Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Abstract

Avbildning av biologiska prover med fluorescensmikroskopi har avancerat avsevärt med ny teknik för att övervinna upplösningen barriären av diffraktion av ljus som gör superupplösning av levande prover. Det finns idag tre huvudtyper av superupplösningsteknik - stimulerad emission utarmning (STED), enda molekyl lokalisering mikroskopi (inklusive tekniker såsom PALM, STORM, och GDSIM), och strukturerad belysning mikroskopi (SIM). Medan STED och enda molekyl lokaliseringsteknik visar de största ökningarna i upplösning, har de varit långsammare att erbjuda ökade hastigheter på bilden förvärvet. Tredimensionell SIM (3D-SIM) är ett brett fält fluorescensmikroskopi teknik som erbjuder ett antal fördelar jämfört med både singel-molekyl lokalisering och STED. Upplösning är förbättrad, med typiska laterala och axiella resolutioner av 110 och 280 nm, respektive och djup av provtagning av upp till 30 fim från täckglas, vilket möjliggöravbildning av hela celler. Nya framsteg (snabb 3D-SIM) i tekniken ökar infångningshastighet råbilder möjliggör snabb fångst av biologiska processer som sker på några sekunder, samtidigt som avsevärt minskar fototoxicitet och fotoblekning. Här beskriver vi användningen av en sådan metod för att avbilda bakterieceller som härbärgerar den fluorescensmärkta cytokinetic FtsZ protein för att visa hur celler analyseras och den typ av unik information att denna teknik kan ge.

Introduction

Ett antal olika avbildningstekniker har använts under åren för att studera bakterier inklusive olika elektron och optiska mikroskopitekniker. Medan elektronmikroskopi erbjuder extremt hög upplösning, ner till nanometer, har behovet av ett vakuum och användning av kontrastmedel begränsat denna teknik för att fasta och inbäddade exemplar. Artefakter kan också införas på grund av långa provberedning och det krävs en skicklig utövare att bereda proverna, och att analysera och tolka de resulterande bilderna. Optisk mikroskopi erbjuder fördelarna med enklare provberedning och tillämpning av flera etiketter med relativ lätthet jämfört med elektronmikroskopi. Använda fluorescerande proteiner och färgämneskonjugat, förmågan att studera levande celler med fluorescensmikroskopi är också möjlig. Med förbättringar av fluoroforen stabilitet och fluorescerande protein storlek / struktur som leder till minskad celltoxicitet, samt framsteg inom kameradetektering teknology, fluorescensmikroskopi använder brett fält och konfokala bildsystem har avsevärt utökat vår förståelse av de rumsliga dynamik celler. Med hjälp av dessa tekniker, har vår kunskap om bakteriecellen under de senaste 20 åren utvecklats kraftigt till en betydligt mer detaljerad vy som visar en hög grad av strukturell och protein organisation inom bakteriecellen ^1.

Emellertid är konventionella metoder för optisk mikroskopi är diffraktionsbegränsad, vilket betyder att den inneboende upplösning är ungefär hälften av våglängden för excitationsljuset används. Följaktligen, även med den mest optimala konventionell optisk mikroskopi systemet, är den bästa lateral upplösning cirka 220-250 nm och den axiella upplösningen är cirka 500 nm (för en översikt se et al. Schermelleh ^2). För bakteriella cellbiologer i synnerhet detta fortfarande allvarligt begränsar vår förståelse av den rumsliga organisationen av dessa små celler; vara endast 1-2 um i diametereter och 1-10 | im i längd. Det finns också behov av mer högupplösta tekniker som kan utföras på levande celler där dynamiska rumsliga beteende av ett protein kan analyseras för att komplettera in vitro-data.

