Biology

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Published: September 29, 2014 doi: 10.3791/51469

Lynne Turnbull*¹, Michael P. Strauss*¹, Andrew T. F. Liew¹, Leigh G. Monahan¹, Cynthia B. Whitchurch¹, Elizabeth J. Harry¹

¹The ithree Institute, University of Technology, Sydney

* These authors contributed equally

Abstract

التصوير من العينات البيولوجية باستخدام المجهر مضان تقدمت بشكل كبير مع التكنولوجيات الجديدة للتغلب على قرار حاجز حيود الضوء السماح فائقة الدقة من العينات الحية. يوجد حاليا ثلاثة أنواع رئيسية من تقنيات فائقة الدقة - حفز نضوب الانبعاثات (STED)، واحدة جزيء التوطين المجهري (بما في ذلك تقنيات مثل النخيل، STORM، وGDSIM)، ومنظم المجهري إضاءة (SIM). في حين تشير توطين تقنيات STED واحد جزيء أكبر الزيادات في القرار، فقد كانت أبطأ لتقديم زيادة سرعات من الحصول على الصور. SIM ثلاثي الأبعاد (3D-SIM) هي واسعة المجال المجهري مضان تقنية أن تقدم عددا من المزايا على حد سواء واحدة جزيء التوطين وSTED. تم تحسين القرار، مع قرارات نموذجية الجانبية ومحوري من 110 و 280 نانومتر، على التوالي وعمق أخذ العينات تصل إلى 30 ميكرون من ساترة، والسماح لالتصوير الخلايا بأكملها. التطورات الأخيرة (سريع 3D-SIM) في التكنولوجيا زيادة معدل التقاط الصور الخام تسمح لالتقاط سريع من العمليات البيولوجية التي تحدث في ثوان، في حين خفض ملموس الصور وphotobleaching من سمية. نحن هنا وصف استخدام واحدة من هذه الطريقة لصورة الخلايا البكتيرية إيواء fluorescently البروتين المسمى cytokinetic FtsZ لاظهار كيف يتم تحليل الخلايا ونوع المعلومات الفريدة التي يمكن أن توفر هذه التقنية.

Introduction

تم استخدام عدد من تقنيات التصوير المختلفة على مر السنين لدراسة البكتيريا بما في ذلك مختلف الإلكترون المجهري والتقنيات البصرية. في حين يقدم المجهر الإلكتروني عالية للغاية القرار، وصولا الى نانومتر، والحاجة إلى فراغ واستخدام عوامل التباين قد حد من هذه التقنية لعينات الثابتة والمدمجة. ويمكن أيضا إدخال القطع الأثرية بسبب مطول إعداد العينات وهناك حاجة إلى ممارس المهرة لإعداد العينات، وتحليل وتفسير الصور الناتجة. المجهر الضوئي يوفر فوائد بساطة إعداد العينات وتطبيق تسميات متعددة مع السهولة النسبية مقارنة مع المجهر الإلكتروني. باستخدام البروتينات الفلورية وتقارن صبغ، والقدرة على دراسة الخلايا الحية مع مضان المجهري هو ممكن أيضا. مع تحسينات في الاستقرار fluorophore وبروتين فلوري حجم / هيكل مما يؤدي إلى انخفاض سمية الخلايا، فضلا عن التقدم في الكشف عن كاميرا ميتاليكology، المجهري مضان باستخدام أنظمة التصوير مبائر واسعة المجال، وتوسعت بشكل كبير من فهمنا لديناميات المكانية من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات، معرفتنا الخلية البكتيرية على مدى السنوات ال 20 الماضية قد تقدم كثيرا إلى نظرة أكثر تفصيلا بكثير مما يكشف عن مستوى عال من التنظيم الهيكلي والبروتين داخل الخلية البكتيرية ^1.

ومع ذلك، الأساليب التقليدية للالمجهر الضوئي هي حيود محدود، وهذا يعني أن القرار الأصيل هو ما يقرب من نصف الطول الموجي للضوء الإثارة المستخدمة. ونتيجة لذلك، حتى مع النظام التقليدي المجهر الضوئي الأكثر الأمثل، وأفضل قرار الجانبي حوالي 220-250 نانومتر، والقرار المحوري حوالي 500 نانومتر (للمراجعة نرى Schermelleh وآخرون. ^2). لعلماء الأحياء الخلايا البكتيرية على وجه الخصوص، وهذا لا يزال يحد بشدة فهمنا للمنظمة المكانية من هذه الخلايا الصغيرة؛ يجري فقط 1-2 ميكرون في بقطرالعطر و1-10 ميكرون في الطول. وهناك أيضا حاجة إلى تقنيات عالية الدقة التي يمكن القيام بها على الخلايا الحية حيث يمكن تحليل السلوك المكاني الديناميكي للبروتين لاستكمال البيانات في المختبر.

على مدى العقد الماضي، وضعت عدة تقنيات التصوير مضان فائقة القرار. يصف فائقة قرار المجهري تقنيات التصوير التي على الأقل ضعف القرار الجانبي الحصول عليها مع ضوء المجهر التقليدي، وبالتالي التغلب على حاجز الحيود. هذه التقنيات التلاعب الإضاءة و / أو تحليل الضوء المنبعث لخلق الزيادات الحقيقية في القرار واضح. يوجد حاليا ثلاثة أنواع رئيسية من تقنيات فائقة الدقة - ط) حفز نضوب الانبعاثات المجهري ³ (STED). ب) المجهر واحدة جزيء التوطين، بما في ذلك تقنيات مثل تنشيط ضوئي توطين ^4،5 المجهري (PALM)، ستوكاستيك المجهر الضوئي إعادة الإعمار 7 (dSTORM)، والأرض استنزاف الدولة مع عودة جزيء الفردية ⁸ (GDSIM). والثالث) إضاءة منظم المجهري ^9-12 (SIM). تقدم تقنيات التعريب واحد جزيء أكبر الزيادات في القرار الجانبي، وصولا الى ما بين 10-40 نانومتر في العينات البيولوجية. في العديد من التطبيقات من جزيء واحد توطين المجهري، وعمق أخذ العينات يقتصر على موجة زائل وتطبيقات أولية STED كانت محدودة أيضا في عمق أخذ العينات. تحسينات ومع ذلك، التطورات الأخيرة مثل استخدام البصريات التكيفية، واستغلال الاستجماتيزم في وظيفة انتشار نقطة في نقاط الاتصال المختلفة، شهدت الكشف عن طائرة متعددة وباستخدام هدفين للاستدلال على الموقف المحوري للضوء المنبعث في كل من محوري قرار وأخذ العينات أعماق في كل جزيء واحد STED توطين ^13،14. معدلات الحصول على البيانات لSTED وتقنيات التعريب واحد جزيءهي أيضا بطيئة نسبيا نظرا لعدد كبير من الصور التي تحتاج إلى الحصول عليها لأقصى دقة ممكنة (تصل إلى 50،000 لتقنيات التعريب). هذا الحصول على البيانات بطيئة لا تصلح لتصوير العينات الحية بدون تعديلات المخصصة التي غالبا ما تكون باهظة التكاليف. حاليا تناسب هذه التقنيات اثنين الأمثل للعينات ثابتة (للمراجعة رؤية ^2،15)، ومع ذلك، يجري الكثير من العمل لمعالجة هذا القيد.

