji çekim müdahale kullanılması çok hızlı bir şekilde, numune üzerinde desenli ışığın oluşturulmasını sağlar. Mevcut EMCCD kameralara kıyasla görüntü elde hızı daha da özellikle, bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kameraların tanıtımı ile geliştirilmiştir. Bu değişiklikler saniye 16 içinde meydana hücrelerin içindeki dinamik değişikliklerin izlenmesini sağlayan, 1 mikron (512 x 512 piksel, 9 z-dilim) bir örnekleme derinliği saniyede bir çerçeve olası bir görüntü elde etme oranı sonuçlandı. Belirgin maruz kalma (uyarma) zamanlarında düşüş uzun zaman serisi çekilecek verir ya bu yöntemi veya yakalama oranında bir artış kullanarak hücreleri yaşamak için.
Burada Examin için F3D-SIM mikroskopi uygulamasını tarifE yapı ve iki bakteriyel tür hücrelerde cytokinetic Z halka dinamik hareketi: çubuk-şekilli bir model organizma, Bacillus subtilis ve kokoid insan patojeni Staphylococcus aureus. 17,18 FtsZ bakteri hücre bölünmesi önemli bir rol oynayan bir tübülin-benzeri hücre iskeleti proteindir. Bu, bölme düzeneği 17,18 oluşturan polimer, en az 20 farklı bölümü proteinler işe bölme sitesine lokalize ve hücre için 19-23 daralma kuvveti sağlamak olduğuna inanılmaktadır. Bu yöntem FtsZ heterojen bir boncuk gibi düzenleme hem organizmalarda Z halka etrafında dağıtılır olduğunu ortaya koymaktadır; Elektron cryo tomografi (ECT) 24 tarafından önerildiği gibi, geleneksel geniş alan floresan mikroskobu ya da sürekli olmayan bir yapı ile gösterildiği gibi Z halka, hücre etrafında sürekli ve tek biçimli kayış olup uzun tutulan sorunu çözer. Biz 3D-SIM yeteneği büyük ölçüde küçük mekansal muayene (1 nasıl geliştirebileceğimizi gösteriyormikron çapında) S. gibi yuvarlak hücreler arka arkaya üç dikey düzlemde (x, y, z) bölmek aureus'dur. Bu teknikler kullanılarak zaman atlamalı çalışmalar Z halkasının yapısı ve sabit bir iskele 24 üzerinden hareket eden bütün halka içinde kurum değişikliklerin yerine FtsZ molekülleri ile, dinamik olduğunu göstermektedir.
Protocol
1. Numune Hazırlama
- B. hazırlanması Görüntüleme için subtilis hücreleri
- B'nin bir tek bir koloni ile (aynı zamanda Antibiyotik Ortama 3 olarak da bilinir PAB) Penassay Broth 10 ml inoküle SU570 subtilis suşu (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP-ö) 16. 30 ° C'de düşük bir hızda (100 rpm) bir çalkalayıcı içinde gece boyunca büyütün.
- Yüksek hızda çalkalama (215 rpm) ile 30 ° C'de 0.05 taze PAB bir 600 (600 nm'de ölçülen absorbans) gece boyunca kültür seyreltin ve orta üslü faza kadar (600 ~ 0.4) büyür.
- Bir vidalı kapaklı bir cam şişeye 100 mi 1x büyüme ortamı (PAB) elektroforez dereceli agaroz 2 g ekleyin. Otoklav ile agaroz eritilir. Bu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklanır ve daha sonra gerektiğinde agaroz eritmek için mikro dalgada edilebilir. Oda sıcaklığında ayarlamanıza olanak verir.
- Standart bir GLA üzerine; yapışkan bir çerçeve (Materyallerin Tabloya bakınız 65 ul kapasiteli) takınss mikroskop lamı. Bunu yapmak için, ince polyester tabakanın çıkarın (her biri yapışkan çerçeve iki polyester levha, bir ince ve kalın biri arasında yer alan ve kare uzaklaştırılmıştır merkezi) ve mikroskop lamı yüzeyine çerçevenin açıkta kalan yapışkan yüzeye uygulanır. Bu etkin slayt üstüne bir kare kuyu oluşturur. Bu ürün daha fazla arıtılmadan yapışmasını lamel önleyecek şekilde çerçeveye bağlı kalınlıkta polyester levha bırakın.
- Yapışkan çerçeve içine 67 ul kaynar ve pipet kadar mikrodalga agaroz çözüm eritin. Hemen düz bir yüzey oluşturmak ve 5-10 dakika için oda sıcaklığında bırakın üstüne bir lamel. Örnek hasat sırasında 1-2 dakika boyunca lamel çıkarın.
- 30 saniye boyunca 5900 x g'de santrifüj numune ve bir 1 ml lik bir hasat edilir. Süpernatant süzün ve 200 ul taze bir PAB pelet yeniden süspanse edin.
- Bir ön-pr üzerine konsantre edilmiş bir numuneden pipet ile 2.5 ul alınkırmızı agaroz ped. Agaroz düz bir pedin yüzeyi boyunca düzgün bir şekilde yayılmış bir örnek. Agaroz pad dokunmaz cımbız kullanarak mikroskop lamı gelen yapışkan çerçeveyi çıkarın.
- Bir cam lamel bir tabana sahip 35 mm çapında Petri kabı mikroskop slayt agaroz pedi aktarın. Petri kabı hücre süspansiyonu ve kapak, birbiriyle doğrudan temas halinde olacak şekilde agaroz pedi ters çevirin. Petri kabı yüksek çözünürlüğünü görüntüleme için 1,525 arasında bir kırılma indisine sahiptir.
- Canlı S. hazırlanması Görüntüleme için aureus Hücreler
- S. tek bir koloni ile L suyu 10 ml inoküle aureus suşu SA94 (pulluk-FtsZ-GFP ve pGL485 içeren SH1000, r Erm, Cm r) 25. 37 ° C'de düşük bir hızda (100 rpm) döner sallayıcı içinde gece boyunca büyütün.
