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Biology

फास्ट 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीवित बैक्टीरिया में Cytokinetic जेड अंगूठी के सुपर संकल्प इमेजिंग (f3D सिम)

Published: September 29, 2014 doi: 10.3791/51469
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1The ithree Institute, University of Technology, Sydney
* These authors contributed equally

Abstract

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग जैविक नमूनों की इमेजिंग लाइव नमूनों की सुपर संकल्प की अनुमति प्रकाश के विवर्तन के संकल्प बाधा को दूर करने के लिए नई प्रौद्योगिकियों के साथ काफी उन्नत है. प्रेरित उत्सर्जन रिक्तीकरण (STED), (जैसे कि पाम, तूफान, और GDSIM रूप तकनीकों सहित) एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी, और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) - सुपर संकल्प तकनीक के तीन मुख्य प्रकार वर्तमान में कर रहे हैं. STED और एकल अणु स्थानीयकरण तकनीक संकल्प में सबसे बड़ा बढ़ जाती प्रदर्शित करते हैं, वे छवि अधिग्रहण की वृद्धि की गति की पेशकश करने के लिए धीमी गति से किया गया है. तीन आयामी सिम (3 डी सिम) एकल अणु स्थानीयकरण और STED दोनों अधिक लाभ का एक नंबर प्रदान करता है कि एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक है. संकल्प के लिए अनुमति देता है, coverslip से ठेठ पार्श्व और अक्षीय 110 के प्रस्तावों और 280 एनएम, क्रमशः और ऊपर से 30 माइक्रोन के नमूने की गहराई के साथ सुधार हुआ है,पूरे कोशिकाओं की इमेजिंग. काफी फोटो विषाक्तता और photobleaching को कम करते हुए कच्चे छवियों का कब्जा दर में वृद्धि प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल की प्रगति (तेजी से 3 डी सिम), सेकंड में होने वाली जैविक प्रक्रियाओं के तेजी से कब्जा करने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम छवि के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैं दिखाने के लिए कैसे fluorescently लेबल cytokinetic FtsZ प्रोटीन और इस तकनीक प्रदान कर सकते हैं कि अद्वितीय जानकारी के प्रकार को शरण देने बैक्टीरियल कोशिकाओं एक ऐसी विधि के प्रयोग का वर्णन है.

Introduction

विभिन्न इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के एक नंबर विभिन्न इलेक्ट्रॉन और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक सहित बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए साल भर में इस्तेमाल किया गया है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अत्यंत उच्च संकल्प प्रदान करता है whilst, नैनोमीटर के लिए नीचे, एक निर्वात और विपरीत एजेंटों के उपयोग के लिए की जरूरत तय की और एम्बेडेड नमूनों के लिए इस तकनीक सीमित है. कलाकृतियों की वजह से भी लंबा नमूना तैयार करने और एक कुशल चिकित्सक के नमूने तैयार करने के लिए, और जिसके परिणामस्वरूप छवियों का विश्लेषण और व्याख्या की जरूरत है के लिए पेश किया जा सकता है. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सरल नमूना तैयार करने और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना में अपेक्षाकृत आसानी से एकाधिक लेबल के आवेदन का लाभ प्रदान करता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन और डाई conjugates, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ जीवित कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता का उपयोग करना भी संभव है. कैमरा का पता लगाने techn में सेल विषाक्तता, साथ ही अग्रिमों की कमी हुई करने के लिए अग्रणी फ्लोरोफोरे स्थिरता और फ्लोरोसेंट प्रोटीन आकार / संरचना में सुधार के साथology, व्यापक क्षेत्र और confocal इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी काफी कोशिकाओं के स्थानिक गतिशीलता के बारे में हमारी समझ को विस्तार किया गया है. इन तकनीकों का प्रयोग, पिछले 20 वर्षों में बैक्टीरिया कोशिका के हमारे ज्ञान बैक्टीरिया कोशिका 1 भीतर संरचनात्मक और प्रोटीन संगठन के एक उच्च स्तर का पता चलता है कि एक कहीं अधिक विस्तृत विवरण के लिए काफी प्रगति की है.

हालांकि, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के परंपरागत तरीकों निहित संकल्प इस्तेमाल किया उत्तेजना प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के आधे के बारे में है जिसका अर्थ है कि विवर्तन सीमित हैं. नतीजतन, यहां तक कि सबसे इष्टतम पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली के साथ, सबसे अच्छा पार्श्व संकल्प के बारे में 220-250 एनएम और अक्षीय संकल्प के बारे में 500 एनएम है (समीक्षा के लिए Schermelleh एट अल. 2 देखें). विशेष रूप से बैक्टीरिया कोशिका जीव के लिए, यह अभी भी गंभीर रूप से इन छोटे कोशिकाओं के स्थानिक संगठन के बारे में हमारी समझ की सीमा; diam में केवल 1-2 माइक्रोन जा रहा हैeter और लंबाई में 1-10 माइक्रोन. एक प्रोटीन के गतिशील स्थानिक व्यवहार विट्रो डेटा में पूरक करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, जहां जीवित कोशिकाओं पर किया जा सकता है कि उच्च संकल्प तकनीक की जरूरत भी नहीं है.

पिछले दशक के दौरान, कई सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक विकसित किया गया है. सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्य कम से कम दोगुना पार्श्व संकल्प, जिससे विवर्तन बाधा पर काबू पाने कि इमेजिंग तकनीकों का वर्णन है. इन तकनीकों में स्पष्ट संकल्प में असली बढ़ जाती है बनाने के लिए उत्सर्जित प्रकाश की रोशनी और / या विश्लेषण में हेरफेर. सुपर संकल्प तकनीक के तीन मुख्य प्रकार वर्तमान में कर रहे हैं - मैं) उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी 3 (STED) प्रेरित; ऐसे photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी 4,5 (पाम), stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी के रूप में तकनीक सहित द्वितीय) एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी, 8 (GDSIM) के साथ> 6 (तूफान), प्रत्यक्ष तूफान 7 (dSTORM), और जमीन राज्य कमी; और iii) संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 9-12 (सिम). एकल अणु स्थानीयकरण तकनीक जैविक नमूने में नीचे एनएम 10-40 के बीच करने के लिए, पार्श्व संकल्प में सबसे बड़ा बढ़ जाती है प्रदान करते हैं. एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के कई कार्यान्वयन में, नमूने की गहराई क्षणभंगुर लहर तक ही सीमित है और STED की प्रारंभिक कार्यान्वयन भी नमूना गहराई में सीमित थे. अक्षीय दोनों में हालांकि, इस तरह अनुकूली प्रकाशिकी के उपयोग के रूप में हाल ही में प्रगति, विभिन्न फोकल प्वाइंट में बात फैल समारोह में दृष्टिवैषम्य के शोषण, बहु विमान का पता लगाने और उत्सर्जित प्रकाश का अक्षीय स्थिति अनुमान को दो उद्देश्यों का उपयोग देखा है सुधार STED और एक अणु स्थानीयकरण 13,14 दोनों में संकल्प और नमूना गहराई. STED के लिए डाटा अधिग्रहण दरों और एकल अणु स्थानीयकरण तकनीककारण (स्थानीयकरण तकनीक के लिए ऊपर 50,000) अधिकतम संकल्प के लिए अधिग्रहीत की जाने की जरूरत है कि छवियों की बड़ी संख्या को भी अपेक्षाकृत धीमी गति से कर रहे हैं. यह धीमी गति से डाटा अधिग्रहण अक्सर काफी महंगे हैं कि कस्टम संशोधनों के बिना जीना नमूनों की इमेजिंग के लिए उधार नहीं करता है. इन दोनों तकनीकों वर्तमान में बेहतर (समीक्षा के लिए 2,15 देखें) तय नमूने के लिए अनुकूल हैं, हालांकि, बहुत काम इस सीमा को संबोधित करने के लिए किया जा रहा है.