ثلاثي الأبعاد منظم إضاءة المجهر (3D-SIM) هي تقنية واسعة المجال الذي يحسن قرار الجانبي والمحوري على حد سواء مما أدى إلى قرارات ما يقرب من 110 و 280 نانومتر، على التوالي. عمق أخذ العينات هو ما يصل الى 30 ميكرون من ساترة، والسماح لتصوير الخلايا بأكملها. تباين 3D-SIM التي وضعتها سيدات، أجارد، وGustaffsson على (OMX) منصة بصري المجهر التجريبية يتضمن إلقاء الضوء على عينة مع نمط الشبكة المعروفة التي انتقلت الى مختلف 15مناصب في كل طائرة ض ^9-11. يتم قياس هامش في أنماط تموج في النسيج الناتجة التي تم إنشاؤها في الحيز الترددي خارج المنطقة يمكن ملاحظتها. المعلومات من الحيز الترددي هي أعيد بناؤها حسابيا لتوليد فائقة دقة وضوح الصورة المرئية ^10،11. السرعة النسبية في الصور الخام التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذه التقنية تمكن من تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن العمليات البيولوجية التي تحدث لعلى نطاق ومرة ثانية، فإن معدل الاستحواذ على الصور الخام لا تزال بطيئة جدا لالتقاط التغيرات الدينامية. لالسلاسل الزمنية بمعدل القبض على ثوان، يمكنك اكتساب المتكررة دون وقت كاف يؤدي إلى الانتعاش الضيائية photobleaching من و، وخصوصا خلال التصوير الحي من الخلايا البكتيرية صغيرة.

للتغلب على هذه المشاكل، وقد وضعت التطورات الأخيرة لسرعة 3D-SIM (SIM-F3D). نحن هنا وصف أحد يعرف OMX الحريق ¹⁶ التي كانت طntroduced في أواخر عام 2011. هذه التكنولوجيا يخلق نمط الإضاءة من دون استخدام شبكة المادية كما كان يستخدم في النظم السابقة. استخدام التدخل ضوء الحزم والتكنولوجيا مصراع الجديدة يسمح لخلق ضوء منقوشة على العينة بطريقة سريعة جدا. تم تعزيز سرعة الحصول على الصور كذلك مع إدخال العلمي مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات (sCMOS) الكاميرات، وخصوصا عندما بالمقارنة مع الكاميرات EMCCD القائمة. أدت هذه التغيرات في معدل الممكن الحصول على الصور من إطار واحد في الثانية لعمق أخذ العينات من 1 ميكرون (512 x 512 بكسل، 9 ض شرائح)، مما يتيح رصد التغيرات الديناميكية التي تحدث داخل الخلايا في غضون ثوان ^16. انخفاض واضح في التعرض (الإثارة) مرات للعيش الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يسمح إما سلسلة زمنية ممتدة ليتم القبض أو زيادة في معدل الالتقاط.

نحن هنا وصف تطبيق F3D-SIM المجهري لexaminالبريد هيكل والحركة الديناميكية للZ حلقة cytokinetic في خلايا اثنين من الأنواع البكتيرية: نموذج كائن العصوية الرقيقة على شكل قضيب والممرض البشري مكوراتي المكورات العنقودية الذهبية. FtsZ هو هيكل الخلية البروتين مثل تويولين التي تلعب دورا رئيسيا في انقسام الخلية في البكتيريا ^17،18. فإنه يموضع الى الموقع تقسيم لتوظيف ما لا يقل عن 20 البروتينات الانقسام أخرى، وتشكيل جهاز ^17،18 التقسيم، ويعتقد لتوفير القوة لخلية انقباض ^19-23. يكشف هذا الأسلوب أن يتم توزيع FtsZ بتباين حول الحلبة Z في كل الكائنات في ترتيب تشبه حبة. حل القضية منذ فترة طويلة سواء من الحلبة Z هو حزام موحدة المستمر حول الخلية، كما تصور من قبل التقليدي المجهري مضان واسعة المجال، أو بنية متقطع كما اقترح الإلكترون البرد التصوير المقطعي (ECT) ^24. وتبين لنا كيف أن قدرة 3D-SIM يمكن أن تحسن بشكل كبير فحص المكاني للصغيرة (1قطرها ميكرون) خلايا مستديرة مثل S. الذهبية التي تقسم في ثلاث طائرات عمودية متتالية (س، ص، ض). تظهر الدراسات الوقت الفاصل بين استخدام هذه التقنيات أن هيكل الحلقة Z ديناميكي، مع تغييرات جسيمة منظمة داخل الحلبة، بدلا من جزيئات FtsZ يدخلون ويخرجون من سقالة ثابتة ^24.

Protocol

إعداد 1. عينة

إعداد B. الخلايا الرقيقة للتصوير
1. تطعيم 10 مل من مرق Penassay (PAB، المعروف أيضا باسم مضاد حيوي متوسط 3) مع مستعمرة واحدة من B. الرقيقة سلالة SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP المواصفات) ^16. تنمو بين عشية وضحاها في سرعة منخفضة (100 دورة في الدقيقة) شاكر عند 30 درجة مئوية.
2. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها إلى 0.05 A ₆₀₀ (قياس الامتصاصية في 600 نانومتر) في PAB جديدة على 30 درجة مئوية مع سرعة عالية (215 دورة في الدقيقة) تهتز وتنمو حتى مرحلة منتصف الأسي (A ₆₀₀ ~ 0.4).
3. إضافة 2 غرام من الاغاروز الكهربائي الصف في 100 مل 1X النمو المتوسطة (PAB) في زجاجة المغطاة المسمار. حل الاغاروز بواسطة التعقيم. هذا ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر، والمايكرويف لإذابة الاغاروز عند الحاجة. السماح لضبط درجة حرارة الغرفة.
4. نعلق إطار اللاصقة (65 ميكرولتر القدرة، وانظر جدول المواد) الدخول إلى GLA القياسيةق ق المجهر الشريحة. للقيام بذلك، وإزالة ورقة رقيقة البوليستر (يتم وضع كل إطار اللصق بين لوحين البوليستر، واحدة رقيقة واحدة سميكة، ولها مركز إزالة مربع) وتطبيق مواد لاصقة مكشوفة سطح الإطار إلى سطح شريحة المجهر. هذا يخلق فعال بئر مربع على أعلى الشريحة. ترك ورقة البوليستر سميكة تعلق على الإطار حيث سيؤدي ذلك إلى منع ساترة الالتزام به في الخطوات اللاحقة.
5. تذوب الحل الاغاروز في الميكروويف حتى الغليان وماصة 67 ميكرولتر في الإطار اصقة. وضع على الفور ساترة على رأس لخلق سطح مستو وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة. إزالة ساترة لمدة 1-2 دقيقة في حين يتم حصاد العينة.
6. حصاد قسامة 1 مل من العينة وأجهزة الطرد المركزي في 5،900 x ج لمدة 30 ثانية. صب طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PAB الطازجة.
7. تأخذ 2.5 ميكرولتر من العينة المركزة وماصة على استعدادات ما قبللوحة الاغاروز الحمراء. نشر العينة بالتساوي على سطح مستو لوحة الاغاروز. إزالة الإطار لاصقة من شريحة المجهر باستخدام الملقط مع عدم لمس لوحة الاغاروز.
8. نقل لوحة الاغاروز من الشريحة المجهر إلى 35 مم طبق بتري مع أسفل الزجاج ساترة. عكس وحة agarose بحيث تعليق خلية وساترة للطبق بيتري على اتصال مباشر مع بعضها البعض. الجزء السفلي من طبق بيتري لديه معامل انكسار 1.525 لارتفاع القرار التصوير.
إعداد لايف S. الخلايا العنقودية الذهبية للتصوير
1. تطعيم 10 مل من L-مرق مع مستعمرة واحدة من S. الذهبية سلالة SA94 (SH1000 تحتوي على المحراث، FtsZ-GFP وpGL485، إدارة مخاطر المؤسسات ^{ص، ص} سم) ^25. تنمو بين عشية وضحاها في سرعة منخفضة (100 دورة في الدقيقة) دوار شاكر عند 37 درجة مئوية.
2. تمييع الثقافة بين عشية وضحاها إلى 0.05 A ₆₀₀ (قياس الامتصاصية في 600 نانومتر) في الطازجة L-مرق مع 0.05 ملي IPTG (ايزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside) للحث على إنتاج البروتين الانصهار.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية مع سرعة عالية (215 دورة في الدقيقة) تهتز وتنمو حتى مرحلة منتصف الأسي (A ₆₀₀ ~ 0.4).
4. اتبع الخطوات من 1.1.3 - 1.1.8 كما هو موضح لB. الرقيقة إعداد الخلية الحية.
  ملاحظة: إضافة تركيز مناسب من محفز إلى حل الاغاروز في الخطوة 1.1.3 لسلالات أن تعبر عن انصهار بروتين فلوري تحت سيطرة محرض.