- (Izo 0.05 mM IPTG ile 0.05 taze L-et suyu çorbası bir 600 (600 nm'de ölçülen absorbans) gece boyunca kültür sulandırınızpropil β-D-tiogalaktopiranosid-1) füzyon proteininin üretimini sağlamak için.
- Sallayarak yüksek hızda (215 rpm) 37 ° C'de inkübe ve orta-üstel aşamasına kadar (A 600 ~ 0.4) büyür.
- B için tarif edildiği gibi 1.1.8 - 1.1.3 takip adımları subtilis canlı hücre hazırlama.
Not: indüklenebilir kontrolü altında bir floresan füzyon proteini ifade suşları Aşama 1.1.3 agaroz çözeltisine İndüktör uygun konsantrasyona ekleyin.
Mikroskop 2. Hazırlık
Bu yöntem bir Blaze modülü ile donatılmış bir DeltaVision OMX (Optik Mikroskop, deneysel) 3D-SIM görüntüleme sistemi kullanır. Deneyler için tarif edilen, yalnızca bir lazer ve bir kamera kullanılır. Aydınlatma ve yolu Şekil 1 'de tarif edilmiştir. Bu yöntem, uygun bir kalibrasyon mikroskop, optik transfer fonksiyonuna sahip olduğunu varsayar (OTF)dosya ve hafif kolimasyon bakım uygulandı.
- Canlı hücre görüntüleme deneyleri için, ısıtma aşaması objektif (60X 1.42 NA yağ objektif) bağlı seramik sahne ve objektif ısıtma yaka bağlı olduğundan emin olun.
- Görüntüleme için en az 4 saat önce amaç ve sahne ısıtıcılar açın ve yavaş yavaş 5 ° C / saatlik bir oranda en gerekli ayara sıcaklık rampası. Bu görüntüleme öncesinde akşam bu süreci başlatmak ve 3 ° C / 4 hr rampa tavsiye edilir. B. canlı hücre deneyleri için subtilis, deneylerin 30 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir. S. S. aureus, deneylerin 37 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
- Deney gününde, sistem ve lazer tamamen stabilize olmasına izin verin önce görüntüleme için en az 1 saat sistemi açın. Isıtmak için ısıtılmış sahneye küçük çanak sahne eki yükleyin.
- Master kontrolör istasyonunda açın.
- Görüntü işleme workstat açıniyonu temsil etmektedir.
- Mikroskop dışında muhafaza katta bulunan kamera soğutucusu açın.
- (Hepsi kullanılır olmayacak olsa bile) sCMOS kameraların tüm açın.
- Lazer ve elektronik muhafaza içindeki açın:
- Enstrüman denetleyici çerçeve.
- Nanomotion şasi.
- Z piezo Jena denetleyicisi.
- Tüm 4 galvo motor kontrol.
- İlköğretim lazer kontrol modülü.
- İkincil lazer kontrol modülü.
- Tüm kamera iş istasyonları.
- OMXIC iş istasyonu.
- Master kontrolör iş istasyonunda, simgesini tıklatarak OMX yazılımını açın. Uygun bir veri klasöre kaydederken veri için dosya yolunu ayarlayın.
- Donanım başlatmak için, Donanım menüsüne gidin Donanım seçin ve Yeniden Donanım düğmesini tıklatın. Pencereyi kapatın.
- (Deneyler için gerekli lazerler üzerine 4 softWoRx software.Turn başlayın88 nm).
- Lazer güvenlik kilidi için kilit anahtarını açın.
- Doğru dikroik filtre çekmecesi hedefin altında takıldığından emin olun. GFP için, standart (veya sabit) çekmece.
- OMX SF, File menüsüne gidin Ayarlar'ı seçin ve Çekmece açılır menüden Sabit çekmecesini seçin. Pencereyi kapatın.
- Işık Parametreler bölümünde yazılımın ana ekranında, şunları yapın:
- Kanal seçimi uyarma lazer ve emisyon filtresi (FITC) kamera için uygun kamerayı etkinleştirin.
- Modu Sıralı ayarlanır Resmi edin.
- Işık Yolu SI ayarlanır edin.
- Kontrol Modu 95 MHz olarak ayarlanmış.
- 488 lazer uyartımı seçili olduğunu kontrol edin.
- Set
- Deney sekmesinde, Tür açılır menüden SI ayarlanır emin olun.
- Bölünmesi etkin olduğundan emin olun ve Optik bölüm aralığı 0.125 ayarlanmış olduğunu.
- Tarama başlar orta olduğunda Odak noktasının sağlanması.
3. Görüntü Alma
- Amacın üstüne bir damla yağ uygulayın. 37 ° C için, tavsiye edilen başlangıç yağı en iyi, 37 ° C'de, bakteriyel hücreler monte etmek için kullanılan jel pedinin kırılma indeksi uyumu için 1,518 arasında bir kırılma indisine sahiptir (1.1.3 adıma bakınız).
- Sahne içerlek içine hazırlanmış hücreleri içeren örnek Petri kabı yerleştirin ve dairesel ısıtma kapak ile kapatın. Yağı dibine değene kadar sahne indirinÖrnek Petri kabı.
- Çanak aşamada, 15 dakika boyunca ısı ile dengelenmeye bırakın. (Işık Parametreler bölümünde bulunan) 5 msn veya daha düşük bir Pozlama ayarını kullanarak, nano konumlandırma aşamasında kontrollerini (Nano Konumlandırma bölümünde bulunan dZ) kullanarak numune odaklanmak. Focus ve ışık örnek odak düzlemi üstünde ve altında yayılır durumunda, aşağıda numune boyunca belirlenmesi. Nokta dağılım fonksiyonu bile (küresel sapma) ise, numune, çanağın tabanı ve kloroform ile amaca temizleyin. Yağını değiştirin ve uygun bir maç küresel sapmayı en aza indirmek için petrol ve örnek kırılma endeksi arasındaki bulana kadar bu adımı tekrarlayın.