तीन आयामी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी सिम) लगभग 110 और 280 एनएम, क्रमशः के प्रस्तावों में जिसके परिणामस्वरूप दोनों पार्श्व और अक्षीय संकल्प को बेहतर बनाता है कि एक व्यापक क्षेत्र तकनीक है. नमूने की गहराई पूरे कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, coverslip से 30 माइक्रोन तक है. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप प्रयोगात्मक (OMX) मंच पर Sedat, Agard, और Gustaffsson द्वारा विकसित 3D-सिम की भिन्नता अलग 15 में ले जाया जाता है जो एक ज्ञात ग्रिड पैटर्न के साथ नमूना रोशन शामिलप्रत्येक Z विमान 9-11 में पदों. नमूदार क्षेत्र से बाहर आवृत्ति अंतरिक्ष में बनाया जाता है जिसके परिणामस्वरूप मौआ पैटर्न में किनारे मापा जाता है. आवृत्ति अंतरिक्ष से जानकारी एक दृश्य सुपर संकल्प छवि 10,11 उत्पन्न करने के लिए computationally खंगाला है. कच्चे छवियों इस तकनीक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जिस पर सापेक्ष गति जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है. हालांकि, यह सेकंड के एक समय पैमाने पर होने वाली जैविक प्रक्रियाओं के लिए, कच्चे छवियों के अधिग्रहण की दर अभी भी गतिशील परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए बहुत धीमी है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. सेकंड के एक कब्जा दर के साथ समय श्रृंखला के लिए, पर्याप्त वसूली समय बिना दोहराया अधिग्रहण विशेष रूप से छोटे जीवाणु कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग के दौरान, phototoxicity और photobleaching के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, तेजी से 3 डी सिम (f3D सिम) के लिए हाल ही में प्रगति विकसित किया गया है. यहाँ हम मैं था कि OMX ब्लेज़ 16 के रूप में जाना एक वर्णनयह तकनीक पहले सिस्टम में इस्तेमाल किया गया था के रूप में एक भौतिक ग्रिड के उपयोग के बिना नमूनों रोशनी देर से 2011 में बनाता ntroduced. प्रकाश मुस्कराते हुए और नए शटर प्रौद्योगिकी हस्तक्षेप के उपयोग के एक बहुत तेजी से फैशन में नमूना पर नमूनों प्रकाश के निर्माण के लिए अनुमति देता है. मौजूदा EMCCD कैमरों की तुलना में जब छवि अधिग्रहण की गति आगे विशेष रूप से, वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (sCMOS) कैमरों की शुरूआत के साथ बढ़ाया गया था. ये परिवर्तन सेकंड 16 के भीतर होते हैं कि कोशिकाओं के भीतर गतिशील परिवर्तन की निगरानी की अनुमति, 1 माइक्रोन (512 x 512 पिक्सल, 9 Z-स्लाइस) का एक नमूना गहराई के लिए प्रति सेकंड एक फ्रेम के एक संभव छवि अधिग्रहण की दर में हुई. स्पष्ट जोखिम (उत्तेजना) के समय में कमी विस्तारित समय श्रृंखला पर कब्जा कर लिया जा करने की अनुमति देता है या तो इस विधि या कब्जा दर में वृद्धि का उपयोग कोशिकाओं रहते हैं.

यहाँ हम examin को f3D सिम माइक्रोस्कोपी के आवेदन का वर्णनई संरचना और दो ​​बैक्टीरियल प्रजातियों की कोशिकाओं में cytokinetic जेड अंगूठी की गतिशील आंदोलन: छड़ी के आकार का मॉडल जीव बेसिलस subtilis और coccoid मानव रोगज़नक़ Staphylococcus aureus. FtsZ बैक्टीरिया 17,18 में कोशिका विभाजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक ट्यूबिलिन तरह cytoskeletal प्रोटीन है. यह विभाजन तंत्र 17,18 बनाने, कम से कम 20 अन्य विभाजन प्रोटीन की भर्ती के लिए विभाजन साइट के लिए localizes, और सेल कसना 19-23 के लिए बल प्रदान करने के लिए माना जाता है. इस विधि FtsZ विभिन्नतापूर्वक एक मनका की तरह व्यवस्था में दोनों जीवों में जेड अंगूठी के आसपास वितरित किया जाता है कि पता चलता है; इलेक्ट्रॉन क्रायो टोमोग्राफी (ईसीटी) 24 ने सुझाव दिया है के रूप में पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या एक टूटनेवाला संरचना द्वारा कल्पना के रूप में जेड अंगूठी, सेल के चारों ओर एक निरंतर वर्दी बेल्ट है कि क्या लंबे समय से आयोजित इस मुद्दे को सुलझाने. हम 3 डी सिम की क्षमता बेहद छोटे के स्थानिक परीक्षा (1 कैसे सुधार सकते हैं दिखानेमाइक्रोन व्यास) एस की तरह गोल कोशिकाओं लगातार तीन सीधा विमानों (एक्स, वाई, जेड) में विभाजित है कि ऑरियस. इन तकनीकों का उपयोग करते समय चूक पढ़ाई जेड अंगूठी की संरचना में और एक निश्चित पाड़ 24 से बाहर जाने सकल रिंग के भीतर संगठन परिवर्तन, बजाय FtsZ अणुओं के साथ, गतिशील है कि दिखा.

Protocol

1 नमूना तैयार

  1. बी की तैयारी इमेजिंग के लिए subtilis कोशिकाओं
    1. बी के एक ही कॉलोनी के साथ (भी एंटीबायोटिक मध्यम 3 के रूप में जाना PAB) Penassay शोरबा के 10 मिलीलीटर टीका लगाना subtilis तनाव SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP कल्पना) 16. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक कम गति (100 आरपीएम) एक प्रकार के बरतन में रात भर के लिए आगे बढ़ें.
    2. मिलाते हुए उच्च गति (215 आरपीएम) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 0.05 के लिए ताजा PAB में एक 600 (600 एनएम पर मापा absorbance) रातोंरात संस्कृति पतला और मध्य घातीय चरण तक (ए 600 ~ 0.4) हो जाना.
    3. एक पेंच से छाया कांच की बोतल में 100 मिलीलीटर 1x मध्यम विकास (पीएबी) में वैद्युतकणसंचलन ग्रेड agarose के 2 जी जोड़ें. Autoclaving द्वारा agarose भंग. यह एक कुछ महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, और जरूरत पड़ने पर agarose पिघल microwaved किया जा सकता है. कमरे के तापमान पर सेट करने की अनुमति.
    4. एक मानक GLA करने पर, एक चिपकने वाला फ्रेम (सामग्री की तालिका देखें 65 μl क्षमता) संलग्न करेंएसएस खुर्दबीन स्लाइड. ऐसा करने के लिए, पतली पॉलिएस्टर शीट हटाने (प्रत्येक चिपकने वाला फ्रेम दो पॉलिएस्टर शीट, पतली एक और मोटी एक के बीच स्थित है, और वर्ग हटाया केंद्र है) और खुर्दबीन स्लाइड की सतह के फ्रेम के संपर्क में चिपकने वाली सतह लागू होते हैं. यह प्रभावी रूप से स्लाइड के शीर्ष पर एक वर्ग अच्छी तरह से बनाता है. इस बाद के चरणों में इसे चिपका coverslip कर पाएगा रूप फ्रेम से जुड़ी मोटी पॉलिएस्टर शीट छोड़ दें.
    5. चिपकने वाला फ्रेम में 67 μl उबलते और पिपेट तक एक माइक्रोवेव में agarose समाधान पिघला. इसके तत्काल बाद एक फ्लैट सतह बनाने के लिए और 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ने के लिए शीर्ष पर एक coverslip जगह. नमूना काटा जाता है, जबकि 1-2 मिनट के लिए coverslip निकालें.
    6. 30 सेकंड के लिए 5,900 XG पर नमूना और अपकेंद्रित्र के 1 मिलीलीटर विभाज्य हार्वेस्ट. सतह पर तैरनेवाला छानना और 200 μl में गोली ताजा PAB resuspend.
    7. एक पूर्व prepa पर केंद्रित नमूना और विंदुक के 2.5 μl लोलाल agarose पैड. Agarose पैड के फ्लैट सतह के साथ समान रूप से नमूना बिखरा हुआ है. Agarose पैड को छू नहीं है, जबकि चिमटी का उपयोग कर खुर्दबीन स्लाइड से चिपकने वाला फ्रेम निकालें.
    8. एक गिलास coverslip नीचे के साथ एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश खुर्दबीन स्लाइड से agarose पैड स्थानांतरण. पेट्री डिश के सेल निलंबन और coverslip एक दूसरे के साथ सीधे संपर्क में हैं ताकि agarose पैड उलटें. पेट्री डिश के नीचे उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए 1.525 के एक अपवर्तक सूचकांक है.
  2. लाइव एस की तैयारी इमेजिंग के लिए ऑरियस प्रकोष्ठों
    1. एस का एक ही कॉलोनी के साथ एल शोरबा के 10 एमएल टीका लगाना ऑरियस तनाव SA94 (हल की FtsZ-GFP और pGL485 युक्त SH1000; आर एर्म, मुख्यमंत्री आर) 25. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कम गति (100 आरपीएम) रोटरी प्रकार के बरतन में रात भर के लिए आगे बढ़ें.
    2. (आईएसओ 0.05 मिमी IPTG साथ 0.05 तक ताजा एल शोरबा में एक 600 (600 एनएम पर मापा absorbance) रातोंरात संस्कृति पतलाpropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) संलयन प्रोटीन के उत्पादन को प्रेरित करने के लिए.
    3. मिलाते हुए उच्च गति (215 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और मध्य घातीय चरण तक (ए 600 ~ 0.4) हो जाना.
    4. बी के लिए के रूप में वर्णित 1.1.8 - कदम 1.1.3 का पालन करें subtilis रहते सेल तैयारी.
      नोट: inducible नियंत्रण के तहत एक फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त कि उपभेदों के लिए कदम 1.1.3 में agarose समाधान के लिए inducer के उचित एकाग्रता जोड़ें.