2. إعداد المجهر

يستخدم هذا الأسلوب DeltaVision OMX (المجهر الضوئي، تجريبية) نظام التصوير 3D-SIM مزودة حدة الحريق. للتجارب وصفها، وتستخدم فقط ليزر واحدة وكاميرا واحدة. ووصف الإضاءة ومسار الضوء في الشكل 1. يفترض هذا الأسلوب أن المجهر لديه المعايرة المناسبة، نقل وظيفة البصرية (OTF)أداء الملفات وضوء صيانة إيزاء.

لحية تجارب التصوير الخلية، تأكد من إرفاق مرحلة التسخين إلى مرحلة السيراميك وطوق الهدف التدفئة تعلق على الهدف (1.42 60X الهدف النفط NA).
بدوره على الهدف ومرحلة سخانات 4 على الأقل ساعة قبل التصوير والطريق المنحدر ببطء درجة الحرارة إلى الإعداد المطلوب في الحد الأقصى لمعدل 5 ° C / ساعة. فمن المستحسن أن تبدأ هذه العملية في المساء قبل التصوير والطريق المنحدر في 3 ° C / 4 ساعة. للتجارب الخلية الحية مع B. الرقيقة، يتم تنفيذ معظم التجارب عند 30 درجة مئوية. لS. الذهبية، يتم تنفيذ جميع التجارب عند 37 درجة مئوية.
في يوم من التجربة، وتحويل النظام على الأقل 1 ساعة قبل التصوير للسماح للنظام والليزر لتحقيق الاستقرار الكامل. تحميل صغير إدراج مرحلة طبق على خشبة المسرح ساخنة لتسخين.
1. تشغيل محطة تحكم رئيسية.
2. بدوره على workstat معالجة الصورأيون.
3. بدوره على برودة الكاميرا تقع في الطابق خارج العلبة المجهر.
4. بدوره على كل من الكاميرات sCMOS (على الرغم من أنها لن تكون كلها المستخدمة).
5. داخل الليزر والالكترونيات الضميمة، بدوره على:
  1. أداة تحكم الهيكل.
  2. Nanomotion الهيكل.
  3. تحكم جينا لZ بيزو.
  4. 4 galvo كافة وحدات تحكم المحرك.
  5. وحدة التحكم الرئيسية ليزر.
  6. الثانوية حدة التحكم الليزر.
  7. كافة محطات العمل الكاميرا.
  8. محطة العمل OMXIC.
6. على محطة عمل وحدة تحكم رئيسية، افتح البرنامج OMX بالنقر على أيقونة. تعيين مسار الملف لتوفير البيانات إلى مجلد البيانات المناسبة.
7. تهيئة الأجهزة، انتقل إلى القائمة الأجهزة، واختيار الأجهزة وانقر على زر إعادة تشغيل الأجهزة. أغلق النافذة.
8. بدء softWoRx software.Turn على أشعة الليزر اللازمة للتجارب (488 نانومتر).
9. بدوره على التبديل رئيسيا لسلامة التعشيق الليزر.
10. ضمان إدراج الصحيح درج فلتر مزدوج اللون تحت الهدف. لGFP، هو معيار (أو ثابت) درج.
11. في OMX SF، انتقل إلى القائمة ملف، اختر إعدادات ثم حدد درج ثابت من القائمة المنسدلة درج. أغلق النافذة.
12. القيام بما يلي من الشاشة الرئيسية للبرنامج، في القسم الضوء المعلمات:
  1. تنشيط الكاميرا المناسبة ليزر الإثارة وتصفية الانبعاثات (FITC) الكاميرا من اختيار قناة.
  2. التحقق من الصورة تم تعيين الوضع إلى متسلسل.
  3. تحقق من تعيين مسار الضوء إلى SI.
  4. ومن المقرر مراجعة الوضع إلى 95 ميغاهيرتز.
  5. تحقق من تحديد الليزر 488 في الإثارة.
  6. تعيين 512 X 512 لحجم النافذة وBinning إلى 1 × 1.
13. في علامة التبويب تجربة، تأكد من تعيين نوع إلى SI من القائمة المنسدلة.
14. ضمان تنشيط باجتزاء وأن يتم تعيين القسم التباعد البصري إلى 0.125.
15. ضمان نقطة التركيز عند بدء تشغيل المسح الضوئي هي الوسطى.

3. الحصول على الصور

تطبيق قطرة من النفط إلى أعلى الهدف. 37 درجة مئوية، وأوصى النفط بدءا ديه معامل انكسار 1.518 لمطابقة أفضل معامل انكسار لوحة هلام تستخدم لتركيب الخلايا البكتيرية عند 37 درجة مئوية (يرجى الرجوع إلى الخطوة 1.1.3).
وضع طبق بتري عينة تحتوي على خلايا المعدة في مرحلة أقحم، وتغطي مع التدفئة غطاء دائري. خفض مرحلة حتى يلامس الجزء السفلي من النفططبق بيتري عينة.
السماح للطبق لتسخين-تتوازن لمدة 15 دقيقة في المرحلة. باستخدام إعداد التعرض المنخفض من 5 ميللي ثانية أو أقل (الموجود في قسم الخفيفة معلمات)، والتركيز على العينة باستخدام نانو المواقع الضوابط مرحلة (DZ، وتقع في القسم نانو تحديد المواقع). التركيز صعودا وهبوطا من خلال عينة لتحديد ما إذا كان ينتشر ضوء بالتساوي فوق وتحت المستوى البؤري العينة. إذا كانت وظيفة انتشار نقطة ليست حتى (انحراف كروية)، وتنظيف قاع الطبق العينة والهدف مع الكلوروفورم. تغيير الزيت وكرر هذه الخطوة حتى يتم العثور على تطابق مناسبة بين معامل الانكسار النفط وعينة للحد من انحراف كروية.
باستخدام 0.5 ميكرون DZ أحجام الخطوة، بمناسبة أعلى وأسفل الصورة المكدس. العودة إلى منتصف العينة. انقر على زر الحصول على سمك في علامة التبويب تجربة لتعيين سمك اكتساب عينة. كيص ذروة كومة إلى أدنى حد ممكن في حين يجري الحرص على عدم قطع الجزء العلوي والسفلي من Z-الخواتم. سمك نموذجية لB. العينات الرقيقة هي 2-3 ميكرون.
تحديد قيمة الحد الأقصى لكثافة (ماكس) من عينة صورة مع إعدادات التعرض و٪ T الحالية. تم العثور على هذه القيمة أقل من نافذة الصورة. عن الوقت الفاصل بين التصوير، وضبط التعرض و٪ T للحصول على الكثافة القصوى من 1،100-1،400 الخلفية المذكورة أعلاه للصورة. هناك حاجة إلى الحد الأدنى لشدة 1،000 الخلفية المذكورة أعلاه للحصول على إعادة بناء الصورة. للحصول على صورة لمرة واحدة، وزيادة الحد الأقصى للكثافة إلى 4،000-5،000.
تفعيل القسم الوقت الفاصل في علامة التبويب تجربة. تعيين معدل الإطار المطلوبة والزمن الكلي. في ملف بيانات، أدخل اسم الملف المناسب. انقر فوق الزر تشغيل لبدء الحصول على الصور.
ملاحظة: اكتساب صورة كاملة عندما زالانتهاء شريط احلى التقدم ويظهر ملف السجل لمجموعة البيانات في مجلد البيانات المناسبة.