- 0.5 mikron dZ adım boyutlarını kullanarak, görüntü yığının üst ve alt işaretleyin. Numunenin ortasına dönün. Örnek edinme kalınlığını ayarlamak için Deney sekmesinde alın Kalınlığı düğmesini tıklatın. Keep Z-halkaların üst ve alt kesmek için dikkatli olmak iken minimum yığın yüksekliği. B için tipik kalınlık subtilis, örnekler 2-3 mikron.
- Geçerli Pozlama ve% T ayarları ile örnek görüntünün maksimum yoğunluk değeri (Max) belirleyin. Bu değer görüntü penceresinin altında bulundu. Time-lapse görüntüleme için görüntü için 1,100-1,400 yukarıda arka maksimum yoğunluğu elde etmek için Pozlama ve% T ayarlayın. 1000 Yukarıdaki bilgi en az yoğunluğu resim yeniden elde etmek için gereklidir. Bir kerelik bir görüntü için, 4,000-5,000 için maksimum yoğunluğunu arttırmak.
- Deney sekmesinde Time-lapse bölümü etkinleştirin. Gerekli kare hızını ve toplam süreyi ayarlayın. Veri Dosya, uygun bir dosya adı girin. Görüntü alımı başlamak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
Not: Görüntü edinimi tamamlandığında green İlerleme çubuğu bitmiş ve bir günlük dosyası, uygun veri klasöründe belirlenen veriler için görünür.
4. Veri Kalitesinin Kontrol
- Görüntü elde başında, zaman serisinin ilk karesinin görüntü elde başında görüntünün maksimum yoğunluk değeri not alın. Ilk çerçevenin edinimi sonunda, bu ilk çerçeve için z-yığını aracılığıyla sinyal yoğunluğunda% 10'luk bir düşüş daha fazla olmamıştır kontrol edin. Ilk kez noktada ışıkla bu düzeyde daha fazla olmuştur varsa, zaman dizisi veri analizi için yetersiz kalitede olacak ve süreleri serisi edinimi durdurulabilir.
- Zaman serisinin edinimi sonunda, .dv eki ile elde edilen ham görüntü dosyasını açın ve nihai görüntüye zaman serisinin başından itibaren maksimum sinyal yoğunluğu azalma tespit. Arı var olduğu durumlarda her zaman puan atınn% 30'dan fazla ağartmanın.
5. Yeniden Yapılandırılması 3D-SIM görüntüler
- İşlem menüsünden, SI İmar penceresini etkinleştirin. Tüm parametreler için önceden varolan ayarları kullanın.
- Kullanım Kanal Belirli OTF düğmesini etkinleştirin ve Standart filtre kümesi için. KO düğmesine açıları ve Standart filtre kümesi için kullan Kanal belirli etkinleştirin.
- Sürükle ve Girdi dosyası uzaya ham (.dv) dosyası açılır. Yap tıklatın. _SI Ile giriş dosyası sonuna eklenen gibi çıktı dosyası aynı ada sahip olacaktır.
Not: Bu yeniden yapılanma süreci birden fazla dosya işlenecek eğer İşlem menüsünden Görev Oluşturucu işlevini kullanarak bir görev olarak çalıştırılabilir.
6. Veri İhracat ve Analizi
- Modu ve eski aşmak 3D görüntüleri görselleştirmek için Imaris kullanıntiff (300 dpi) veya avi dosya (sıkıştırma yok) gibi liman görüntü verisi. IMARIS cinsinden boyut ölçümleri tarzını aşan olarak ölçümler aracı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- 3D-SIM görüntü verilerinden Z halka 3D yoğunluğu araziler oluşturuluyor:
- Z halka etrafında FtsZ dağılımını incelemek ve 3D yoğunluk araziler oluşturmak için
- Bireysel z dilimleri görüntülemek için bir 3D görüntü dosyasını açın. Ilgi bir bölge kırpmak için görünüm menüsü altında yer alan ses izleyici aracını kullanın.
- Giriş penceresinin içine bu 3D görüntü için pencere numarasını girin ve çıkış penceresine yeni ve kullanılmamış pencere numarasını girin. Bölge seç düğmesi bakış orijinal 40 × 40 mikron alanında ilgi bireysel Z halka kırpmak için kullanılabilir hale gelecektir.
- Rotasyon sekmesinde istenen ekseni ve dönme derecesini ayarlayın. Do It düğmesini tıklatın. Z halkasının arzu edilen bir bakış açısı elde etmek için hacim ilerleyin.
- Veri müfettiş aracını kullanın ve t ayarlayınO sütun / satır boyutları tek bir Z halka çevresinde ilgi yeni bir bölge oluşturmak için. Bu ilgi yeni bir bölge konumuna görüntünün merkezini tıklatın. Metin görüntü verileri ilgi bölgesi içindeki her pikselin floresans yoğunluğunu gösteren bir tablodur otomatik olarak oluşturulur.
- Başlangıçta yoğunluk arsa görüntülemek için 3D grafik düğmesini tıklatın.
- Alternatif metin görüntü verisi dosya menüsünden kaydetmek tablo veri butonuna tıklayarak ihraç edilebilir.
- Yeni bir tablolama içine kaydedilen metin dosyasından görüntü verilerini kopyalayın. Çizelgesindeki içindeki tüm hücreleri seçin ve yeni bir 3D-Yüzey grafiği oluşturun. Yayın için 3D yoğunluk arsa grafiği biçimlendirmek.
- 3D görüntü dosyasından farklı zaman-noktaların her 6.2.1.7 - time-lapse veri tekrarı için 6.2.1.1 adımları.
- Z halka etrafında FtsZ dağılımını incelemek ve 3D yoğunluk araziler oluşturmak için
- Over Time Ortalama Floresans Şiddeti İzleme
- Flüoresan izlemek için metin görüntü verilerini kullanınilgi bir bölgede zamanla ce şiddeti.
- Ilgilenilen bölgeye tekabül hücreleri seçin.
- Çevrede bu bölge için her zaman noktasında ortalama floresan yoğunluğu hesaplanır.
- Ayrı bir çizgi grafiği oluşturmak için ortalama floresan yoğunluğu değerlerini kullanır.