माइक्रोस्कोप के 2. तैयारी

यह विधि एक ब्लेज़ मॉड्यूल के साथ लगे एक DeltaVision OMX (ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप, प्रयोगात्मक) 3 डी सिम इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करता है. प्रयोगों में वर्णित के लिए, केवल एक लेजर और एक कैमरा इस्तेमाल किया जाता है. रोशनी और प्रकाश पथ चित्र 1 में वर्णित हैं. इस विधि माइक्रोस्कोप उपयुक्त अंशांकन, ऑप्टिकल हस्तांतरण समारोह है कि मानता है (OTF)फ़ाइलें और प्रकाश संधान रखरखाव प्रदर्शन किया.

  1. लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों के लिए, हीटिंग चरण उद्देश्य (60X 1.42 एनए तेल उद्देश्य) से जुड़ा हुआ है सिरेमिक मंच और उद्देश्य हीटिंग कॉलर से जुड़ी है सुनिश्चित करें.
  2. इमेजिंग के लिए कम से कम 4 घंटे पूर्व उद्देश्य और मंच हीटर चालू करें और धीरे से 5 डिग्री सेल्सियस / घंटा की अधिकतम दर पर आवश्यक स्थापित करने के लिए तापमान रैंप. यह इमेजिंग से पहले शाम को इस प्रक्रिया को शुरू करने और 3 डिग्री सेल्सियस / 4 घंटे में रैंप की सिफारिश की है. बी के साथ लाइव सेल प्रयोगों के लिए subtilis, सबसे प्रयोगों 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं. एस के लिए ऑरियस, सभी प्रयोगों में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं.
  3. प्रयोग के दिन, प्रणाली और लेज़रों पूरी तरह से स्थिर करने के लिए अनुमति देने के लिए इमेजिंग के लिए पहले कम से कम 1 घंटा पर प्रणाली की बारी है. पहले से गरम पर गरम मंच पर छोटे पकवान चरण डालने लोड करें.
    1. मास्टर नियंत्रक वर्कस्टेशन पर मुड़ें.
    2. इमेज प्रोसेसिंग workstat चालू करेंआयन.
    3. खुर्दबीन बाड़े के बाहर फर्श पर स्थित कैमरा कूलर चालू करें.
    4. (वे सभी उपयोग नहीं किया जाएगा, भले ही) sCMOS कैमरों के सभी चालू करें.
    5. लेजर और इलेक्ट्रॉनिक्स बाड़े के अंदर, पर बारी:
      1. साधन नियंत्रक चेसिस.
      2. Nanomotion चेसिस.
      3. जेड piezo के लिए जेना नियंत्रक.
      4. सभी 4 galvo मोटर नियंत्रकों.
      5. प्राथमिक लेजर नियंत्रण मॉड्यूल.
      6. माध्यमिक लेजर नियंत्रण मॉड्यूल.
      7. सभी कैमरे कार्यस्थानों.
      8. OMXIC वर्कस्टेशन.
    6. मास्टर नियंत्रक कार्य केंद्र पर, आइकन पर क्लिक करके OMX सॉफ्टवेयर खोलें. एक उपयुक्त डेटा फ़ोल्डर में डेटा सहेजने के लिए फ़ाइल पथ सेट करें.
    7. हार्डवेयर को प्रारंभ करने के लिए, हार्डवेयर मेनू में जाना हार्डवेयर चयन और पुनः प्रारंभ हार्डवेयर बटन पर क्लिक करें. विंडो बंद.
    8. (प्रयोगों के लिए आवश्यक लेज़रों पर 4 softWoRx software.Turn प्रारंभ88 एनएम).
    9. लेजर सुरक्षा गूंथ के लिए कुंजी स्विच ऑन करें.
    10. सही dichroic फिल्टर दराज उद्देश्य नीचे डाला जाता है सुनिश्चित करें. GFP के लिए, यह मानक (या फिक्स्ड) दराज है.
    11. OMX एस एफ में, फ़ाइल मेनू में जाना सेटिंग्स का चयन और दराज लटकती मेनू से निश्चित दराज का चयन करें. विंडो बंद.
    12. लाइट पैरामीटर खंड में सॉफ्टवेयर की मुख्य स्क्रीन से निम्न कार्य करें:
      1. चैनल चयन से उत्तेजना लेजर और उत्सर्जन फिल्टर (FITC) कैमरे के लिए उपयुक्त कैमरा सक्रिय करें.
      2. मोड अनुक्रमिक पर सेट है छवि की जाँच करें.
      3. प्रकाश पथ एसआई पर सेट है की जाँच करें.
      4. जाँचें मोड 95 मेगाहर्टज के लिए निर्धारित है.
      5. 488 लेजर उत्तेजना में चयनित है.
      6. सेट 1 एक्स 1 के लिए विंडो का आकार और Binning के लिए 512 x 512 आकार.
    13. प्रयोग टैब में, लटकती मेनू से एसआई पर सेट है सुनिश्चित करते हैं.
    14. सेक्शनिंग सक्रिय है सुनिश्चित करें और ऑप्टिकल अनुभाग रिक्ति 0.125 करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
    15. स्कैन शुरू होता बीच जब फोकस बिंदु सुनिश्चित करें.

3 छवि अधिग्रहण

  1. उद्देश्य के शीर्ष पर तेल की एक बूंद लागू करें. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए, की सिफारिश की शुरुआत के तेल सबसे अच्छा 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल कोशिकाओं माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया जेल पैड का अपवर्तनांक मैच के लिए 1.518 के अपवर्तनांक है (1.1.3 कदम देखें).
  2. मंच इनसेट में तैयार कोशिकाओं से युक्त नमूना पेट्री डिश प्लेस और परिपत्र हीटिंग ढक्कन के साथ कवर किया. तेल के तल छू तक मंच लोअरनमूना पेट्री डिश.
  3. डिश चरण में 15 मिनट के लिए गर्मी संतुलित करने की अनुमति दें. (लाइट पैरामीटर खंड में स्थित) 5 मिसे या उससे कम की एक कम एक्सपोजर सेटिंग का उपयोग, नैनो पोजीशनिंग मंच नियंत्रण (नैनो पोजिशनिंग खंड में स्थित dz,) का उपयोग नमूना पर ध्यान केंद्रित. ऊपर फोकस और प्रकाश नमूना फोकल हवाई जहाज़ के ऊपर और नीचे में समान रूप से फैला हुआ है तो नीचे नमूना के माध्यम से निर्धारित करने के लिए. बात फैल समारोह भी नहीं (गोलाकार विपथन) है, तो नमूना डिश के नीचे और क्लोरोफॉर्म साथ उद्देश्य साफ. तेल बदलें और एक उपयुक्त मैच गोलाकार विपथन को कम करने के लिए तेल और नमूना अपवर्तनांक के बीच पाया जाता है जब तक इस चरण को दोहराएँ.
  4. 0.5 माइक्रोन dZ कदम आकार का उपयोग, छवि ढेर के ऊपर और नीचे के निशान. नमूना के बीच करने के लिए लौटें. नमूना अधिग्रहण मोटाई निर्धारित करने के लिए प्रयोग टैब में जाओ मोटाई बटन पर क्लिक करें. Keeपी जेड के छल्ले के ऊपर और नीचे से काट नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा whilst एक न्यूनतम करने के लिए ढेर ऊंचाई. बी के लिए विशिष्ट मोटाई subtilis नमूने 2-3 माइक्रोन हैं.
  5. वर्तमान एक्सपोजर और% टी सेटिंग्स के साथ नमूना छवि की अधिकतम तीव्रता मूल्य (मैक्स) निर्धारित करते हैं. यह मान छवि खिड़की के नीचे पाया जाता है. समय चूक इमेजिंग के लिए, छवि के लिए 1,100-1,400 ऊपर पृष्ठभूमि की अधिकतम तीव्रता प्राप्त करने के लिए एक्सपोजर और% टी समायोजित. 1,000 से ऊपर पृष्ठभूमि की एक न्यूनतम तीव्रता छवि पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. एक से एक छवि के लिए, 4,000-5,000 के लिए अधिकतम तीव्रता में वृद्धि.
  6. प्रयोग टैब में समय चूक खंड सक्रिय करें. आवश्यक फ्रेम दर और कुल समय निर्धारित करें. डेटा फ़ाइल में, एक उपयुक्त फ़ाइल नाम दर्ज करें. छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए चलाएँ बटन पर क्लिक करें.
    नोट: छवि अधिग्रहण पूरा हो गया है जब जीREEN प्रगति बार समाप्त हो गया और एक लॉग फ़ाइल उपयुक्त डेटा फ़ोल्डर में डेटा सेट के लिए प्रकट होता है.