4. فحص جودة البيانات

في بداية الحصول على الصور، لاحظ قيمة كثافة القصوى للصورة في بداية الحصول على الصور عن الإطار الأول للسلسلة الزمنية. في نهاية الاستيلاء على الإطار الأول، والتحقق من أنه لم يكن هناك أكثر من 10٪ انخفاض في كثافة إشارة من خلال ض المكدس لهذا الإطار الأول. إذا كان هناك أكثر من هذا المستوى من photobleaching من نقطة في أول مرة، فإن البيانات من خلال سلسلة زمنية تكون ذات جودة كافية للتحليل ويمكن وقفها اكتساب مرات السلسلة.
في نهاية الاستحواذ على سلسلة زمنية، فتح ملف الصورة الخام الناتج مع .dv احقة والتأكد من انخفاض في كثافة إشارة القصوى من البداية للسلسلة الزمنية إلى الصورة النهائية. تجاهل أي نقطة زمنية حيث يوجد لديها النحلن أكثر من 30٪ photobleaching من.

5. إعادة بناء الصور 3D-SIM

من القائمة العملية، وتفعيل النافذة SI إعادة الإعمار. استخدام الإعدادات الموجودة مسبقا لجميع المعلمات.
تفعيل زر OTF محددة استخدام القناة، وتعيين إلى مجموعة فلتر قياسي. تفعيل استخدام قناة محددة KO زوايا زر وتعيين إلى مجموعة فلتر قياسي.
سحب وإسقاط الخام (.dv) الملف في مساحة ملف الإدخال. انقر تفعل ذلك. فإن الملف الناتج يكون نفس اسم ملف الإدخال مع _SI أضاف في نهاية المطاف.
ملاحظة: يمكن تشغيل هذا عملية إعادة الإعمار باعتبارها مهمة باستخدام وظيفة منشئ المهام من القائمة العملية إذا ملفات متعددة هي لتتم معالجتها.

6. تصدير وتحليل البيانات

استخدام Imaris لتصور الصور 3D في تجاوز الوضع السابق وبيانات الصورة الساحلية كما شجار (300 نقطة في البوصة) أو ملفات افي (لا يوجد ضغط). قياسات حجم في Imaris يمكن إجراء قياسات باستخدام أداة في تجاوز الوضع.
توليد المؤامرات كثافة 3D من الحلبة Z من البيانات صورة 3D-SIM:
1. دراسة توزيع FtsZ حول الحلبة Z وخلق المؤامرات كثافة 3D
  1. فتح ملف صورة 3D لعرض الفردية ض شرائح. استخدام أداة حجم المشاهد الموجودة تحت علامة التبويب عرض القائمة لاقتصاص المنطقة ذات الاهتمام.
  2. أدخل الرقم نافذة لهذه الصورة 3D في إطار المدخلات وإدخال رقم نافذة جديدة وغير مستخدمة في إطار الإخراج. سوف حدد زر المنطقة أصبحت متاحة للاقتصاص Z حلقة الفردية من الاهتمام من الأصلي 40 × 40 ميكرون مجال الرؤية.
  3. ضبط محور المطلوب ودرجة الدوران في علامة التبويب التناوب. انقر على زر القيام بذلك. التمرير من خلال حجم الحصول على منظور المرجوة من حلقة Z.
  4. استخدام أداة مفتش البيانات وضبط طنانه أبعاد العمود / الصف لإنشاء منطقة جديدة من الاهتمام حول وجود عصابة Z الفردية. انقر على وسط الصورة لوضع هذه المنطقة الجديدة من الفائدة. بيانات الصورة النص جدول إنشاؤه تلقائيا أن يعرض كثافة مضان من كل بكسل داخل المنطقة من الفائدة.
  5. انقر على زر الرسم البياني 3D لعرض البداية مؤامرة كثافة.
  6. بدلا من بيانات الصورة النص يمكن تصديرها عن طريق النقر على زر حفظ بيانات الجدول في القائمة ملف.
  7. نسخ بيانات الصورة من ملف نصي المحفوظة في ورقة انتشار جديدة. تحديد كافة الخلايا ضمن ورقة انتشار وخلق فرص عمل جديدة في الرسم البياني 3D سطح. تنسيق 3D الرسم البياني كثافة مؤامرة للنشر.
2. عن الوقت الفاصل بين تكرار البيانات الخطوات 6.2.1.1 - 6.2.1.7 على كل من نقاط مختلفة الوقت من ملف صورة 3D.
تتبع الإسفار متوسط كثافة على مر الزمن
1. استخدام البيانات النص صورة لتتبع fluorescenم شدة مع مرور الوقت في المنطقة ذات الاهتمام.
2. حدد الخلايا التي تتطابق مع المنطقة من اهتمام.
3. حساب متوسط كثافة مضان في كل نقطة زمنية لهذه المنطقة من الفائدة.
4. استخدام متوسط قيم كثافة مضان لتوليد رسم بياني سطر منفصل.

Representative Results

في هذه الدراسة يمكننا تصور أن البروتين البكتيري انقسام الخلايا FtsZ، وأعرب في الخلايا الحية باعتبارها الانصهار FtsZ GFP، لتوضيح مزايا قوية من F3D-SIM خلال الفحص المجهري مضان التقليدية لدراسة البكتيريا توطين البروتين وديناميكية. FtsZ هو هيكل الخلية البروتين مثل تويولين أن يبلمر إلى بنية ديناميكية حلقة حول محيط الخلية. الحلقة Z لها وظيفة هامة في انقسام الخلايا: يصادف جمعيتها الموقع المستقبلي للتقسيم، وتجند جميع البروتينات انقسام الخلايا إلى هذا الموقع، ويبدو Z حلقة انقباض لتوفير القوة للسماح للداخل حركة المغلف الخلية أثناء الانقسام السيتوبلازمي ^{17 18.}

عندما تصور من قبل التقليدي واسعة المجال المجهري مضان، تظهر حلقة Z بمثابة فرقة واحدة عرضية من مضان في البكتيريا على شكل قضيب، بما في ذلك معظم جيدا درس الكائنات الحية مثل B. الرقيقة (الشكل 2A)، <م> E. القولونية، وC. crescentus. الأهم من ذلك أن كثافة مضان طوال هذه الفرقة تبدو أكثر أو أقل موحدة، ونمط التعريب يقدم فكرة صغيرة جدا في التنظيم الهيكلي وتوزيع البوليمرات FtsZ داخل حلقة Z. عندما يتم فحص الخلايا نفسها باستخدام أسلوب F3D-SIM هو موضح هنا (الشكل 2B)، ومع ذلك، ومزايا هذه التقنية واضحة على الفور. أولا، دوران صورة 3D-SIM حول المحور Z يمكن التصور من الحلبة Z كهيكل حلقة حقيقي في الفضاء الأبعاد الثلاثة (أرقام 2C و 3A). جنبا إلى جنب مع زيادة في القرار، وهذا يكشف أن توزيع FtsZ في الحلقة Z هو في الواقع غير متجانسة للغاية (الشكل 3). التحسن في القرار أيضا يسمح لنا أن نرى Z الحلقات التي بدأت عملية انقباض لتشكيل حاجز تقسيم (المشار إليها بواسطة انغلاف من غشاء الخلية في <قوي> الشكل 2C و 2D).