Representative Results
Bu çalışmada, bakteriyel hücre bölünme protein FtsZ görsel bakteriyel protein lokalizasyonu ve dinamiğini çalışmak için geleneksel floresan mikroskobu üzerinde F3D-SIM güçlü avantajlarının gösterilmesi için, bir FtsZ-GFP füzyon olarak canlı hücreler olarak ifade edilmiştir. FtsZ hücrenin çevresinde dinamik bir halka yapısı içinde polimerize olan bir tübülin-benzeri hücre iskeleti proteindir. Bu sitedeki tüm hücre bölünmesi proteinleri acemi, kendi montaj bölümünün geleceği siteyi işaretler, ve Z halka daralma sitokinez 17 sırasında hücre zarfı içe doğru hareketine izin kuvveti sağlamak için görüntülenir: Z halka hücre bölünmesi önemli bir işlevi vardır , 18.
Geleneksel geniş alan floresan mikroskopi ile görünür olduğunda, Z, halka, örneğin B gibi en iyi çalışılmış organizmalar da dahil olmak üzere, çubuk-şekilli bakteriler floresan tek bir yatay bant halinde görünür subtilis (Şekil 2A), <em> E. E. coli ve C. crescentus. Önemlisi, bu bant boyunca floresan yoğunluğu daha fazla veya daha az üniforma gibi görünüyor, ve yerelleştirme desen Z halkasının içindeki yapısal organizasyon ve FtsZ polimerlerin dağıtım içine çok az fikir veriyor. Aynı hücreler burada açıklanan bir yöntem F3D SIM (Şekil 2B) kullanılarak incelenmiştir, ancak, bu tekniğin avantajı hemen fark edilir. İlk olarak, z-ekseni etrafında 3D SIM imajın çevrilmesi üç boyutlu uzayda (Şekil 2C ve 3A) gerçek bir halka yapısı olan Z halkasının görselleştirme sağlar. Birlikte çözünürlükte artış ile, bu Z halkada FtsZ dağılımı aslında son derece heterojen (Şekil 3) olduğunu ortaya koymaktadır. Çözünürlükte iyileşme de bize hücre zarının invajinasyonuna gösterilen bir bölümü septum (forma daralma süreci başladı Z halkaları görmek için izin verir <strong> Şekil 2C ve 2D).
B. ilave örnekleri Bu teknik ile görselleştirilmiştir subtilis, Z, halkalar Şekil 3BI gösterilmiştir - 3Biv ve Z halka etrafında floresan yoğunluğu asla aynı gösteriyoruz. Ayrıca, çok düşük bir floresan yoğunluğunun bölgeleri sık ortaya çıkmaktadır. Biz boşluklar (beyaz ok uçları) olarak bu bölgelere bakın. 900 nm (% 93) - Biz, incelenen tüm Z halkaları (n = 84)% 15 ve ağırlıklı olarak 800 arasında bir çapa sahip Z halkalar bu boşlukları gözlemlemek. Bu gözlemler ölçmek için, 3D yoğunluk haritaları Z halka oluşturulur ve Şekil 3Biii ve 3Biv gösterilen Z halkaları kullanılarak Şekil 3CI ve 3Cii gösterilmiştir. B. farklı bölgelerinde 4 kat - yoğunluk haritaları tipik haliyle Z halkada floresan miktarı 3 taneye kadar değişebilir olduğunu göstermektedir subtilis, Z, bir halkadır. Ayrıca 3D yoğunluğu araziler ga gösteriyorZ halkasının içinde floresan ps neredeyse eşiğe (Şekil 3CI siyah ok) başlangıç seviyelerine okuyun. Bu örnekler, yukarıda Z halkasının iyi rekonstrüksiyon tasvir ve yeterli ışık önemli bir ışıkla ağartma olmadan örnek emisyonu sağlanabilir bağlıdır. Bu FtsZ ve bu koşullar altında hücresi içinde bulunan (gürültü oranı yüksek sinyal) kaynaşan GFP fluorofor parlaklığı ile gerçekleştirilir. Diğer hücrelerde gürültü oranı sinyal görüntünün yeniden zayıf düşük olduğu. FtsZ-GFP, B. toplanan emisyon sinyalinin miktarda Bu durumu taklit etmek için subtilis hücreleri uyarma, enerji düşürülmesi ile azaltılmıştır. Şekil 3D'de önemli eserleri barındıran Z halkasının, bir görüntüdeki uyarım enerji sonuç 100 kat azalma gösterildiği gibi. Bu FtsZ GFP sinyali ve aptes yol açan arka plan arasında yetersiz yerel kontrast bir sonucu olarak ortaya çıkarGörüntünün r yeniden.
İlginç bir şekilde, B subtilis Z, halkalar, halkanın üst ve alt bölgelerinde değil, halka (Şekil 3B) iki tarafında daha belirgin boşluklar ve heterojenlik gösterdi. Bu, eksenel düzleme göre yanal düzlemde, 3D-SIM bu değişimi ile sağlanır çözünürlükte farkı oluşur. Bu Z halka (yatay düzlemde) üst ve alt bölgelerinde en iyi çözünürlük ile sonuçlanır görüntülü. Z halkada boşluklar yanal düzleminin yaklaşık yarısı çözünürlüğe sahiptir eksenel düzlemde görselleştirildiği gibi Z halkanın yanlarına tespit edilmesi için çok küçüktür. Bu tür S gibi bir morfolojiye sahip kokoid Bakteri, aureus, tüm planlarda konumlandırılmış Z halkaları var. (Ya da buna yakın) lateral düzlemde yer alır uygun çözünürlükte görüntü halkasının bütün bölgeleri olanağı sağlar Yani Z halka görüntülenmesi. Bu yararlanarak, biz yapısını incelendiğindecanlı S. Z halka aureus hücreleri, bir plazmid taşıyan bir ftsZ-GFP füzyon içeren bir gerginlik kullanan. Bu füzyon üretimi p spac uyarılabilir promoterin kontrolü altındadır (adım 1.2.1). Eksenel düzlemde, S. ile görüntülendi zaman aureus, Z, halkalar B. tıpa tıp aynı göründü aynı düzlem (Şekil 4AI) içinde bulunmaktadır subtilis, Z, halkalar. Ancak, lateral düzleminde görüntüleme Z, Z, tüm halkalar halka boncuk gibi ve hem de heterojen ortaya doğruladı. Bu halkaların yaklaşık% 26 da (şekil 4Aii, 4B) floresans en azından bir görünür "boşluğu" gösterdi. B. Benzer S. farklı alanlarında 6 kat - subtilis FtsZ, flüoresan yoğunluğu araziler Z halkada floresan yoğunluğu kadar 4 değişir olduğunu göstermektedir aureus, Z, bir halka (Şekil 4C).