4 डाटा गुणवत्ता की जाँच

  1. छवि अधिग्रहण के शुरू में, समय की श्रृंखला का पहला फ्रेम के लिए छवि अधिग्रहण की शुरुआत में छवि की अधिकतम तीव्रता मूल्य ध्यान दें. पहला फ्रेम के अधिग्रहण के अंत में, यह पहला फ्रेम के लिए z ढेर के माध्यम से संकेत तीव्रता में 10% की कमी की तुलना में अधिक नहीं किया गया है कि जाँच करें. पहली बार बिंदु में photobleaching के इस स्तर की तुलना में अधिक कर दिया गया है, तो समय की श्रृंखला के माध्यम से डेटा के विश्लेषण के लिए अपर्याप्त गुणवत्ता का हो जाएगा और समय श्रृंखला अधिग्रहण रोका जा सकता है.
  2. समय श्रृंखला के अधिग्रहण के अंत में, .dv प्रत्यय के साथ जिसके परिणामस्वरूप कच्चे छवि फ़ाइल को खोलने और अंतिम छवि को समय श्रृंखला की शुरुआत से अधिकतम संकेत तीव्रता में कमी का पता लगाना. मधुमक्खी वहाँ है, जहां किसी भी समय अंक त्यागेंn 30% से अधिक photobleaching.

5 रिकांस्ट्रक्टिंग 3 डी सिम छवियों

  1. प्रक्रिया मेनू से, एसआई पुनर्निर्माण विंडो को सक्रिय करें. मानकों के सभी के लिए पूर्व मौजूदा सेटिंग्स का उपयोग करें.
  2. उपयोग चैनल विशिष्ट OTF बटन को सक्रिय, और मानक फिल्टर सेट करने के लिए निर्धारित किया है. KO बटन कोण और मानक फिल्टर सेट करने के लिए सेट का उपयोग चैनल विशिष्ट सक्रिय करें.
  3. खींचें और इनपुट फ़ाइल अंतरिक्ष में कच्चे (.dv) फ़ाइल ड्रॉप. यह मत करो क्लिक करें. _SI साथ इनपुट फ़ाइल अंत में जोड़ी के रूप में आउटपुट फाइल एक ही नाम होगा.
    नोट: यह पुनर्निर्माण प्रक्रिया कई सारी फाइलें संसाधित करने के लिए कर रहे हैं अगर प्रक्रिया मेनू से टास्क बिल्डर समारोह का उपयोग कर एक कार्य के रूप में चलाया जा सकता है.

6 डेटा निर्यात और विश्लेषण

  1. मोड और पूर्व पार में 3 डी छवियों कल्पना करने Imaris का प्रयोग करेंझगड़ा (300 डीपीआई) या AVI फ़ाइलें (कोई संपीड़न) के रूप में बंदरगाह छवि डेटा. Imaris में आकार माप मोड पार में माप उपकरण का उपयोग किया जा सकता है.
  2. 3 डी सिम छवि डेटा से जेड अंगूठी की 3 डी तीव्रता भूखंडों सृजन:
    1. जेड अंगूठी के आसपास FtsZ के वितरण की जांच करने और 3 डी तीव्रता भूखंडों बनाने के लिए
      1. व्यक्तिगत Z-स्लाइस देखने के लिए एक 3 डी छवि फ़ाइल खोलें. ब्याज की एक क्षेत्र की फसल के लिए दृश्य मेनू टैब के अंतर्गत स्थित मात्रा दर्शक उपकरण का प्रयोग करें.
      2. इनपुट विंडो में इस 3 डी छवि के लिए खिड़की नंबर दर्ज करें और आउटपुट विंडो में एक नई और अप्रयुक्त खिड़की नंबर दर्ज. क्षेत्र चुनें बटन देखने के मूल 40 × 40 माइक्रोन क्षेत्र से ब्याज की एक व्यक्ति जेड अंगूठी फसल के लिए उपलब्ध हो जाएगा.
      3. रोटेशन टैब में वांछित अक्ष और रोटेशन की डिग्री को समायोजित करें. क्या यह बटन पर क्लिक करें. जेड अंगूठी के वांछित परिप्रेक्ष्य प्राप्त करने के लिए खंड के माध्यम से स्क्रॉल करें.
      4. डेटा निरीक्षक उपकरण का उपयोग करें और टी समायोजितवह कॉलम / पंक्ति आयाम एक व्यक्ति जेड अंगूठी के आसपास ब्याज का एक नया क्षेत्र बनाने के लिए. ब्याज के इस नए क्षेत्र की स्थिति के लिए छवि के केंद्र पर क्लिक करें. पाठ छवि डेटा हित के क्षेत्र के भीतर प्रत्येक पिक्सेल की प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रदर्शित करता है कि एक स्वत: उत्पन्न तालिका है.
      5. शुरू में तीव्रता प्लाट देखने के लिए 3 डी ग्राफ बटन पर क्लिक करें.
      6. वैकल्पिक पाठ छवि डेटा फ़ाइल मेनू में बचाने तालिका डेटा बटन पर क्लिक करके निर्यात किया जा सकता है.
      7. एक नया फैल शीट में बचाया पाठ फ़ाइल से छवि डेटा कॉपी. प्रसार चादर के भीतर सभी कक्षों का चयन करें और एक नया 3 डी भूतल ग्राफ बना. प्रकाशन के लिए 3 डी तीव्रता साजिश ग्राफ प्रारूप.
    2. 3 डी छवि फ़ाइल से अलग समय बिंदुओं में से प्रत्येक पर 6.2.1.7 - समय चूक डेटा दोहराने के लिए 6.2.1.1 कदम.
  3. समय पर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रैकिंग
    1. Fluorescen ट्रैक करने के लिए पाठ छवि डेटा का प्रयोग करेंब्याज की एक क्षेत्र में समय के साथ CE तीव्रता.
    2. ब्याज की क्षेत्र के अनुरूप जो कोशिकाओं का चयन करें.
    3. ब्याज की इस क्षेत्र के लिए हर समय बिंदु पर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना.
    4. एक अलग लाइन ग्राफ उत्पन्न करने के लिए औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों का प्रयोग करें.

Representative Results

इस अध्ययन में हम, बैक्टीरिया कोशिका विभाजन प्रोटीन FtsZ कल्पना बैक्टीरियल प्रोटीन स्थानीयकरण और गतिशीलता के अध्ययन के लिए पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से अधिक f3D सिम के शक्तिशाली लाभ वर्णन करने के लिए, एक FtsZ-GFP संलयन के रूप में जीवित कोशिकाओं में व्यक्त की है. FtsZ सेल की परिधि के चारों ओर एक गतिशील अंगूठी संरचना में polymerizes कि एक ट्यूबिलिन तरह cytoskeletal प्रोटीन है. यह इस साइट पर सभी कोशिका विभाजन प्रोटीन रंगरूटों अपने विधानसभा डिवीजन के भविष्य साइट के निशान, और जेड अंगूठी कसना cytokinesis 17 के दौरान सेल लिफाफा के आंदोलन आवक अनुमति देने के लिए बल प्रदान करने के लिए प्रकट होता है: जेड अंगूठी कोशिका विभाजन में एक महत्वपूर्ण कार्य किया है , 18.

पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करते हैं, जेड अंगूठी ऐसे बी के रूप में सबसे अच्छी तरह से अध्ययन जीवों सहित, छड़ के आकार का जीवाणु में प्रतिदीप्ति की एक एकल अनुप्रस्थ बैंड के रूप में प्रकट होता है subtilis (2A चित्रा), <उन्हें> ए. कोलाई, और सी crescentus. महत्वपूर्ण बात है, इस बैंड भर प्रतिदीप्ति तीव्रता कम या ज्यादा समान होना प्रतीत होता है, और स्थानीयकरण पैटर्न जेड अंगूठी के भीतर संरचनात्मक संगठन और FtsZ पॉलिमर के वितरण में बहुत छोटी सी जानकारी प्रदान करता है. एक ही कोशिकाओं यहाँ वर्णित f3D सिम विधि (चित्रा 2 बी) का उपयोग करते हुए जांच कर रहे हैं, हालांकि, इस तकनीक का लाभ तुरंत स्पष्ट कर रहे हैं. सबसे पहले, Z-अक्ष के चारों ओर 3 डी सिम छवि के रोटेशन तीन आयामी अंतरिक्ष (आंकड़े -2 सी और 3 ए) में एक असली अंगूठी संरचना के रूप में जेड अंगूठी के दृश्य में सक्षम बनाता है. एक साथ संकल्प में वृद्धि के साथ, इस जेड अंगूठी में FtsZ का वितरण वास्तव में अत्यधिक विषम (चित्रा 3) है कि पता चलता है. संकल्प में सुधार भी अमेरिका में कोशिका झिल्ली की invagination ने संकेत एक प्रभाग पट (फॉर्म को कसना की प्रक्रिया शुरू कर दिया है कि जेड के छल्ले को देखने के लिए अनुमति देता है <मजबूत> चित्रा -2 और 2 डी).