أمثلة إضافية من B. وترد الرقيقة Z حلقات تصور بواسطة هذه التقنية في الشكل 3Bi - 3Biv وتوضح كيف أن كثافة مضان حول الحلبة Z أبدا هي نفسها. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يلاحظ مناطق منخفضة جدا كثافة مضان. نشير إلى هذه المناطق والثغرات (السهام البيضاء). نلاحظ هذه الثغرات في 15٪ من جميع حلقات Z فحص (ن = 84) والغالب في حلقات Z التي يبلغ قطرها 800-900 نانومتر (93٪). لتحديد هذه الملاحظات، تم إنشاؤها المؤامرات كثافة 3D من الحلبة Z وتظهر في الشكل 3CI و3Cii باستخدام حلقات Z يظهر في أرقام 3Biii و3Biv. تظهر شدة المؤامرات التي عادة كمية مضان في الحلقة Z يمكن أن تختلف يصل ل 3 - 4 أضعاف في مناطق مختلفة من B. الرقيقة Z الحلبة. وعلاوة على ذلك تبين المؤامرات كثافة 3D أن الجاملاحظة مضان داخل الحلبة Z قراءة ما يقرب من مستويات خط الأساس من مضان الخلفية (السهم الأسود في الشكل 3CI). هذه الأمثلة أعلاه تصور إعادة البناء جيدة من الحلبة Z وتعتمد على ضوء كاف المنبعثة من العينة photobleaching من دون كبير. ويتم إنجاز ذلك من خلال سطوع من fluorophore GFP تنصهر إلى FtsZ وفرة في الخلية في ظل هذه الظروف (إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء). في الخلايا الأخرى فيها إشارة إلى نسبة الضوضاء منخفضة إعادة بناء صورة رديئة. لمحاكاة هذا التكرار مع FtsZ-GFP، ومقدار إشارة الانبعاثات التي تم جمعها من B. تم تخفيض الخلايا الرقيقة عن طريق خفض طاقة الإثارة. كما هو مبين في الشكل 3D 100 أضعاف الحد من النتائج طاقة الإثارة في صورة Z-الخاتم الذي لديه القطع الأثرية الهامة. يحدث هذا نتيجة لتباين المحلي غير كاف بين إشارة FtsZ-GFP والخلفية مما يؤدي إلى برازإعادة الإعمار ص من الصورة.

ومن المثير للاهتمام، B. أظهرت الرقيقة Z حلقات الثغرات أكثر وضوحا وعدم التجانس في المناطق العلوية والسفلية من الحلبة ولكن ليس في الجانبين من حلقة (الشكل 3B). يحدث هذا بسبب الاختلاف في القرار هذا الاختلاف من 3D-SIM في الطائرة الجانبية مقارنة الطائرة المحورية التي تحققت. هذه النتائج في المناطق العلوية والسفلية من Z حلقة (طائرة الجانبية) التي يجري تصويرها لقرار الأمثل. الفجوات في Z-حلقة صغيرة جدا ليتم الكشف على جوانب الحلبة Z كما تصور في الطائرة المحورية، التي تملك نحو نصف القرار من الطائرة الجانبية. البكتيريا التي لها التشكل مكوراتي، مثل S. العنقودية الذهبية، لديها حلقات Z التي تتمركز في جميع الطائرات. حتى تصوير حلقة Z عندما تقع في الطائرة الأفقي (أو على مقربة منه) يوفر القدرة على صورة جميع مناطق عصابة لقرار الأمثل. الاستفادة من هذا، درسنا هيكلالحلقة Z في الحي S. الخلايا العنقودية الذهبية، وذلك باستخدام سلالة تحتوي على انصهار-ftsZ GFP تحمل البلازميد. إنتاج هذا الانصهار هو تحت سيطرة المروج P _SPAC محرض (راجع الخطوة 1.2.1). عندما التقط معها في الطائرة المحورية، S. ظهرت الذهبية Z حلقات مماثلة لB. Z حلقات الرقيقة التي هي موجودة في نفس الطائرة (الشكل 4Ai). ومع ذلك، أكدت التصوير Z حلقات في الطائرة الأفقي أن Z حلقة كاملة ظهرت كلا حبة شبيهة وغير المتجانسة. كما أظهرت حوالي 26٪ من هذه الحلقات مرئية "الفجوة" واحد على الأقل من مضان (الشكل 4Aii، 4B). على غرار B. FtsZ الرقيقة، تظهر المؤامرات كثافة مضان أن كثافة مضان في الحلقة Z تتفاوت بقدر 4-6 أضعاف في مناطق مختلفة من S. الذهبية Z حلقة (الشكل 4C).

يمكن قياس طول وعرض من الخرز (الرجوع إلى التخطيطي في الشكل 4D). أظهر هذا أن 80٪ من حلقات Z (ن = 43) التي تم فحصها كان طول حبة من 200 نانومتر، وبلغ الحد الأقصى لطول 400 نانومتر. عرض من الخرز، من ناحية أخرى، قياس ما يصل إلى 200 نانومتر. كان هناك في المتوسط 12 ± 2 (SEM) حبات FtsZ Z في الحلبة. لوحظ بيانات مماثلة عندما تم توطين تصور FtsZ الأصلي مع هذه الطرق باستخدام المجهر المناعي (IFM) تبين أن هذا النمط غير متجانسة وتوطين تشبه حبة كان حقيقيا وليس قطعة أثرية الناجمة عن التعبير عن ftsZ-GFP بالإضافة إلى الأصلي FtsZ (البيانات لا معروضة). هذا النهوض 3D-SIM غير قادرة على أن تظهر أن عصابة Z يبدو كهيكل غير متجانسة وربما المتقطعة هي في الطبيعة.