Under det senaste decenniet har flera super upplösning fluorescens avbildningstekniker utvecklats. Super-upplösning mikroskopi beskriver avbildningstekniker att åtminstone dubbla den laterala upplösningen uppnås med konventionella ljusmikroskop, vilket skulle lösa diffraktion barriären. Dessa tekniker manipulera belysningen och / eller analys av det emitterade ljuset för att skapa reella ökningar i den synbara upplösningen. Det finns idag tre huvudtyper av superupplösningstekniker - i) stimulerad emission utarmning mikroskopi ³ (STED); ii) enda molekyl lokalisering mikroskopi, inklusive tekniker såsom foto lokalisering mikroskopi ^4,5 (PALM), stokastisk optisk mikroskopi rekonstruktion 7 (dSTORM), och grundtillstånd utarmning med individuell molekyl retur ⁸ (GDSIM); och iii) strukturerade belysning mikroskopi ^9-12 (SIM). Single-molekyl lokaliseringsteknik erbjuder de största ökningarna i lateral upplösning, ner till mellan 10-40 nm i biologiska prover. I många implementationer av enda molekyl lokalisering mikroskopi, är djup av provtagningen begränsas till försvinnande vågen och de inledande implementeringar av STED var också begränsad i provtagningsdjupet. Emellertid senaste framstegen såsom användning av adaptiv optik, utnyttjande av astigmatism i punktspridningsfunktionen vid olika kontaktpunkter, multi-planet upptäckt och användning av två mål för att sluta sig till den axiella positionen för det emitterade ljuset har sett förbättringar i både den axiella upplösning och samplings djup i både STED och enda molekyl lokalisering ^13,14. Datainsamlings priser för STED och enda molekyl lokaliseringsteknikär också relativt långsamt på grund av det stora antalet bilder som måste förvärvas för maximal upplösning (upp till 50.000 för lokaliseringsteknik). Denna långsamma datainsamling lämpar sig inte till avbildning av levande prover utan anpassade modifikationer som är ofta ganska dyra. Dessa två tekniker är idag optimalt lämpade för fasta prover (för översikt se ^2,15), men mycket arbete som görs för att ta itu med denna begränsning.

Tredimensionell strukturerad belysning mikroskopi (3D-SIM) är ett brett fält teknik som förbättrar både lateral och axiell upplösning vilket ger resolutioner av cirka 110 och 280 nm, respektive. Djup för provtagning är upp till 30 ^ m från täckglas, vilket möjliggör avbildning av hela celler. Variationen i 3D-SIM utvecklats av Sedat, Agard och Gustaffsson på det optiska mikroskop eXperimental (OMX) plattform innebär belysa provet med en känd rutmönster som flyttas in 15 olikapositioner i varje z-planet ^9-11. Fransarna i de resulte moarémönster som skapas i frekvensutrymme utanför det observer regionen mäts. Informationen från frekvensutrymmet är beräknings rekonstruerade att generera en synlig super upplösning ^10,11. Den relativa hastigheten vid vilken de råa bilder kan förvärvas med hjälp av denna teknik möjliggör avbildning av levande celler. Det är dock viktigt att notera att för biologiska processer som sker på en tidsskala av sekunder, är förvärvet takten av råbilder fortfarande för långsam för att fånga dynamiska förändringar. För tidsserier med en avskiljningsgrad sekunder, kan den upprepade förvärvet utan tillräcklig återhämtning leder till fototoxicitet och fotoblekning, speciellt under levande avbildning av små bakterieceller.

För att övervinna dessa problem har senaste framstegen för snabb 3D-SIM (F3D-SIM) utvecklats. Här beskriver vi en bekant som OMX Blaze ¹⁶ som var introduced i slutet av 2011. Denna teknik skapar den mönstrade belysning utan att använda ett fysiskt rutnät som användes i tidigare system. Användningen av störande ljusstrålar och ny slutare teknik tillåter skapandet av den mönstrade ljus på provet på ett mycket snabbt sätt. Hastigheten på bilden förvärvet förstärktes ytterligare i och med införandet av vetenskaplig Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kameror, särskilt jämfört med de befintliga EMCCD kameror. Dessa förändringar ledde till en möjlig bild förvärv hastighet av en bild per sekund för en provtagningsdjup på 1 pm (512 x 512 bildpunkter, 9 z-skivor), vilket möjliggör övervakning av dynamiska förändringar i celler som inträffar inom några sekunder ^16. Minskningen av de uppenbara exponeringen (excitation) gånger för att leva celler med hjälp av den här metoden tillåter antingen förlängd tidsserier som ska fångas eller en ökning av avskiljningsgrad.