बी के अतिरिक्त उदाहरण इस तकनीक द्वारा कल्पना subtilis जेड के छल्ले चित्रा 3Bi में दिखाए जाते हैं - 3Biv और जेड अंगूठी के आसपास प्रतिदीप्ति तीव्रता ही नहीं है वर्णन कैसे. इसके अलावा, बहुत कम प्रतिदीप्ति तीव्रता के क्षेत्रों अक्सर मनाया जाता है. हम अंतराल (सफेद तीर) के रूप में इन क्षेत्रों को देखें. 900 एनएम (93%) - हम जांच की सभी जेड के छल्ले (n = 84) के 15% में और मुख्य रूप से 800 की एक व्यास वाले जेड के छल्ले में इन कमियों का निरीक्षण. इन टिप्पणियों यों, 3 डी तीव्रता भूखंडों जेड अंगूठी का बनाया गया और आंकड़े 3Biii और 3Biv में दिखाया जेड के छल्ले का उपयोग चित्रा 3Ci और 3Cii में दिखाए जाते हैं. बी के विभिन्न क्षेत्रों में 4 गुना - तीव्रता भूखंडों आम तौर पर जेड अंगूठी में प्रतिदीप्ति की राशि अप करने के लिए 3 से भिन्न हो सकते हैं कि दिखाने subtilis जेड अंगूठी. इसके अलावा 3 डी तीव्रता भूखंडों गा बताते हैं किजेड अंगूठी अंदर प्रतिदीप्ति के पी एस लगभग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (चित्रा 3Ci में काला तीर) के आधारभूत स्तर पढ़ा. इन उपरोक्त उदाहरण जेड अंगूठी का अच्छा पुनर्निर्माण को दर्शाती है और पर्याप्त प्रकाश महत्वपूर्ण photobleaching बिना नमूना से उत्सर्जित किया जा रहा है पर निर्भर हैं. इस FtsZ और इन शर्तों के तहत सेल में इसकी बहुतायत (शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत) से जुड़े हुए GFP फ्लोरोफोरे की चमक के माध्यम से पूरा किया है. अन्य कक्षों में शोर अनुपात करने के लिए संकेत छवि के पुनर्निर्माण गरीब है कम है, जहां. FtsZ GFP, बी से एकत्र उत्सर्जन संकेत की राशि के साथ इस घटना अनुकरण subtilis कोशिकाओं उत्तेजना ऊर्जा को कम से कम हो गया था. चित्रा 3 डी में महत्वपूर्ण कलाकृतियों है कि जेड अंगूठी की एक छवि में उत्तेजना ऊर्जा परिणामों के एक 100 गुना कमी दिखाया गया है. इस FtsZ-GFP संकेत और पू के लिए अग्रणी पृष्ठभूमि के बीच अपर्याप्त स्थानीय विपरीत का एक परिणाम के रूप में होता हैछवि के आर पुनर्निर्माण.

दिलचस्प है, बी subtilis जेड के छल्ले अंगूठी के ऊपर और नीचे के क्षेत्रों में नहीं बल्कि अंगूठी (3B चित्रा) के पक्ष में अधिक स्पष्ट अंतराल और विविधता दिखाया. इस वजह से अक्षीय विमान की तुलना में पार्श्व विमान में 3 डी सिम के इस बदलाव से हासिल संकल्प में अंतर के कारण होती है. इस जेड अंगूठी (लेटरल विमान) के ऊपर और नीचे के क्षेत्रों में परिणाम इष्टतम संकल्प के साथ imaged किया जा रहा है. Z-अंगूठी में अंतराल पार्श्व विमान के बारे में आधा संकल्प किया है जो अक्षीय विमान में कल्पना के रूप में जेड अंगूठी के पक्ष में पता लगाया जा करने के लिए बहुत छोटे हैं. ऐसी एस के रूप में एक coccoid आकारिकी है कि जीवाणु, ऑरियस, सभी विमानों में तैनात हैं जो जेड के छल्ले है. यह (या इसे बंद) पार्श्व विमान में निहित इष्टतम संकल्प के साथ छवि को अंगूठी के सभी क्षेत्रों की क्षमता प्रदान करता है तो जब जेड अंगूठी इमेजिंग. इस का लाभ ले रहा है, हम की संरचना की जांच कीलाइव एस में जेड अंगूठी ऑरियस कोशिकाओं, एक प्लाज्मिड असर एक ftsZ-GFP संलयन जिसमें एक तनाव का उपयोग. इस फ्यूजन का उत्पादन एक पी SPAC inducible प्रमोटर के नियंत्रण में है (चरण 1.2.1 देखें). अक्षीय विमान, एस में साथ imaged जब ऑरियस जेड के छल्ले बी के समान दिखाई एक ही विमान (चित्रा 4Ai) में मौजूद हैं जो subtilis जेड के छल्ले. हालांकि, पार्श्व विमान में इमेजिंग जेड के छल्ले पूरे जेड अंगूठी मनका की तरह है और विषम दोनों दिखाई दिया कि पुष्टि की. इन छल्लों के बारे में 26% भी (चित्रा 4Aii, 4 बी) प्रतिदीप्ति की कम से कम एक दिखाई "" अंतर दिखाया. बी के लिए इसी प्रकार एस के विभिन्न क्षेत्रों में 6 गुना - subtilis FtsZ, प्रतिदीप्ति तीव्रता भूखंडों जेड अंगूठी में प्रतिदीप्ति की तीव्रता के रूप में ज्यादा के रूप में 4 से भिन्न होता है कि दिखाने ऑरियस जेड अंगूठी (चित्रा 4C).

मोतियों की लंबाई और चौड़ाई मापा जा सकता है () चित्रा 4D में योजनाबद्ध देखें. यह जांच की गई कि जेड के छल्ले (n = 43) की 80% 400 एनएम का अधिकतम लंबाई तक पहुँचने, 200 एनएम का मनका लंबाई था कि पता चला है. मोतियों की चौड़ाई, दूसरे हाथ पर, 200 एनएम को मापा. जेड अंगूठी प्रति औसत 12 ± 2 (SEM) FtsZ मोती पर हुई थी. देशी FtsZ (देशी FtsZ के अलावा ftsZ-GFP की अभिव्यक्ति के कारण इस विषम और मोती की तरह स्थानीयकरण पैटर्न वास्तविक था कि दिखा immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग इन तरीकों (IFM) और नहीं एक विरूपण साक्ष्य के साथ डेटा नहीं कल्पना की गई थी, जब इसी तरह के स्थानीयकरण डेटा मनाया गया दिखाया गया है). 3 डी सिम की इस उन्नति जेड अंगूठी एक विषम संरचना के रूप में प्रकट होता है और प्रकृति में संभवतः टूटनेवाला है कि दिखाने के लिए सक्षम है.

इस विषम z-अंगूठी संरचना कसना आए और कोशिका विभाजन की सुविधा कैसे के सवाल का पता करने के लिए, जेड अंगूठी गतिशीलता का एक समय चूक विश्लेषण किया जा सकता है. साथ मुख्य चुनौतियों में से एकप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी समय चूक पढ़ाई इमेजिंग के दौरान नमूना photobleaching और phototoxicity के न्यूनतम में है. 3 डी सिम कच्चे छवियों की एक बड़ी संख्या समय के साथ एक नमूना की photobleaching उपयुक्त छवि पुनर्निर्माण अनुमति देने के लिए अपर्याप्त संकेत करने के लिए अग्रणी एक गरीब संकेत करने वाली शोर अनुपात में परिणाम होगा जिसका मतलब है कि प्राप्त किया जा करने की आवश्यकता है. नई प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के प्रत्येक जोखिम और इसलिए जीवित कोशिकाओं में प्रवेश ऊर्जा में कमी के लिए इस्तेमाल उत्तेजना ऊर्जा की मात्रा को कम करता है. यह नमूना पर संरचित पैटर्न और संवेदनशीलता और क्वांटम दक्षता बढ़ाने के जो वैज्ञानिक CMOS कैमरों का उपयोग बनाने के लिए प्रकाश किरण इंटरफेरोमेट्री के संयोजन के द्वारा इस करता है. के हमारे पिछले चलना साथ प्राप्त 5-8 सेकंड (512 x 512 पिक्सल एक्स 8 Z-स्लाइस) प्रति 1 माइक्रोन की तुलना में प्रति सेकंड 1 माइक्रोन (512 × 512 पिक्सल x 8 Z-स्लाइस) के z ढेर अधिग्रहण में इस संयोजन के परिणाम (Riglar एट अल. 26 में वर्णित) 3 डी सिम.छवि अधिग्रहण के समय और प्रदर्शन सेटिंग्स को घटाना भी समय चूक अध्ययन में विशेष रूप से प्रासंगिक है जो जीवित कोशिकाओं के phototoxicity कम करने में मदद कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत नई तकनीक भी हम इस संदर्भ में छवि अधिग्रहण के दौरान बदलते प्रोटीन का स्थानीयकरण करने के लिए संदर्भित करता है जो 'गति कलंक' के रूप में देखें कि जीना सेल इमेजिंग में एक और समस्या को हल. छवि अधिग्रहण के समय कम करके 'गति कलंक' की राशि इस प्रकार एक अधिक सटीक छवि पुनर्निर्माण बनाने कम से कम है.