لمعالجة مسألة كيفية هذا الهيكل Z-حلقة غير متجانسة يخضع انقباض ويسهل انقسام الخلايا، تحليل الوقت الفاصل بين ديناميات حلقة Z يمكن أن يؤديها. أحد التحديات الرئيسية معمضان المجهري الدراسات مرور الزمن هي في التقليل من photobleaching من العينة والضيائية أثناء التصوير. يتطلب 3D-SIM عدد كبير من الصور الخام التي يمكن الحصول عليها مما يعني أن photobleaching من عينة مع مرور الوقت سوف يؤدي إلى ضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء مما يؤدي إلى عدم كفاية إشارة للسماح إعادة بناء الصورة المناسبة. تطبيق التكنولوجيا الجديدة يقلل من كمية الطاقة المستخدمة لكل الإثارة التعرض وبالتالي انخفاض في الطاقة التي تدخل الخلايا الحية. وذلك من خلال مزيج من ضوء التداخل شعاع لإنشاء نمط منظم على عينة واستخدام كاميرات CMOS العلمية التي تزيد من حساسية وكفاءة الكم. نتائج هذا الجمع في اكتساب ض المكدس من 1 ميكرون في الثانية (512 × 512 بكسل × 8 ض شرائح) مقابل 1 ميكرون في 5-8 ثانية (512 x 512 بكسل × 8 ض شرائح) حصلت مع شركائنا في التكرار السابق 3D-SIM (الموصوفة في Riglar وآخرون ^26).يمكن تقليل الوقت الحصول على الصور والإعدادات التعرض أيضا مساعدة في تقليل الضيائية من الخلايا الحية التي هي ذات أهمية خاصة في الدراسات مرور الزمن. التكنولوجيا الجديدة المقدمة هنا يتناول أيضا مشكلة أخرى في مجال التصوير الخلية الحية أن نطلق عليه "الضبابية" التي تشير في هذا السياق إلى توطين البروتينات تغيير خلال الحصول على الصور. من خلال خفض الوقت الحصول على الصور كمية من "الضبابية" يتم تصغير بالتالي خلق صورة أكثر دقة إعادة الإعمار.

لم تكن الدراسات السابقة التي تناولت كيفية تنظيم FtsZ داخل حلقة Z قادرة على أن تظهر كيف يتغير هيكل Z حلقة مع مرور الوقت. للتحقيق في هذا الجانب أجرينا الوقت الفاصل باستخدام F3D-SIM. هذه الصفقة مكنت من صورة 3D-SIM من الحلبة Z في B. الرقيقة كل 5-10 ثانية على مدى فترة من 50 ثانية، والتي كانت في السابق غير ممكن على هذا النطاق الزمني. هو مبين في الشكل 5A هو الامثله(ه) من التغيرات السريعة في توزيع FtsZ داخل حلقة Z على مر الزمن (قطره 890 نانومتر). عرضت Z الحلقات الأخرى التي كانت بشكل واضح في عملية انقباض أيضا أن يكون ديناميات مماثلة التي أثرت على توزيع FtsZ حول الحلبة Z (لا يظهر). ويمكن أيضا أن تتولد المؤامرات كثافة 3D لكل من نقاط زمنية لقياس وتقدير التغيرات كثافة مضان مستمرة وبالتالي وفرة نسبية من FtsZ في مناطق مختلفة من الحلبة Z على نطاق ووقت ثانية (الشكل 5B). ويمكن تحديد المناطق ذات الاهتمام من هذه المؤامرات كثافة لتتبع تقلبات كثافة مضان (الشكل 5C). أن تتبع هذه التغييرات في هيكل Z حلقة في ظل هذه الظروف من المستحيل تقريبا بدون التكنولوجيا المتقدمة F3D-SIM. وبالإضافة إلى ذلك، كشف هذا العمل أنه في S. الذهبية الحركة الديناميكية للFtsZ هي مماثلة لتلك التي لوحظت في B. الرقيقة. S. الخلايا العنقودية الذهبية RN4220 العلاقات العامةتم تصوير العامة oducing FtsZ-GFP لمدة 50 ثانية في فترات زمنية 10 ثانية. تغييرات على عدم تجانس الحلقة Z في S. وكانت الذهبية مع F3D-SIM أيضا مشابهة لB. الرقيقة (انظر النصال والسهام في الشكل 6). هذه الدراسات الفاصل الزمني تدعم نموذجا للانقباض Z حلقة (نموذج معسر تكرارية) التي كان من المتوقع من خلال الفحص الثابتة C. خلايا crescentus، ولكن لا يمكن أظهرت بسبب الحاجة لدراسة ديناميات Z-حلقة في الخلايا الحية ^27.

يتم توجيه الشكل 1. تخطيطي من التكوين البصري للF3D-SIM المستخدمة في هذه الدراسة. ضوء الليزر من الجدول ليزر من خلال الألياف SIM لعدسة الموازاة والثابتة صريف، ثم إلى وحدة التحكم المرحلة التي تخلق كل من طول موجي محدد الأمثل تباعد سو ل± 1 ^شارع أجل الحزم من أجل شعاع المركزي الصفر والخطوات مرحلة لجمع SIM. الحزم ثم أدخل وحدة التحكم زاوية حيث تنعكس أشعة إلى 3 مجموعات مختلفة لإنشاء 3 زوايا الإضاءة. الحزم ثم أدخل المجهر ومسار الضوء كما هو مبين (تم التعديل بإذن من بول غودوين، API).

الشكل 2. مقارنة التقليدية مضان واسعة المجال والتصوير 3D-SIM من B. الخلايا الرقيقة معربا عن ftsZ-GFP. (A) التقليدية واسعة المجال التصوير مضان من B. كانت ملطخة. (الأخضر SU570) ونسخة واحدة أيضا مع الصبغة غشاء FM4-64 (أحمر) خلايا الرقيقة معربا عن ftsZ-GFP. مقياس شريط = 5 ميكرون. تم الحصول على صورة باستخدام مجهر مضان تستقيم.(B) 3D-SIM التصوير من نفس B. الرقيقة سلالة التعبير عن ftsZ-GFP، ملطخة FM4-64. المناطق ذات الاهتمام من الصورة يمكن اختيار (مربع متقطع) للتكبير. يمكن أيضا أن تكون استدارة الصورة حول المحور Z لعرض حلقات 3D FtsZ في الطائرة المحورية. (C، D) إزالة خارج من- ضوء التركيز وتحسين دقة الصورة التي تقدمها 3D-SIM يسمح التصور الواضح للZ حلقات (بما في ذلك تلك التي تشنجا) وغشاء الخلية أثناء انقسام الداخلي (المشار إليها السهام البيضاء). لاحظ أن نص البروتوكول يصف التصور من fluorophore واحد. ومع ذلك، يمكن تكييفها الإجراءات للحصول على ما يصل إلى أربعة أطوال موجية مختلفة في وقت واحد. وقد طبع هذا الرقم من شتراوس وآخرون ^16.

الرقم 3. صور تمثيلية من حلقة Z في الخلايا الحية على شكل قضيب البكتيرية (B. الرقيقة) معربا عن FtsZ-GFP باستخدام 3D-SIM. ويلاحظ (منظمة العفو الدولية) حلقة Z كما عصابة من مضان عمودي على المحور الطويل للخلية وهو في الطائرة س ص. (اثالث) وقد تناوب الصورة حول ض -axis باستخدام Imaris 3D التصور البرمجيات (يرجى الرجوع إلى بروتوكول خطوة 6.1) بحيث أحد يبحث من خلال هيكل الحلقة لنرى بوضوح كيف يتم توزيع FtsZ داخل حلقة Z. هذه الصورة، والآن في الطائرة ZX تبين أن عصابة لديها توزيع غير متجانس من FtsZ مع مناطق لا مضان أو القليل جدا (السهام البيضاء). يجب أن تكون استدارة الصورة لمراقبة هذه المناطق "فجوة" من مضان. ثنائية BIV تظهر أمثلة أخرى من حلقات Z استدارة التي تقع الآن في الطائرة ZX. Z حلقات في (بي-III) لديها يبلغ قطرها 0.9 ميكرومتر ~ (BIV) معارض حلقة Z يبلغ قطرها فقط. tذ 0.65 ميكرومتر تمر انقباض. (CI) يوضح هذا نموذجي ملف كثافة 3D كثافة مضان (أي تركيز) فروق في FtsZ GFP-Z حول الحلبة التي يبلغ قطرها 0.85 ميكرون (يرجى الرجوع إلى بروتوكول الخطوات 6،1-6،3). مستوى مضان في هذه الفجوات منخفضا ونهج مستويات مضان الخلفية (السهم الأسود). (CII) مماثلة ملف كثافة 3D من حلقة Z في عملية انقباض. تركيز FtsZ-GFP هو أيضا غير موحدة؛ القطر، 0.65 ميكرون. وحات A، وقد أعيد طبعه B، CI واخي من شتراوس وآخرون ^16.