Här beskriver vi tillämpningen av F3D-SIM-mikroskopi för att examine strukturen och dynamisk rörelse av cytokinetic Z ring i cellerna av två bakteriearter: de stavformade modellorganismen Bacillus subtilis och den kockoida human patogen Staphylococcus aureus. FtsZ är en tubulinliknande cytoskelettprotein som spelar en nyckelroll i celldelning i bakterier ^17,18. Det lokaliserar till divisionen plats att rekrytera minst 20 andra divisions proteiner, som bildar delningen anordningen ^17,18, och tros ge den kraft för cell sammandragning ^19-23. Denna metod visar att FtsZ är ojämnt fördelade runt Z-ring i båda organismerna i en pärlliknande arrangemanget; lösa länge haft frågan om Z ringen är en kontinuerlig jämn bälte runt cellen, som visualiseras genom konventionell brett fält fluorescensmikroskopi, eller en diskontinuerlig struktur som föreslagits av elektron Cryo-tomografi (ECT) ^24. Vi visar hur förmågan hos 3D-SIM avsevärt kan förbättra fysisk undersökning av liten (1um diameter) runda celler som S. aureus att dela i tre på varandra följande vinkelräta plan (x, y, z). Time-lapse studier med dessa tekniker visar att strukturen på Z ringen är dynamisk, med brutto organisationsförändringar inom ringen, snarare än FtsZ molekyler som rör sig in och ut ur en fast byggnadsställning ^24.

Protocol

1 Provberedning

1. Beredning av B. subtilis celler för Imaging
   1. Inokulera 10 ml Penassay Broth (PAB, även känd som Antibiotic Medium 3) med en enda koloni av B. subtilis stam SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP-spec) ^16. Odla över natten i en låg hastighet (100 rpm) skakapparat vid 30 ° C.
   2. Späd natten kultur till 0,05 A ₆₀₀ (absorbans mäts vid 600 nm) i färskt PAB vid 30 ° C med hög hastighet (215 rpm) skaka och växa fram till mitten av exponentiell fas (A ₆₀₀ ~ 0,4).
   3. Lägg 2 g elektrofores-grade agaros i 100 ml 1x tillväxtmedium (PAB) i en med skruvkork glasflaska. Lös agarosen genom autoklavering. Detta kan förvaras vid 4 ° C under ett par månader, och microwaved att smälta agarosen vid behov. Låt det vid rumstemperatur.
   4. Fäst en självhäftande ramen (65 pl kapacitet, se tabell för material) på en vanlig glass objektglas. För att göra detta, ta bort den tunna polyesterarket (varje klister ramen är placerad mellan två polyesterlakan, en tunn och en tjock, och har centrum torget bort) och applicera den exponerade klisterytan på ramen till ytan på objektglas. Detta skapar effektivt en fyrkantig väl ovanpå diabilden. Lämna den tjocka polyesterarket fäst vid ramen, eftersom detta kommer att förhindra att täck klibba till det i efterföljande steg.
   5. Smält agaroslösningen i en mikrovågsugn tills kokning och pipett 67 ul i limmet ramen. Placera omedelbart ett täckglas ovanpå för att skapa en plan yta och låt stå i rumstemperatur i 5-10 min. Avlägsna täckglas för 1-2 minuter medan provet skördas.
   6. Skörda en 1 ml alikvot av provet och centrifugera vid 5900 xg under 30 sek. Dekantera supernatanten och suspendera pelleten i 200 l färska PAB.
   7. Ta 2,5 l av det koncentrerade provet och pipettera på ett pre-preparöd agaros pad. Sprid provet jämnt längs den plana ytan av agarosen pad. Ta bort klisterramen från objektglas med en pincett utan att röra agarosen pad.
   8. Överför agarosen pad från objektglas till en 35 mm diameter petriskål med ett täckglas botten. Vänd agarosen pad så att cellsuspensionen och täckglas i petriskålen är i direkt kontakt med varandra. Botten av en petriskål har ett brytningsindex av 1,525 för högupplöst avbildning.
2. Beredning av Live S. aureus Celler för Imaging
   1. Inokulera 10 ml av L-buljong med en enda koloni av S. aureus-stam SA94 (SH1000 innehållande plog-FtsZ-GFP och pGL485; Erm ^r, Cm ^{r) 25.} Odla över natten i en låg hastighet (100 rpm) roterande skakanordning vid 37 ° C.
   2. Späd natten kultur till 0,05 A ₆₀₀ (absorbans mäts vid 600 nm) i färskt L-buljong med 0,05 mM IPTG (isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid) för att inducera produktion av fusionsproteinet.
   3. Inkubera vid 37 ° C med hög hastighet (215 rpm) skaka och växa fram till mitten av exponentiell fas (A ₆₀₀ ~ 0,4).
   4. Följ stegen 1.1.3 - 1.1.8 som beskrivs för B. beredning live-cell subtilis.
      OBS: Tillsätt en lämplig koncentration av inducerare till agaroslösningen i steg 1.1.3 för stammar som uttrycker ett fluorescerande fusionsprotein enligt inducerbar kontroll.