Boncukların uzunluğu ve genişliği de ölçülebilir () Şekil 4D şemasına bakın. Bu incelenmiştir Z halkaları (n = 43),% 80 400 nm'lik bir maksimum uzunluğu ulaşan 200 nm 'lik bir boncuk uzunluğa sahip olduğunu göstermiştir. Boncuk genişliği, diğer yandan, 200 nm 'ye kadar ölçülür. Z halka başına ortalama 12 ± 2 (SEM) FtsZ taneleri üzerinde oldu. Doğal FtsZ (yerli FtsZ ek olarak ftsZ-GFP ekspresyonu nedeniyle bu heterojen ve boncuk gibi lokalizasyonu deseni hakiki olduğunu gösteren immünofloresan mikroskopi kullanılarak bu yöntem (IFM) içeren ve bir Nesne ile bir veri görselleştirildi da benzer yeri verileri gözlenmiştir gösterilir). 3D-SIM Bu gelişme, Z halka, heterojen bir yapı olarak beliren ve doğada muhtemelen sürekli olduğunu gösterebilir.
Bu heterojen Z-halka yapısı, büzülmeye uğrar ve hücre bölünmesini kolaylaştırır nasıl soru adresi, Z, halka dinamiklerin zaman atlamalı analizi yapılabilir. Ile ana sorunlardan biri,floresan mikroskop zaman atlamalı çalışmalar görüntüleme sırasında örnek photobleaching ve fototoksisite minimizasyonu olduğunu. 3D-SIM ham görüntüleri çok sayıda zaman içinde, bir numunenin, ışıkla uygun görüntü rekonstrüksiyonunun izin vermek için yeterli bir sinyal verilmesine yol bir zayıf sinyal-gürültü oranı elde edilmesine neden olacağı anlamına gelir elde edilmesi gerekir. Yeni teknolojinin uygulanması, her maruz kalma ve bu nedenle, canlı hücreleri giren enerjinin azalması için kullanılan uyarım enerji miktarını en aza indirir. Bu, numune üzerine yapılandırılmış desen duyarlılık ve kuantum verimliliğini arttırmak bilimsel CMOS kamera oluşturmak için kullanılır ışık ışını interferometrik bir kombinasyonu ile yapar. Bizim önceki yineleme elde 5-8 sn (512 x 512 piksel x 8 z-dilim) başına 1 um karşılaştırıldığında saniyede 1 mikron (512 × 512 piksel x 8 z-dilim) z-yığın edinimi Bu kombinasyon sonuçları (Riglar ve diğ. 26 'da tarif edilmiştir), 3D-SIM.Görüntü elde etme zamanını ve pozlama ayarlarını azaltılması da time-lapse çalışmalarında özellikle ilgili olan canlı hücrelerin fototoksiteyi en aza indirmeye yardımcı olabilir. Burada sunulan yeni teknoloji aynı zamanda biz bu bağlamda görüntü alımı sırasında değişen proteinlerin lokalizasyonu ifade eder 'motion blur' olarak adlandırdığımız canlı hücre görüntüleme başka bir sorunu giderir. Görüntü elde etme zamanı azaltarak 'motion blur' miktarı, böylece daha doğru bir görüntü yeniden yaratıyor minimize edilir.
FtsZ Z halkası içinde nasıl organize değinmiştir Önceki çalışmalar Z halka yapısı zaman içinde nasıl değiştiğini göstermek mümkün olmamıştır. Bu yönüyle incelemek için biz F3D-SIM kullanan time-lapse gerçekleştirildi. B. Z halkasının 3 boyutlu bir SIM görüntünün bu etkin edinimi Bu zaman ölçeğinde daha önce mümkün değildi 50 saniye, daha uzun bir sürede subtilis 5-10 sn. Şekil 5A'da gösterilen bir exampl olduğuzamanla Z halkası içinde FtsZ dağılımındaki hızlı değişimlerin E (890 nm çapında). Daralma sürecinde görünür olmuştur Diğer Z halkalar da Z halka etrafında FtsZ dağılımını etkilenen benzer dinamikleri sahip oldukları gösterildi (gösterilmemiştir). 3D yoğunluk haritaları aynı zamanda ölçmek ve saniyelik bir zaman ölçeği (Şekil 5B) üzerine sürekli floresan yoğunluğu değişimleri ve Z halkasının değişik bölgelerinde FtsZ böylece göreceli olarak takdir zaman noktalarının her biri için oluşturulabilir. Ilgi Bölgeler floresan yoğunluğu (Şekil 5C) dalgalanmaları izlemek için bu yoğunluk parsellerden tespit edilebilir. Bu koşullar altında Z halka yapısında bu değişiklikleri izleme gelişmiş F3D-SIM teknolojisi olmadan neredeyse imkansız olurdu. Buna ek olarak, bu çalışma S. ortaya aureus, FtsZ dinamik hareketi B'de gözlemlenene benzer olduğunu subtilis. S. aureus RN4220 hücreleri producing FtsZ GFP 10 saniye aralıklarla 50 saniye boyunca görüntülenmiştir. S. Z halkasının heterojenliğine değişiklikler F3D-SIM ile aureus B'ye da benzer subtilis, (Şekil 6'da ok işaretleri ve oklara bakınız). Bu zaman atlamalı çalışmalar, sabit C incelenmesi yoluyla tahmin edildi Z halka daralma (iteratif kıstırıp modeli) bir modelini desteklemek crescentus hücreleri, ancak nedeniyle canlı hücreler 27 Z-halka dinamikleri incelemek için ihtiyaç gösterilememiştir.