FtsZ जेड अंगूठी के भीतर आयोजित किया जाता है कैसे संबोधित किया है कि पिछले अध्ययनों जेड अंगूठी संरचना में समय के साथ परिवर्तन कैसे दिखाने के लिए सक्षम नहीं किया गया है. इस पहलू की जांच करने के लिए हम f3D सिम का उपयोग कर समय व्यतीत प्रदर्शन किया. बी जेड अंगूठी की एक 3 डी सिम छवि का यह सक्षम अधिग्रहण इस समय के पैमाने पर पहले संभव नहीं था, जो 50 सेकंड की अवधि में subtilis हर 5-10 सेकंड. चित्रा 5A में दिखाया गया है एक exampl हैसमय के साथ जेड अंगूठी के भीतर FtsZ वितरण में तेजी से बदलाव के ई (890 एनएम व्यास). कसना की प्रक्रिया में दिख रहे थे कि अन्य जेड के छल्ले भी जेड अंगूठी के आसपास FtsZ का वितरण प्रभावित है कि इसी तरह की गतिशीलता है दिखाया गया () नहीं दिखाया. 3 डी तीव्रता भूखंडों भी यों और सेकंड के एक समय के पैमाने (चित्रा 5 ब) पर नित्य प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन और जेड अंगूठी के विभिन्न क्षेत्रों में FtsZ की इस प्रकार रिश्तेदार बहुतायत सराहना करने के लिए समय बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए उत्पन्न किया जा सकता. हित के क्षेत्रों प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 5C) के उतार चढ़ाव पर नज़र रखने के लिए इन तीव्रता भूखंडों से पहचाना जा सकता है. इन शर्तों के तहत जेड अंगूठी संरचना में इन परिवर्तनों को ट्रैक उन्नत f3D सिम प्रौद्योगिकी के बिना लगभग असंभव हो जाएगा. इसके अलावा, इस काम एस में पता चला है कि ऑरियस FtsZ की गतिशील आंदोलन बी में मनाया के समान है subtilis. एस ऑरियस RN4220 कोशिकाओं जनसंपर्कoducing FtsZ-GFP 10 सेकंड समय के अंतराल पर 50 सेकंड के लिए imaged थे. एस में जेड अंगूठी की विविधता में परिवर्तन f3D सिम के साथ ऑरियस बी को भी इसी तरह के थे subtilis (चित्रा 6 में तीर और तीर देखें). ये समय व्यतीत हो पढ़ाई तय सी की परीक्षा के माध्यम से भविष्यवाणी की थी कि जेड अंगूठी कसना (चलने बन्द रखो मॉडल) के एक मॉडल का समर्थन crescentus कोशिकाओं, लेकिन कारण जीवित कोशिकाओं 27 में जेड अंगूठी गतिशीलता की जांच की जरूरत का प्रदर्शन नहीं किया जा सका.

चित्रा 1
लेजर तालिका से इस अध्ययन. लेजर प्रकाश में इस्तेमाल किया f3D सिम की ऑप्टिकल विन्यास चित्रा 1 योजनाबद्ध तो विशिष्ट तरंगदैर्ध्य दोनों बनाता है कि चरण नियंत्रण मॉड्यूल में, एक collimating लेंस के लिए एक सिम फाइबर के माध्यम से निर्देशित और झंझरी तय हो गई है इष्टतम रिक्ति ओशून्य आदेश केंद्रीय बीम से ± 1 सेंट आदेश मुस्कराते हुए और सिम संग्रह के लिए चरण चरणों च. मुस्कराते हुए फिर मुस्कराते हुए रोशनी के 3 कोण बनाने के लिए 3 अलग अलग समूहों को परिलक्षित होते हैं जहां कोण नियंत्रण मॉड्यूल दर्ज करें. मुस्कराते हुए तो माइक्रोस्कोप और के रूप में दिखाया प्रकाश पथ (पॉल गुडविन से अनुमति के साथ संशोधित, एपीआई) दर्ज करें.

चित्रा 2
बी के पारंपरिक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति और 3 डी सिम इमेजिंग चित्रा 2 तुलना करें ftsZ-GFP व्यक्त subtilis कोशिकाओं. (ए) बी के परम्परागत व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति इमेजिंग ftsZ-GFP व्यक्त subtilis कोशिकाओं, एक भी कॉपी के रूप में (SU570 हरा) भी झिल्ली डाई FM4-64 (लाल) के साथ दाग रहे थे. स्केल बार = 5 माइक्रोन. छवि एक ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग अधिग्रहण कर लिया था.(बी) एक ही बी के 3 डी सिम इमेजिंग FM4-64 साथ दाग ftsZ-GFP व्यक्त subtilis तनाव. छवि से हित के क्षेत्रों में ज़ूम करने के लिए (धराशायी बॉक्स) का चयन किया जा सकता है. छवि भी अक्षीय विमान में 3 डी FtsZ छल्ले देखने के लिए Z-अक्ष के चारों ओर घुमाया जा सकता है. (सी, डी) को हटाने के बाहर के- फोकस प्रकाश और 3 डी सिम द्वारा प्रदान की बेहतर छवि संकल्प (बाधा कर रहे हैं कि उन सहित) जेड के छल्ले का स्पष्ट दृश्य और (सफेद तीर द्वारा संकेत) विभाजन के दौरान आंतरिक कोशिका झिल्ली की अनुमति देता है. प्रोटोकॉल पाठ एक एकल फ्लोरोफोरे के दृश्य का वर्णन ध्यान दें. हालांकि, प्रक्रिया एक साथ चार अलग अलग तरंग दैर्ध्य अप करने के लिए प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. यह आंकड़ा स्ट्रॉस एट अल 16 से reprinted किया गया है.

चित्रा 3
चित्रा 3. 3 डी सिम का उपयोग FtsZ-GFP व्यक्त लाइव छड़ के आकार का जीवाणु कोशिकाओं (बी subtilis) में जेड अंगूठी के प्रतिनिधि छवियाँ. (ऐ) जेड अंगूठी XY विमान में है जो कोशिका की लंबी अक्ष को सीधा प्रतिदीप्ति के एक बैंड के रूप में मनाया जाता है. (वो) छवि Imaris 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर (प्रोटोकॉल का उल्लेख करने का उपयोग धुरी Z चारों ओर घुमाया गया है 6.1 कदम) तो FtsZ जेड अंगूठी के भीतर वितरित किया जाता है कैसे स्पष्ट रूप से देखने के लिए कि एक अंगूठी संरचना के माध्यम से देख रहा है. इस छवि, अब zx विमान में अंगूठी नहीं के क्षेत्रों या बहुत कम प्रतिदीप्ति (सफेद तीर) के साथ FtsZ की एक विषम वितरण किया गया है कि पता चलता है. छवि प्रतिदीप्ति के इन 'गैप' क्षेत्रों का निरीक्षण करने के लिए घुमाया जाना चाहिए. द्विपक्षीय BIV अब zx विमान में झूठ है कि घुमाया जेड के छल्ले के आगे उदाहरण दिखा. (बीआई-III) 0.9 माइक्रोन ~ की एक व्यास में जेड के छल्ले. (BIV) onl की एक व्यास के साथ एक जेड अंगूठी से पता चलता हैवाई 0.65 माइक्रोन के दौर से गुजर कसना. (सीआई) यह ठेठ 3 डी तीव्रता प्रोफाइल प्रतिदीप्ति तीव्रता (यानी एकाग्रता) दिखाता है 0.85 माइक्रोन की एक व्यास वाले जेड अंगूठी के आसपास FtsZ-GFP में मतभेद (प्रोटोकॉल 6.1-6.3 कदम को देखें). इन अंतराल में प्रतिदीप्ति का स्तर कम है और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर (काला तीर) दृष्टिकोण. (सीआईआई) कसना की प्रक्रिया में एक जेड अंगूठी का ऐसा ही एक 3 डी तीव्रता प्रोफ़ाइल. FtsZ-GFP एकाग्रता गैर वर्दी भी है; व्यास, 0.65 माइक्रोन. पैनलों ए, बी, सीआई और सीआईआई स्ट्रॉस एट अल 16 से reprinted किया गया है.