2 Beredning av mikroskop

Denna metod använder en Deltavision OMX (optiskt mikroskop, eXperimental) 3D-SIM avbildningssystem utrustat med en Blaze modul. För experimenten beskrivna, är endast en laser och en kamera som används. Belysningen och ljusbanan beskrivs i figur 1. Metoden förutsätter att mikroskopet har lämplig kalibrering, optisk överföringsfunktion (OTF)filer och lätta kollimering underhåll utförs.

1. För levande cell imaging experiment, se till att värmesteget är kopplad till den keramiska scenen och målet-värmekrage är ansluten till målet (60X 1,42 NA olja mål).
2. Slå på de objektiva och scen värmare minst 4 timmar före avbildning och långsamt ramp temperaturen till önskad inställning med en maximal hastighet av 5 ° C / tim. Det rekommenderas att starta processen kvällen före avbildning och ramp vid 3 ° C / 4 tim. För levande cell experiment med B. subtilis, är de flesta experiment utfördes vid 30 ° C. För S. aureus, är alla experiment utfördes vid 37 ° C.
3. På dagen för experimentet, sätta på systemet minst 1 timme före avbildning så att systemet och laser för att till fullo stabiliseras. Fyll den lilla skålen scenen insatsen på den uppvärmda scenen för att förvärma.
   1. Slå på huvudstyrenheten arbetsstation.
   2. Slå på bildbehandling workstation.
   3. Slå på kameran kylaren placerad på golvet utanför mikroskop kapsling.
   4. Slå på alla de sCMOS kameror (även om de inte alla kommer att användas).
   5. Inne i laser och elektronik kapsling, slå på:
      1. Instrument controller chassi.
      2. Nanomotion chassit.
      3. Jena controller för Z piezo.
      4. Alla 4 galvo motorkontrollerna.
      5. Primär laserstyrmodul.
      6. Sekundär laserstyrmodul.
      7. Alla kamera arbetsstationer.
      8. OMXIC arbetsstation.
   6. På masterducen arbetsstation öppnar OMX programvaran genom att klicka på ikonen. Ange sökvägen för data spara till en lämplig mapp uppgifter.
   7. För att initiera hårdvara, gå till Maskinvara menyn, välj Maskinvara och klicka på knappen Starta om hårdvara. Stäng fönstret.
   8. Starta softWoRx software.Turn på lasrarna som krävs för experimenten (488 nm).
   9. Slå på tändningslåset för lasersäkerhetskedjan.
   10. Se till att rätt dikroiska filterlådan sätts in under målet. För GFP är det standard (eller fast) låda.
   11. I OMX SF, gå till Arkiv-menyn, välj Inställningar och välj Fast lådan lådan rullgardinsmenyn. Stäng fönstret.
   12. Gör följande från huvudskärmen av mjukvaran, i avsnittet Ljus Parametrar:
       1. Aktivera lämplig kamera för excitation laser och utsläpp filter (FITC) kameran från Kanalval.
       2. Kontrollera bildläget är inställt på sekventiell.
       3. Kontrollera strålgången är inställd på SI.
       4. Kontrollera att läget är satt till 95 MHz.
       5. Kontrollera att 488 lasern är vald i Excitation.
       6. Ställ 512 x 512 för fönsterstorleken och Binning till 1 x 1.
   13. På fliken Experiment, se till är inställd på SI från rullgardinsmenyn.
   14. Se till Sektione är aktiverad och att den optiska delen avståndet är satt till 0,125.
   15. Se till Focus punkt när Scan startar är mitten.