Lazer masasına bu çalışma. Lazer ışık kullanılan F3D-SIM optik konfigürasyonda Şekil 1. Şematik sonra belirli dalga boyunu hem oluşturur faz kontrol modülüne, bir kolimatör lens için bir SIM fiber aracılığıyla yönettiği ve ızgara sabittir optimal mesafe osıfır sipariş merkezi kiriş gelen ± 1. sipariş kirişler ve SIM koleksiyonu için faz adımlar f. Kirişler sonra kirişler aydınlatma 3 açıları oluşturmak için 3 farklı kümeler yansıtılmaktadır açı kontrol modülünü girin. Kirişler daha sonra mikroskop ve gösterildiği gibi ışık yolu (Paul Goodwin izni ile Modifiye, API) girin.
B. geleneksel geniş alan floresan ve 3D-SIM görüntüleme Şekil 2. Karşılaştırılması ftsZ-GFP ifade subtilis hücreleri. (A) B. Konvansiyonel geniş alan floresan görüntüleme ftsZ-GFP ifade subtilis hücreleri, tek bir kopya (SU570 yeşil), aynı zamanda, zar boya FM4-64 (kırmızı) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Görüntü dik floresan mikroskop kullanılarak elde edilmiştir.(B), aynı B. 3D-SIM görüntüleme FM4-64 ile boyanmış ftsZ-GFP ifade eden subtilis suşu. Görüntüden ilgi alanları büyütmek için (noktalı kutu) seçilebilir. Görüntüsü de aksiyal düzlemde 3D FtsZ halkaları görüntülemek için z-ekseni etrafında döndürülebilir. (C, D) 'nin uzaklaştırılması-dışı odak ışık ve 3D-SIM tarafından sağlanan geliştirilmiş görüntü çözünürlüğü (sıkıştırıcı olanlar da dahil olmak üzere,) Z, halkaların açık görselleştirme ve (beyaz oklar ile gösterilmektedir) bölünmesi sırasında iç hücre zarı sağlar. Protokol metni tek bir floroforun görselleştirme açıklar unutmayın. Ancak, prosedür aynı anda dört farklı dalga boylarında kadar elde etmek için adapte edilebilir. Bu rakam Strauss ve arkadaşları 16 yeniden basıldı olmuştur.
Şekil 3,. 3D-SIM kullanılarak FtsZ-GFP ifade canlı çubuk şeklinde bakteri hücreleri (B. subtilis), Z halkasının Örnek görüntüler. (A i) Z halka xy düzleminde bir hücrenin uzun eksenine dik bir floresans bir bant olarak görülmektedir. (Ali) Görüntü Imaris 3 boyutlu görüntüleme yazılımı (protokole bakınız kullanarak -axis z etrafında döndürülmüştür 6.1 adıma) bu yüzden FtsZ Z halkası içinde nasıl dağıtıldığı açıkça görmek için bu bir halka yapısına bakıyor. Bu resim, artık ZX düzlemde bileziği bölgeleri ya da çok az floresan (beyaz ok başları) ile FtsZ heterojen bir dağılımına sahip olduğunu gösterir. Görüntü floresan bu 'boşluk' bölgeleri gözlemlemek döndürülmelidir. Bi-Biv şimdi zx düzleminde yer döndürülmüş Z halkaları başka örnekler gösteriyor. (İki iii) 0.9 um ~ arasında bir çapa sahip olduğu, Z çalar. (Biv) ONL bir çapı olan bir Z halkasını göstermektedirY 0,65 um geçiren daralma. (C) bu Tipik bir 3D yoğunluğu profili florasan yoğunluğu (yani konsantrasyon) göstermektedir 0.85 um arasında bir çapa sahip olan Z halka etrafında FtsZ-GFP farklılıklar (protokol 6,1-6,3 adım bakınız). Bu boşlukların floresans seviyesi düşüktür ve eşiğe seviyesi (siyah ok) yaklaşır. (Cn) daralma sürecinde Z halkasının benzer bir 3D yoğunluk profili. FtsZ-GFP konsantrasyonu düzgün olmayan aynı zamanda; çapı 0.65 um. Paneller A, B, CI ve Cii Strauss ark 16 yeniden basıldı edilmiştir.
S. 4. Temsilcisi 3D-SIM görüntüleri Şekil Bu hücreler (kok) yuvarlak olması nedeniyle FtsZ-GFP üreten S. aureus hücreleri., Z halka hav doyurmayaçeşitli yönelimleri e. Şekil 1Ai için olan Z ekseni etrafında döndürüldüğünde (Ai) olarak gösterildiği gibi, normal bir izleme yöneliminden floresan bir bant arzeden hücreler (bu xy düzleminde olduğu), çubuk şeklindeki hücrelerinde kişilerce çok benzer görünürler. (Ali), Z halka xy düzleminde zaten; yanal yönelim ve çözünürlük artık bir boncuk gibi yapı (B) verir, tüm halka üzerinde maksimal olduğunu. (C) Z halkada FtsZ-GFP göreceli bolluk bir 3D yoğunluğu arsa. (D) S şematik gösterimi . aureus, Z, bir halkadır. Kırmızı oklar boncuk uzunluk ve genişlik boyutlarına (protokolün adım 6.1 bakınız) göstermektedir. Bu rakam Strauss ve arkadaşları 16 modifiye edilmiştir.