الرقم 4. صور الممثل 3D-SIM من S. الخلايا العنقودية الذهبية المنتجة FtsZ-GFP. وبما أن هذه الخلايا المستديرة (المكورات)، فإن حلقة Z هفالبريد مختلف التوجهات. الخلايا التي تظهر عصابة من مضان في اتجاه العرض العادي (أي، في الطائرة س ص) كما هو مبين في (منظمة العفو الدولية)، تبدو مشابهة جدا لتلك الموجودة في الخلايا على شكل قضيب عند استدارة حول محور Z أما الشكل 1Ai. في (اثالث) الحلقة Z بالفعل في الطائرة س ص. التوجه الجانبي والقرار القصوى على الحلبة بأكملها والتي تعطي الآن بنية تشبه حبة (B) (C) كثافة 3D مؤامرة من الوفرة النسبية للFtsZ-GFP في الحلقة Z (D) تمثيل تخطيطي للS . الذهبية Z الحلبة. السهام الحمراء تشير إلى طول حبة والأبعاد العرض (يرجى الرجوع إلى بروتوكول الخطوة 6.1). تم تعديل هذا الرقم من شتراوس وآخرون ^16.

الرقم 5
<قوي> الشكل 5. F3D-SIM يسمح تحليل سريع من FtsZ التعريب مع مرور الوقت في 3D-SIM. (A) التغيرات في توزيع FtsZ-GFP ضمن حلقة Z في شكل قضيب B. الخلايا الرقيقة يمكن تصور تشير إلى ديناميات الحلبة. يشار الوقت (ثانية) في الزاوية اليسرى العليا من كل صورة. تظهر (B) المؤامرات كثافة مضان 3D وغير موحدة والتوزيع الديناميكي للFtsZ في الحلقة Z (C) ديناميات FtsZ (التغييرات مضان FtsZ-GFP في ويمكن أيضا حلقة) أن تدرس بمزيد من التفصيل عن طريق قياس كثافة مضان مع مرور الوقت في منطقتين من الفائدة. وقد طبع هذا الرقم من شتراوس وآخرون ^16.

الرقم 6. F3D-SIM الصور الوقت الفاصل تظهر التغيرات في FtsZ توطين داخل الحلبة على مر الزمن في S. وureus. يشير رأس السهم الأبيض فجوة عندما تم الكشف عن ذلك في البداية في الحلقة Z. يوضح ظهور واختفاء الفجوات في نفس الموقف (كما تميزت رأس السهم الأبيض) مع مرور الوقت كيف يتم توزيعها في جميع أنحاء FtsZ Z-الحلبة. السهام البيضاء تدل على تشكيل فجوات في الحلقة Z في نقاط زمنية لاحقة. ويرد الوقت (ثانية) على الجانب الأيسر العلوي من الصور. تم تعديل هذا الرقم من شتراوس وآخرون ^16.

Discussion

الفلورسنت التصوير الخلية الحية هو أداة قوية تتيح مراقبة التغيرات الدينامية داخل الخلايا مع مرور الوقت. وقد تم تصوير حي من الأحياء الخلية البكتيرية صعبة بسبب حجم الخلايا الصغيرة وانخفاض قدرة الخلايا البكتيرية على تحمل التعرض المتكرر للضوء الإثارة. F3D-SIM توسعت الأدوات المتاحة لاستجواب كل بيولوجيا الخلية ولكن من الضروري القيام بعناية هذه التقنية كما يمكن إدخال القطع الأثرية إذا ما نفذت بشكل سيئ. هناك عدد من الاعتبارات الهامة لنجاح استخدام هذه التقنية. كما هو طريقة التصوير مضان واسعة المجال التي تعتمد على استخدام وظيفة انتشار نقطة ضوء المنبعث، وعدم تطابق مؤشر الانكسار انحراف كروية من الضوء المنبعث يجب تجنبها لتمكين إعادة الإعمار صورة دقيقة. استخدام coverslips من 0.17 مم سمك من نوعية عالية لتجنب اختلاف كثافة إشارة نظرا لسماكة الزجاج التباين في الأغطيةينصح بشدة الشفة. ومن الأهمية بمكان لتقييم بعناية انحراف كروية من الضوء المنبعث أثناء المراحل الأولية من جميع التجارب وضبط معامل الانكسار النفط الغمر حسب الحاجة. هذا قد تختلف من يوم إلى يوم كما أنها تعتمد على كل من درجة الحرارة وتزايد وسائل الإعلام / الركيزة العينة. فإن استخدام زيت غير صحيحة يؤدي إلى إعادة البناء أدنى من الصور مع التحف مثل هالات وإشارات الصدى.

في نهاية عملية إعادة الإعمار صورة، لكل مرحلة مقياسا لجودة إعادة الإعمار ويمكن الحصول على "أفضل لائقا للKO زاوية" لكل مرحلة / زاوية الإضاءة. إذا كانت هذه القيمة أقل من 1 لكل زاوية، ثم نوعية بناؤها على الأرجح أن تكون عالية. إذا كانت هذه القيمة فوق 6، فمن الأرجح أن الصورة التي أعيد بناؤها ستحتوي التحف. وتشمل القطع الأثرية المشتركة ط) ظهور خطوط في الصورة التي تتوافقإلى واحدة من زوايا الشبكة. قد يؤدي هذا إشارة من أقل من هذه الزاوية الشبكة. ب) haloing حول الهياكل. قد ينتج هذا عن مستويات متفاوتة جدا من إشارة من الهياكل مشرق مقارنة الهياكل المحيطة بها، وعدم تطابق معامل الانكسار من النفط والعينة أو قد يكون بسبب الهياكل في صورة كونها غير متبلور جدا والتي لا تحتوي على ما يكفي من "هيكل" أن تكون معترف بها من قبل الخوارزمية. ج) "honeycombing" الذي ينتج عن إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء في الصورة، وعادة بسبب ارتفاع إشارة الخلفية؛ د) الهياكل التي امتدت / ممدود في س ص التي قد تكون بسبب عدم تطابق مؤشر الانكسار النفط والعينة. هذه الأداة من الصعب تمييز للمستخدم عديم الخبرة. فمن المستحسن أن المستخدمين الجدد استشارة باحث SIM من ذوي الخبرة لتقديم المشورة بشأن تفسير الصور والتحليل عند البدء في استخدام هذه التقنية.