3 Image Acquisition

1. Applicera en droppe olja på toppen av målet. För 37 ° C, har den rekommenderade startolja ett brytningsindex av 1,518 för att bäst matcha refraktionsindex hos geldynan används för att montera de bakteriella cellerna vid 37 ° C (se steg 1.1.3).
2. Placera provet petriskål med de preparerade celler till scenen infällda och täck med den runda lock uppvärmning. Sänk scenen tills oljan rör vid botten avprovet petriskål.
3. Låt skålen värma-jämvikt under 15 min i scenen. Med hjälp av en låg exponeringsinställningen för 5 ms eller mindre (finns i avsnittet Ljus parametrar), fokusera på provet med scenkontrollerna nano positionering (DZ, beläget i Nano Positioning avsnitt). Fokus upp och ner genom provet för att avgöra om ljuset sprids jämnt över och under provet fokalplanet. Om punktspridningsfunktionen är inte ens (sfärisk aberration), rengör botten av provskål och målet med kloroform. Byt olja och upprepa detta steg tills en lämplig matchning hittas mellan olja och provbrytningsindex för att minimera sfärisk aberration.
4. Med hjälp av 0.5 um DZ stegstorlekar, markera toppen och botten av bilden stacken. Återgå till mitten av provet. Klicka på Tjocklek knappen Hämta på fliken Experiment för att ställa in provförvärvs tjocklek. Keep stacken höjden till ett minimum samtidigt som det är noga med att inte skära av toppen och botten av Z-ringarna. Typiska tjocklekar för B. subtilis proven är 2-3 um.
5. Bestäm högsta intensitetsvärdet (Max) av provbild med löpande exponering och% T-inställningarna. Detta värde finns nedanför bildfönstret. För tidsförlopp imaging, justerar exponering och% T för att få en högsta stödnivå på 1,100-1,400 över bakgrunden för bilden. Det behövs en minsta ljusstyrka på 1000 över bakgrunden för att få bildrekonstruktion. För en engångs image, öka den maximala intensiteten till 4,000-5,000.
6. Aktivera Time-lapse avsnittet på fliken Experiment. Ställ in önskad bildhastighet och total tid. I datafilen, ange en lämplig filnamn. Klicka på Kör för att starta bildtagning.
   OBS: Bild förvärvet är klar när gReen Progress bar är klar och en loggfil visas för datauppsättningen i lämplig mapp data.

4 Kontroll Data Quality

1. I början av bilden förvärvet notera den högsta värdet på bilden i början av bilden förvärvet för den första bildrutan i tidsserierna. I slutet av förvärvet av den första ramen, kontrollera att det inte har varit mer än en 10% minskning i signalintensitet genom z-stack för denna första bilden. Om det har gått mer än denna nivå av fotoblekning i den första tidpunkten, kommer data via tidsserier vara av otillräcklig kvalitet för analys och tidsserier förvärvet kan stoppas.
2. I slutet av förvärvet av tidsserien, öppnar det råa bildfil med .dv suffix och fastställa minskningen i maximal signalstyrkan från början av tidsserierna för den slutliga bilden. Kassera tidpunkter där det har been mer än 30% fotoblekning.

5. rekonstruera 3D-SIM bilder

1. På Process-menyn, aktivera SI återuppbyggnad fönstret. Använd befintliga inställningar för alla parametrar.
2. Aktivera Använd Channel Specific OTF-knappen och ställa till Standard filteruppsättning. Aktivera Använd Channel Specific KO vinklar knappen och ställ till Standard filteruppsättning.
3. Dra och släpp den råa (.dv) filen i inmatningsfilen utrymme. Klicka på Gör det. Utgången filen har samma namn som ingångsfilen med _SI läggas till i slutet.
   OBS: Denna återuppbyggnadsprocessen kan köras som en uppgift med hjälp av Task Builder-funktionen på Process-menyn, om flera filer som ska bearbetas.