<strong> Şekil 5. F3D-SIM 3D-SIM zamanla FtsZ lokalizasyonu hızlı analiz sağlar. (A), çubuk şeklindeki B'de Z'nin halka içinde FtsZ GFP dağılımındaki değişiklikler subtilis hücreleri halkanın dinamiklerini belirtmek için görselleştirilebilir. Zaman (sn) her resmin sol üst köşesinde gösterilir. (B) 3D floresan yoğunluğu araziler muntazam olmayan ve Z halkada FtsZ dinamik dağılımını göstermektedir. (C) FtsZ dinamikleri (FtsZ-GFP floresan değişiklikler halka) de ilgi iki bölgede zaman içinde fluoresans şiddetini ölçmek ile daha ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu rakam Strauss ve arkadaşları 16 yeniden basıldı olmuştur.
Şekil 6. F3D-SIM time-lapse görüntüleri S. zamanla halka içinde FtsZ lokalizasyon değişiklikleri göstermek Birbaşlangıçta Z halka algılandığında ureus. beyaz bir ok ucu bir boşluğa işaret etmektedir. Zaman içinde aynı konumda boşluklarının görünmesini ve kaybolmasını, (beyaz ok ucu ile gösterildiği gibi) FtsZ Z halka etrafında dağıtılır verilmektedir. Beyaz oklar daha sonraki zaman noktalarında Z halkada boşluklar oluşumunu göstermektedir. Zaman (saniye) görüntü, üst sol tarafında gösterilmiştir. Bu rakam Strauss ve arkadaşları 16 modifiye edilmiştir.
Discussion
Floresan canlı hücre görüntüleme zamanla hücre içindeki dinamik değişiklikleri gözlem sağlayan güçlü bir araçtır. Bakteriyel hücre biyolojisi imaj için küçük hücre boyutuna sahip olan ve zor uyarım ışığına sürekli temas dayanma bakteriyel hücrelerin yeteneği azaltmıştır. F3D-SIM tüm hücre biyolojisi sorgulamak için kullanılabilir araçları genişletti ama kötü uygulandığı takdirde eserler sokulabilir gibi dikkatle bu tekniği gerçekleştirmek için gereklidir. Bu tekniğin başarılı kullanımı açısından önemli hususlar vardır. Bu doğru bir resim rekonstrüksiyonu için kaçınılmalıdır yayılan ışık, kırılma endeksi uyumsuzluğu ve yayılan ışığın küresel sapma noktası dağılım fonksiyonu kullanımına dayanan bir geniş alan flüoresan görüntüleme yöntemidir. Yüksek kalitede, 0.17 mm kalınlığında lamelleri kullanılması nedeniyle kapakların cam kalınlığı değişkenlik sinyal yoğunluğu değişimini önlemekdudak tavsiye edilir. Dikkatle tüm deneylerin ilk aşamalarında yayılan ışığın küresel sapmayı değerlendirmek ve gerektiğinde daldırma yağ kırılma indeksi ayarlamak için kritik önem taşımaktadır. Bu örneğin sıcaklık ve montaj ortamı / alt-tabaka hem de hassas olması nedeniyle bu gün için gün arasında değişebilir. Yanlış yağ kullanımı, haleler ve eko sinyalleri gibi eserler ile görüntülerin alt yeniden neden olacaktır.
Görüntü Yeniden yapılanma işleminin sonunda, her bir aşama için yeniden kalitesi ölçüsüdür aydınlatma her aşaması / açısı için "k O açısı için en uygun" elde edilebilir. Bu değer, her bir açı için 1 altındaysa, o zaman yeniden kalitesi büyük olasılıkla yüksek olacaktır. Bu değer 6 üzerinde ise, bu yeniden oluşturulmuş görüntü dıştan müdahale ürünleri içerecektir daha muhtemeldir. Ortak eserler i) karşılık görüntüde çizgili görünüm sayılabilirIzgaranın açıları birine. Bu, ızgara açıdan düşük sinyal kaynaklanabilir; ii) yapıların etrafında haloing. Bu, çevredeki yapılara kıyasla parlak yapılardan sinyalin çok dengesiz seviyelerinden neden olabilir, petrol kırılma indeksi, bir uyumsuzluk ve numune veya görüntü olması için yeterli "yapısı" içeren çok amorf olmak ve değil yapılara bağlı olabilir algoritması tarafından tanınan; Genellikle, yüksek bir zemin sinyali için, görüntü gürültü oranı düşük bir sinyal sonucu iii) 'bal peteği'; iv) xy uzatılmış gergin yapıları / nedeniyle yağ ve örnek kırılma indeksi uyumsuzluğuna bağlı olabilmektedir. Bu yapıyı deneyimsiz kullanıcı için ayırt etmek zordur. Bu tekniği kullanmak başlarken yeni kullanıcılar görüntü yorumlama ve analiz tavsiye için deneyimli bir SİM araştırmacı danışmanız tavsiye edilir.
Tüm floresan canlı hücre görüntüleme deneyleri ile olduğu gibi, ithalatkarınca dikkatli bir şekilde ve en az Photobleaching artefakt görüntüler tekrar oluşturulması için gerekli yeterli bir emisyon sinyali ile hücrelerin fototoksisite derecesini en aza indirmek için uyarım enerji girişi dengelemek için. Aşırı ışıkla ağartma (tek bir z-yığın devir arasında% 30'dan daha fazla) yeniden kurulmuş görüntü içindeki çizgi desen yol açacaktır. SCMOS kameraların kullanımı ile, süper çözünürlüklü görüntüler başarıyla arka plan üzerinde 1.000 sayıları gibi düşük emisyon sinyali ile ham görüntüleri yeniden inşa edilebilir. Bu çok kısa pozlama süreleri böylece photobleaching azaltmak ve her kare için hızlı yakalama etkinleştirmek için izin verebilirsiniz. Aynı zamanda hücreler, uyarım enerji girişi kurtarmak için çerçeveler arasındaki süreyi arttırır. Her bir çerçeve için yakalama süresi çok kısa olabilir, İlave olarak, tek bir çekim sırasında 'hareket bulanıklığı yayınladıkları artefaktının derecesi bu yöntemin kullanılması ile indirgenir.