चित्रा 4
एस के 4. प्रतिनिधि 3D सिम छवियों चित्रा इन कोशिकाओं (COCCI) दौर चूंकि FtsZ-GFP उत्पादन ऑरियस कोशिकाओं., जेड अंगूठी हवलदार जाएगाविभिन्न झुकाव ई. चित्रा 1Ai के लिए के रूप में जेड धुरी के चारों ओर घुमाया जब (एआई) के रूप में दिखाया सामान्य देखने अभिविन्यास में प्रतिदीप्ति के एक बैंड बताते हैं कि कोशिकाओं (कि XY विमान में है), छड़ के आकार की कोशिकाओं में उन लोगों के लिए बहुत इसी तरह लग रहे. (वो) में जेड अंगूठी XY विमान में पहले से ही है; पार्श्व अभिविन्यास और संकल्प अब एक मनका जैसी संरचना (बी) देता है जो पूरे अंगूठी पर अधिक से अधिक है. (सी) जेड अंगूठी में FtsZ-GFP के रिश्तेदार बहुतायत के एक 3 डी तीव्रता साजिश है. (डी) एस के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व . ऑरियस जेड अंगूठी. लाल तीर मनका लंबाई और चौड़ाई आयामों (प्रोटोकॉल कदम 6.1 देखें) से संकेत मिलता है. यह आंकड़ा स्ट्रॉस एट अल 16 से संशोधित किया गया है.

चित्रा 5
<मजबूत> चित्रा 5 f3D सिम 3 डी सिम में समय के साथ FtsZ स्थानीयकरण के तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है. (ए) छड़ के आकार बी में जेड अंगूठी के भीतर FtsZ-GFP वितरण में परिवर्तन subtilis कोशिकाओं की अंगूठी की गतिशीलता इंगित करने के लिए देखे जा सकते हैं. समय (सेक) प्रत्येक छवि के ऊपरी बाएं कोने पर संकेत दिया है. (बी) 3 डी प्रतिदीप्ति तीव्रता भूखंडों गैर वर्दी और जेड अंगूठी में FtsZ की गतिशील वितरण दिखा. में (सी) FtsZ गतिशीलता (FtsZ-GFP प्रतिदीप्ति परिवर्तन अंगूठी) भी ब्याज के दो क्षेत्रों में समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाता द्वारा अधिक विस्तार से जांच की जा सकती है. यह आंकड़ा स्ट्रॉस एट अल 16 से reprinted किया गया है.

चित्रा 6
चित्रा 6 f3D सिम समय चूक छवियों एस में समय के साथ रिंग के भीतर FtsZ स्थानीयकरण में परिवर्तन दिखाने एकयह शुरू में जेड अंगूठी में पता चला है जब ureus. एक सफेद नोक एक अंतर को दर्शाता है. समय के साथ एक ही स्थिति में अंतराल की उपस्थिति और लापता होने (सफेद नोक द्वारा चिह्नित के रूप में) FtsZ जेड अंगूठी के आसपास पुनः वितरित दिखाता है कि कैसे. व्हाइट तीर बाद में समय बिंदुओं पर जेड अंगूठी में अंतराल के गठन का संकेत मिलता है. समय (सेक) छवियों के ऊपरी बाएं हाथ की ओर दिखाया गया है. यह आंकड़ा स्ट्रॉस एट अल 16 से संशोधित किया गया है.

Discussion

फ्लोरोसेंट जीना सेल इमेजिंग समय के साथ कोशिकाओं के भीतर गतिशील परिवर्तन के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है कि एक शक्तिशाली उपकरण है. बैक्टीरिया कोशिका जीव विज्ञान के लाइव इमेजिंग क्योंकि छोटे सेल आकार का चुनौतीपूर्ण हो गया और उत्तेजना प्रकाश को दोहराया जोखिम झेलने में बैक्टीरियल कोशिकाओं की क्षमता कम हो गया है. f3D सिम सभी कोशिका जीव विज्ञान से पूछताछ करने के लिए उपलब्ध उपकरणों का विस्तार किया गया है, लेकिन यह खराब कार्यान्वित अगर कलाकृतियों को पेश किया जा सकता है के रूप में ध्यान से इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. इस तकनीक के सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कारणों में से एक नंबर रहे हैं. यह सही छवि पुनर्निर्माण सक्षम करने से परहेज किया जाना चाहिए उत्सर्जित प्रकाश, अपवर्तनांक बेमेल और उत्सर्जित प्रकाश का गोलाकार विपथन की बात फैल समारोह के उपयोग पर निर्भर करता है कि एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति इमेजिंग विधि है. एक उच्च गुणवत्ता के 0.17 मिमी मोटाई की coverslips के उपयोग के कारण कवर में कांच मोटाई परिवर्तनशीलता के संकेत तीव्रता के परिवर्तन से बचने के लिएहोंठ अत्यधिक की सिफारिश की है. यह ध्यान से सभी प्रयोगों के प्रारंभिक चरणों के दौरान उत्सर्जित प्रकाश का गोलाकार विपथन का मूल्यांकन करने और जरूरत के रूप में विसर्जन तेल अपवर्तनांक समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह तापमान और नमूना के बढ़ते मीडिया / सब्सट्रेट दोनों पर निर्भर है के रूप में इस दिन को दिन से भिन्न हो सकते हैं. गलत तेल का उपयोग ऐसे halos और गूंज संकेत के रूप में कलाकृतियों के साथ छवियों के अवर पुनर्निर्माण में परिणाम होगा.

छवि पुनर्निर्माण प्रक्रिया के अंत में, प्रत्येक चरण के लिए पुनर्निर्माण की गुणवत्ता का एक उपाय रोशनी के प्रत्येक चरण / कोण के लिए "ko कोण के लिए सबसे अच्छा फिट" के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. इस मूल्य प्रत्येक कोण के लिए 1 से कम है, तो खंगाला की गुणवत्ता शायद सबसे अधिक हो जाएगा. इस मूल्य 6 से ऊपर है, तो यह खंगाला छवि कलाकृतियों में शामिल होंगे कि सबसे अधिक संभावना है. आम कलाकृतियों मैं) संगत छवि में धारियों की उपस्थिति में शामिलग्रिड के कोण से एक है. यह है कि ग्रिड कोण से कम संकेत से हो सकता है; द्वितीय) संरचनाओं के आसपास haloing. यह आसपास के ढांचे की तुलना में उज्जवल संरचनाओं से संकेत के बहुत असमान स्तर से हो सकता है, तेल के अपवर्तनांक की एक बेमेल और नमूना या छवि होने के लिए पर्याप्त "संरचना" युक्त भी बेढब जा रहा है और नहीं में संरचनाओं की वजह से हो सकता है कलन विधि द्वारा मान्यता प्राप्त; आम तौर पर उच्च पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए, छवि में शोर अनुपात करने के लिए एक कम संकेत से जो परिणाम iii) 'honeycombing'; चतुर्थ) XY में लम्बी फैला रहे हैं कि संरचनाओं / कारण तेल और नमूना का अपवर्तनांक बेमेल हो सकता है. यह विरूपण साक्ष्य एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता के लिए विचार करने के लिए मुश्किल है. यह इस तकनीक का उपयोग करने के लिए शुरू जब नए उपयोगकर्ताओं छवि व्याख्या और विश्लेषण पर सलाह के लिए एक अनुभवी सिम शोधकर्ता परामर्श की सिफारिश की है.

सभी फ्लोरोसेंट जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों के साथ के रूप में, यह आयात हैचींटी ध्यान से photobleaching और न्यूनतम विरूपण साक्ष्य के साथ छवियों को फिर से संगठित करने के लिए आवश्यक पर्याप्त उत्सर्जन संकेत के साथ कोशिकाओं की phototoxicity की डिग्री को कम करने के क्रम में उत्तेजना ऊर्जा इनपुट संतुलन. अत्यधिक photobleaching (एक z ढेर अधिग्रहण भर में अधिक से अधिक से अधिक 30%) खंगाला छवि में एक स्ट्राइपिंग पद्धति को बढ़ावा मिलेगा. SCMOS कैमरों के उपयोग के साथ, सुपर संकल्प छवियों सफलतापूर्वक पृष्ठभूमि ऊपर 1,000 मायने रखता है जितनी कम उत्सर्जन संकेत के साथ कच्चे छवियों से खंगाला जा सकता है. यह बहुत ही कम जोखिम बार जिससे photobleaching कम करने और प्रत्येक फ्रेम के लिए तेजी से कब्जा सक्षम बनाने के लिए अनुमति दे सकते हैं. यह भी कोशिकाओं उत्तेजना ऊर्जा इनपुट से उबरने के लिए फ्रेम के बीच समय की मात्रा बढ़ जाती है. प्रत्येक व्यक्ति के फ्रेम के लिए कब्जा समय बहुत ही कम किया जा सकता है के रूप में इसके साथ ही, एक व्यक्ति को पकड़ने के दौरान 'गति कलंक' द्वारा शुरू विरूपण साक्ष्य की डिग्री इस पद्धति के उपयोग के साथ कम हो जाता है.