كما هو الحال مع جميع تجارب التصوير الخلية الحية الفلورسنت، هو استيرادنملة إلى توازن دقيق للمدخلات طاقة الإثارة من أجل تقليل درجة photobleaching من والضيائية من الخلايا مع إشارة كافية الانبعاثات اللازمة لإعادة بناء الصور مع الحد الأدنى من القطع الأثرية. سوف photobleaching من الإفراط (أكبر من 30٪ عبر الاستحواذ ض المكدس واحد) يؤدي إلى نمط شريطية في الصورة أعيد بناؤها. مع استخدام الكاميرات sCMOS والصور فائقة الدقة يمكن بناؤها بنجاح من الصور الخام مع إشارة انبعاثات منخفضة تصل إلى 1،000 التهم فوق الخلفية. هذا يمكن أن تسمح لمرات التعرض قصيرة جدا وبالتالي تقليل photobleaching من وتمكين التقاط السريع لكل إطار. كما أنه يزيد من مقدار الوقت بين الإطارات للخلايا للتعافي من مدخلات طاقة الإثارة. بالإضافة إلى ذلك، كما في الوقت التقاط لكل إطار على حدة يمكن أن تكون قصيرة جدا، يتم تقليل درجة من القطع الأثرية التي أدخلتها 'الضبابية' أثناء القبض على الأفراد مع استخدام هذا الأسلوب.

هذا فاريمن أوجه 3D-SIM تقدم عددا من المزايا الأخرى خلال فائقة المتاحة وعالية الدقة التصوير تقنيات أخرى للتصوير الحي من قبل علماء الأحياء الخلايا البكتيرية. 2 أضعاف الزيادة في القرار في جميع أبعاد 3 والقدرة على صورة يصل إلى 30 ميكرون في عينة تمكن من تصوير الخلايا البكتيرية (والثدييات) كلها خلال التجربة. تقنيات مثل واحد جزيء التعريب التي يتم تنفيذها عادة في موجة زائل لا يمكن أن تحقق عمق تغلغل في عينة ولا تقدم المعلومات على الخلايا بأكملها. التطورات الحديثة التي تسمح أعماق أخذ العينات أعلى لهذه التقنية قد تؤدي في القرار المحوري أفضل الخلايا بأكملها. بالإضافة إلى ذلك، وتقنيات التعريب واحد جزيء التي تتطلب الآلاف من الصور الخام محدودة أيضا في معدل الإطار الذي يمكن التقاطها وربما تتطلب تسوية بين القبض ومعدل الإطار في نهاية المطاف القرار المكانية التي تحققت، حيث أن القرار المكانية التي سيتم شراؤها تعتمد على عدد من ليلةاليلة المسجلة ضمن مساحة محددة. وخفض عدد الإطارات الملتقطة يؤدي إلى انخفاض القرار المكانية ولكن قد يكون كافيا لتحقيق الاستبانة الزمنية اللازمة لعملية بيولوجية من الفائدة. قد تحتاج كمية الانتعاش مرة بين الإطارات أيضا إلى زيادة للحد الضيائية في الخلايا الحية مما يحد من مدة وتردد في ذلك الوقت سلسلة يمكن الحصول على. تقنيات عالية الدقة مثل المجهر الإلكتروني (EM) أو الإلكترون cryotomography (ECT) عرض قرار زيادة مدى 3D-SIM (وتقنيات المجهر الضوئي فائقة الدقة أخرى) ولكن يجب أن تجرى على عينات ثابتة. لتحديد ومعالجة قد يعرض القطع الأثرية وعدم وضع العلامات قد تجعل من الصعب تفسير. خالية من التسمية ECT على النقيض الفقراء ويمكن تحقيق اختراق أعماق عينة من حوالي 500-200 نانومتر ^24، لذلك حتى لو كان البروتين من الفائدة يمكن تحديدها، لا يمكن ملاحظة هيكل البروتين في الخلية البكتيرية بأكملها.حتى عندما يمكن استخدامها في وضع العلامات EM، مثل مع immunogold، يتم إجراء التصوير فقط في 2D. 3D هو تحقيقه فقط مع باجتزاء رقيقة وإعادة الإعمار الحسابية الأقسام. وباجتزاء رقيقة يتطلب فني من ذوي الخبرة ولكن يمكن أن يكون مشكلة وتؤدي إلى قطعة أثرية. مع الخلايا الحية أو ثابتة، 3D-SIM لا تحتاج إلى تكون جزءا لا يتجزأ بطريقة محددة والخلايا يمكن أن تكون على استعداد للتصوير بسرعة في حالة الأم القريب.

هذه الطريقة سهلة نسبيا لتنفيذ من قبل الباحثين من ذوي الخبرة في الحد الأدنى المجهر الفلورسنت. التجارب لا يمكن أن يؤديها في وسائل الإعلام التي تدعم وظيفة خلايا صحية طالما أنه لا يتألق أو توليد إشارة الخلفية لا داعي لها. عن الخلايا البكتيرية، وهذا يمكن أن تسمح باستخدام أنواع عديدة من مجمع والحد الأدنى من وسائل الإعلام أو استخدام وسائل الإعلام صلبة أو شبه صلبة للسيطرة على الحركة الخلية البكتيرية. العديد من علماء الأحياء الذين المهندسة بالفعل البروتين الفلوري (FP) اندماج واختبار وظيفةيمكن لهذه اندماج يستغرق فترة تصل هذه التكنولوجيا بسرعة دون مزيد الهندسية والتحقق من صحة مع اندماج FP photoactivatable جديدة. لقد وجدنا، وملاحظة عامة، أن S. كانت العنقودية الذهبية أكثر عرضة للphotobleaching من خلال التصوير مع اندماج FP من B. الرقيقة. استخدام لدينا الأصلي أساليب 3D-SIM، حيث تم إنشاء نمط الشبكة من قبل صريف المادي، كنا قادرين على أداء تصوير الخلايا الحية مع عدد من S. اندماج الذهبية FP. ولكن، مع هذا الأسلوب المتقدم F3D-SIM، كنا قادرين على اندماج هذه الصورة FP وتنفيذ سلسلة زمنية قصيرة لالتقاط ديناميات هذه البروتينات الموسومة. هذا ويرجع ذلك إلى انخفاض مرات التعرض اللازمة للتصوير وزيادة الوقت بين الإطارات للانتعاش خلية الأرجح.

OMX السعير 3D-SIM هو التكنولوجيا المتاحة تجاريا التي يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا في مختبر واحد أو مرفق التصوير الأساسية. يجب توخي الحذر لأداء الأسلوب لتجنب ARTIحقائق بسبب ضعف إعداد العينات أو ضعف التقاط الصور. بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن إجراء دراسات لبنية البروتين وديناميكية في الكائنات الصغيرة مثل البكتيريا في واحد أو متعدد الألوان مضان.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose I (Biotecnology grade)	AMRESCO	0710-500G	Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media.
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Lipophylic dye used for staining cell membranes.
1.5 ml microtube, graduated Natural	Scientific specialties Inc.	1210-00	Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization.
Luria broth base, Miller	BD	241420	Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving.
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3	BD	210932	Prepared according to manufacturer's instructions.
Adhesive frame	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm).
Microscope cover glass	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 No. 1 Thickness
35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom	World precision instruments	FD35-100	Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Lincomycin hydrochloride	Sigma	L6004-5MU	Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol.
Erythromycin	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Combined orbital/linear shaking waterbath	Grant scientific Instruments	OLS-200	Shaking speed used for cultures: 215 rpm
UV visible spectrophotometer	Shimadzu	UV-1601	600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures.
Centrifuge	Eppendorf	5415R	Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	15502-10G	Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use.
softWoRx software	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	version 5.0
Imaris data analysis software	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	version 7.0.0	Matlab XTensions included
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Blaze module fitted on OMX V3
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axioplan 2