Bu vari3D-SIM tirme bakteriyel hücre biyologlar tarafından canlı görüntüleme için kullanılabilir diğer süper ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknolojileri üzerinden diğer bir takım avantajlar sunuyor. 3-boyutlu çözünürlükte 2 kat artış ve bir numune içine 30 mikron kadar görüntü yeteneği bir deney sırasında tüm bakteri (ve memeli) hücre görüntüleme sağlar. Genel olarak çabuk kaybolan dalgalı gerçekleştirilir bu tip bir tekli-molekül lokalizasyonu gibi teknikler, bir numune içine nüfuz derinliği elde edemez ve bütün hücrelerin hakkında bilgi sağlamaz. Bu teknik için yüksek örnekleme derinlikleri izin son gelişmeler, tam hücrelerde daha iyi çözünürlük eksenel neden olabilir. Ayrıca, aynı zamanda mekansal çözünürlüğü olarak, yakalanabilir ve yakalama kare hızı ve nihai elde uzamsal çözünürlük arasındaki uzlaşma isteyebilir kare hızı sınırlıdır elde edilecek ham görüntüleri binlerce gerektiren tek-molekül lokalizasyon teknikleri bağlıdır eve sayısıTanımlanmış bir alan içinde kaydedilen NTS. Yakalanan kare sayısını azaltılması daha düşük bir uzamsal çözünürlük ile sonuçlanır, fakat söz konusu biyolojik işlemi için gerekli olan zamansal çözünürlüğü elde etmek için yeterli olabilmektedir. Çerçeveler arasında iyileşme süresi miktarı da bu şekilde zaman serisi elde edilebildiği de süresini ve sıklığını sınırlayıcı Canlı hücrelerdeki fototoksisite en aza indirmek için artırılması gerekebilir. Elektron mikroskobu (EM) veya elektron cryotomography (EKT) teklif olarak Yüksek çözünürlüklü teknikler 3D-SIM (ve diğer süper-çözünürlüklü optik mikroskopi teknikleri) üzerinde çözünürlüğü arttı ancak sabit numuneler üzerinde yapılmalıdır. Sabitleme ve işleme eserleri tanıtmak olabilir ve etiketleme eksikliği yorumlanması zor hale getirebilir. Etiket içermeyen ECT kötü kontrast ve yaklaşık 500-200 nm 24 numunesi, penetrasyon derinliklerinde elde edilebilir, yani, ilgi konusu proteinin tespit edilebilir olsa bile, bütün bir bakteri hücresinde proteininin yapısı izlenememektedir.Etiketleme gibi immünolojik gibi EM, kullanılabilir bile, 2D sadece görüntüleme gerçekleştirilir. 3D ince ince kesilir ve bölümlerin hesaplama rekonstrüksiyonu ile yalnızca ulaşılabilir. Ince kesit deneyimli bir teknisyen gerektirir ama sorunlu ve artefakt yol açabilir. Canlı hücreler ya da sabit olan, 3D-SIM özel bir şekilde gömülü olması için ve hücrelerin hızlı bir şekilde yakın bir yerli durumda görüntüleme için hazırlanabilir gerek yoktur.
Bu yöntem floresan mikroskopi minimal deneyime sahip araştırmacılar tarafından uygulanması nispeten kolaydır. Deneyler sürece floresan arka plan sinyal ya da aşırı üretmez sağlıklı hücre işlevini destekleyen ortam içinde yapılabilir. Bakteriyel hücreler için, bu karmaşık ve en az bir ortam veya bakteriyel hücre motilitesini kontrol etmek için katı ya da yan-katı ortam kullanımından birçok türde kullanılmasına olanak sağlamaktadır. Zaten floresan proteininin (FP) füzyonlan mühendislik ve işlevselliğini test ettik Birçok biyologBu füzyon fazla mühendislik ve yeni fotoaktıfleştırılebılır FP füzyonlarında doğrulama olmadan hızla bu teknolojiyi kadar sürebilir. Biz, genel bir gözlem olarak, bulduğu S. aureus B'den daha FP füzyonlarında görüntüleme sırasında photobleaching daha duyarlı oldu subtilis. Izgara desen fiziksel bir ızgara tarafından oluşturulan orijinal 3D-SIM yöntemler kullanarak, biz S. bir dizi ile canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için koyamadık aureus, FP füzyonlar. Ancak, bu gelişmiş F3D-SIM yöntemi ile, biz görüntüye bu FP füzyonlarını başardık ve bu etiketli proteinlerin dinamiklerini yakalamak için kısa bir süre dizi gerçekleştirmek. Bu en büyük ihtimalle görüntüleme için gerekli ve hücre iyileşme için çerçeveler arasındaki zaman artan maruz kalma oranını kere kaynaklanmaktadır.
OMX yangını 3D-SİM nispeten kolay bir şekilde, tek bir laboratuar ya da bir çekirdek görüntüleme birimi uygulanabilir bir ticari olarak temin edilebilir bir teknolojidir. Bakım arti önlemek için tekniğin seçilmesi alınmalıdırkötü örnek hazırlama veya kötü görüntü yakalama nedeniyle gerçekler. Teknik hakim sonra, bakteriler gibi küçük organizmaların protein yapı çalışmaları ve dinamikleri, tek veya çok renkli floresan gerçekleştirilebilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media. |
| N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
| 1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization. |
| Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving. |
| BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
| Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm). |
| Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22 x 22 No. 1 Thickness |
| 35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol. |
| Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Combined orbital/linear shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
| UV visible spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use. |
| softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
| Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
| DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |
References
- Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison. Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving. Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).
- Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens. Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).
- Urban, N. icolai T., Willig, K. atrin, Hell, S. tefan W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).
- Strauss, M. P., et al. 3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis. PLoS biol. 10, e1001389 (2012).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. J. Advances in understanding E coli cell fission. Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).
- Erickson, H. P. Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).
- Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One. Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).
- Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).
- Murphy, G. E., Jensen, G. J. Electron cryotomography. BioTechniques. 43, 413-415 (2007).
- Liew, A. T. F., et al. A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus. Microbiology. 157, 666-676 (2011).
- Riglar, D. T., et al. Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte. Cell Hos., & Microbe. 9, 9-20 (2011).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).