इस vari3 डी सिम का व्यावहारिक बैक्टीरिया कोशिका जीव द्वारा लाइव इमेजिंग के लिए अन्य उपलब्ध सुपर और उच्च संकल्प इमेजिंग तकनीकों से अधिक अन्य लाभ के एक नंबर प्रदान करता है. सभी 3 आयामों में संकल्प में 2 गुना वृद्धि हुई है और एक नमूना में 30 माइक्रोन के लिए ऊपर छवि की क्षमता एक प्रयोग के दौरान पूरे जीवाणु (और स्तनधारी) कोशिकाओं की इमेजिंग सक्षम बनाता है. सामान्यतः क्षणभंगुर लहर में प्रदर्शन कर रहे हैं कि इस तरह के एकल अणु स्थानीयकरण के रूप में तकनीक एक नमूना में प्रवेश की गहराई को प्राप्त नहीं कर सकते हैं और पूरे कोशिकाओं के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. इस तकनीक के लिए उच्च नमूना गहराई की अनुमति है कि हाल के अग्रिमों पूरे कोशिकाओं के बेहतर अक्षीय संकल्प में हो सकता है. साथ ही, यह भी स्थानिक संकल्प के रूप में, पर कब्जा कर लिया जा सकता है और कब्जा फ्रेम दर और परम हासिल स्थानिक संकल्प के बीच समझौता पड़ सकता है जो फ्रेम दर में सीमित कर रहे हैं हासिल करने के लिए कच्चे छवियों के हजारों की आवश्यकता है कि एकल अणु स्थानीयकरण तकनीक पर निर्भर है ईव की संख्याएक परिभाषित अंतरिक्ष के भीतर दर्ज एनटीएस. पर कब्जा कर लिया तख्ते की संख्या कम एक कम स्थानिक संकल्प में परिणाम होगा लेकिन ब्याज की जैविक प्रक्रिया के लिए आवश्यक अस्थायी समाधान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. फ्रेम के बीच वसूली समय की राशि भी है, जिससे समय श्रृंखला प्राप्त किया जा सकता है, जिस पर अवधि और आवृत्ति सीमित जीवित कोशिकाओं में phototoxicity कम करने के लिए वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है. ऐसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) या इलेक्ट्रॉन cryotomography (ईसीटी) के प्रस्ताव के रूप में उच्च संकल्प तकनीक 3 डी सिम (और अन्य सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक) से अधिक संकल्प वृद्धि हुई है लेकिन तय नमूनों पर किया जाना चाहिए. फिक्सिंग और प्रसंस्करण कलाकृतियों को पेश हो सकता है और लेबलिंग की कमी व्याख्या मुश्किल कर सकते हैं. लेबल मुक्त ईसीटी गरीब विपरीत है और चारों ओर 500-200 एनएम 24 का नमूना पैठ गहराई प्राप्त कर सकते हैं, तो ब्याज की प्रोटीन की पहचान की जा सकती है, भले ही एक पूरी बैक्टीरिया कोशिका में प्रोटीन की संरचना देखा नहीं जा सकता.लेबलिंग इस तरह के immunogold साथ के रूप में उन्हें, में इस्तेमाल किया जा सकता है, तब भी जब इमेजिंग केवल 2 डी में किया जाता है. 3 डी पतली सेक्शनिंग और वर्गों के कम्प्यूटेशनल पुनर्निर्माण के साथ ही प्राप्त है. पतली सेक्शनिंग एक अनुभवी तकनीशियन की आवश्यकता है लेकिन समस्याग्रस्त हो और विरूपण साक्ष्य के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. लाइव या तय कोशिकाओं के साथ, 3 डी सिम एक विशिष्ट तरीके से एम्बेड करने और कोशिकाओं को तेजी से एक के पास देशी राज्य में इमेजिंग के लिए तैयार किया जा सकता है की जरूरत नहीं है.

इस विधि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में कम से कम अनुभव के साथ शोधकर्ताओं द्वारा लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. प्रयोग के रूप में लंबे समय से यह प्रतिदीप्ति या अनुचित पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न नहीं करता है के रूप में स्वस्थ कोशिका समारोह का समर्थन है कि मीडिया में प्रदर्शन किया जा सकता है. बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए, यह जटिल और कम से कम मीडिया या बैक्टीरिया कोशिका गतिशीलता को नियंत्रित करने के लिए ठोस या अर्द्ध ठोस मीडिया के उपयोग से कई प्रकार के उपयोग की अनुमति सकता है. पहले से ही फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) fusions इंजीनियर और की कार्यक्षमता का परीक्षण किया है, जो कई जीवइन fusions आगे इंजीनियरिंग और नए photoactivatable एफपी fusions के साथ सत्यापन के बिना तेजी से इस प्रौद्योगिकी का समय लग सकता है. हम एक सामान्य अवलोकन के रूप में, पाया कि एस ऑरियस बी से एफपी fusions के साथ इमेजिंग के दौरान photobleaching के लिए अतिसंवेदनशील था subtilis. ग्रिड पैटर्न एक भौतिक झंझरी द्वारा उत्पन्न किया गया था, जहां हमारे मूल 3 डी सिम तरीकों का उपयोग कर, हम एस के एक नंबर के साथ लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन करने में असमर्थ थे ऑरियस एफपी fusions. हालांकि, इस उन्नत f3D सिम विधि के साथ, हम छवि को इन एफपी fusions में सक्षम थे और इन टैग प्रोटीन की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए कम समय श्रृंखला प्रदर्शन करते हैं. यह सबसे शायद इमेजिंग के लिए आवश्यक है और सेल वसूली के लिए फ्रेम के बीच समय में वृद्धि हुई कम जोखिम बार की वजह से है.

OMX ब्लेज़ 3 डी सिम अपेक्षाकृत आसानी से एक भी प्रयोगशाला या एक कोर इमेजिंग सुविधा में लागू किया जा सकता है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रौद्योगिकी है. केयर आरती से बचने के लिए तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए लिया जाना चाहिएगरीब नमूना तैयार करने या गरीब छवि पर कब्जा करने के कारण तथ्यों. तकनीक में महारत हासिल हो जाने के बाद, बैक्टीरिया जैसे छोटे जीवों में प्रोटीन संरचना के अध्ययन और गतिशीलता एकल या बहु रंग प्रतिदीप्ति में किया जा सकता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose I (Biotecnology grade) AMRESCO 0710-500G Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media.
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) Life Technologies T-13320 Lipophylic dye used for staining cell membranes.
1.5 ml microtube, graduated Natural Scientific specialties Inc. 1210-00 Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization.
Luria broth base, Miller BD 241420 Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving.
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 BD 210932 Prepared according to manufacturer's instructions.
Adhesive frame Thermo-Fisher Scientific ABGAB-0577 Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm).
Microscope cover glass Thermo-Fisher Scientific 111512-9 22 x 22 No. 1 Thickness
35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom World precision instruments FD35-100 Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378-25G Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Lincomycin hydrochloride Sigma  L6004-5MU Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol.
Erythromycin Boehringer Mannheim GmbH 12390120-14 Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Combined orbital/linear shaking waterbath Grant scientific Instruments OLS-200 Shaking speed used for cultures: 215 rpm
UV visible spectrophotometer Shimadzu UV-1601 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures.
Centrifuge Eppendorf 5415R Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma 15502-10G Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use.
softWoRx software Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company version 5.0
Imaris data analysis software Bitplane Scientific Software, Bitplane AG version 7.0.0 Matlab XTensions included
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company Blaze module fitted on OMX V3
Upright fluorescence microscope Zeiss Axioplan 2

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 91 सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी OMX 3 डी सिम ब्लेज़ कोशिका विभाजन बैक्टीरिया, FtsZ जेड अंगूठी कसना
फास्ट 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग जीवित बैक्टीरिया में Cytokinetic जेड अंगूठी के सुपर संकल्प इमेजिंग (f3D सिम)
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Turnbull, L., Strauss, M. P., Liew, A. T. F., Monahan, L. G., Whitchurch, C. B., Harry, E. J. Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM). J. Vis. Exp. (91), e51469, doi:10.3791/51469 (2014).

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