6 Data Export och analys

1. Använd Imaris att visualisera 3D-bilder i träffa läge och exportbilddata som tiff (300 dpi) eller avi-filer (ingen komprimering). Storleks mätningar i Imaris kan utföras med hjälp av mätningar verktyg i träffa läge.
2. Generera 3D intensitet tomter av Z ringen från 3D-SIM bilddata:
   1. Undersök fördelningen av FtsZ runt Z ringen och för att skapa 3D-intensitet tomter
      1. Öppna en 3D-bild-fil för att se de olika z-skivor. Använd volym tittaren verktyg som finns under fliken Visa-menyn för att beskära ett område av intresse.
      2. Ange fönsternummer för den här 3D-bild i inmatningsfönstret och ange en ny och oanvänd fönster nummer i utgångsfönstret. Regionen valknappen kommer att bli tillgängliga för att beskära en individuell Z ring av intresse från de ursprungliga 40 × 40 pm synfält.
      3. Justera den önskade axeln och graden av rotation i fliken rotation. Klicka på Do den knäppas. Rulla genom volymen för att erhålla den önskade perspektiv av Z ringen.
      4. Använd datagranskaren verktyg och justera tHan kolumn / rad dimensioner för att skapa en ny region av intresse kring en enskild Z ring. Klicka mitt på bilden för att placera detta nya område av intresse. Texten bilddata är en automatiskt genererad tabell som visar fluorescensintensiteten hos varje pixel inom det intressanta området.
      5. Klicka på 3D-grafen för att initialt se intensiteten tomten.
      6. Alternativt textbilddata kan exporteras genom att klicka på tabelldata knappen Spara i Arkiv-menyn.
      7. Kopiera bilddata från den sparade textfilen i en ny kalkylark. Markera alla celler i arket och skapa en ny 3D-Surface grafen. Formatera 3D intensitets tomten grafen för publicering.
   2. För tidsförlopp uppgifter upprepa steg 6.2.1.1 - 6.2.1.7 om var och en av de olika tidspunkter från 3D-bildfilen.
3. Spårning Genomsnittlig Fluorescens Intensitet över tid
   1. Använd textbilddata för att spåra fluorescence intensitet över tid i ett område av intresse.
   2. Selektera celler som motsvarar regionen av intresse.
   3. Beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten vid varje tidpunkt för denna region av intresse.
   4. Använd de genomsnittliga fluorescensintensitetsvärden för att skapa en egen linjediagram.

Representative Results

I denna studie visualiseras vi bakterie celldelning protein FtsZ, uttryckt i levande celler som en FtsZ-GFP fusion, för att illustrera de kraftfulla fördelarna med F3D-SIM över konventionella fluorescensmikroskopi för att studera bakteriellt protein lokalisering och dynamik. FtsZ är en tubulinliknande cytoskelettprotein som polymeriserar till en dynamisk ringstruktur runt omkretsen av cellen. Z ringen har en viktig funktion i celldelningen sin församling markerar den framtida platsen för division, den rekryterar alla celldelningsproteiner till denna webbplats, och Z ring förträngning tycks ge den kraft att tillåta rörelse inåt av cellhöljet under cytokines ^{17 , 18.}

När visualiseras genom konventionell brett fält fluorescensmikroskopi visas Z ringen som ett enda tvärgående band av fluorescens i stavformade bakterier, inklusive de mest väl studerade organismer såsom B. subtilis (figur 2A), <em> E. coli och C. crescentus. Viktigt verkar fluorescensintensiteten under hela detta band för att vara mer eller mindre enhetligt och lokaliseringsmönstret ger väldigt liten inblick i organisationsstruktur och distribution av FtsZ polymerer inom Z ringen. När samma celler undersöks genom att använda F3D-SIM-metoden som beskrivs här (figur 2B), men fördelarna med denna teknik är omedelbart uppenbara. Först vridning av 3D-SIM bilden runt z-axeln möjliggör visualisering av Z ring som en äkta ringstruktur i tre dimensionell rymd (figurerna 2C och 3A). Tillsammans med ökningen av upplösning avslöjar detta att fördelningen av FtsZ i Z ringen i själva verket är mycket heterogen (Figur 3). Förbättringen av upplösningen gör det också möjligt för oss att se Z ringar som har börjat processen med förträngning att bilda en division septum (anges av invagination av cellmembranet in <strong> Figur 2C och 2D).

Ytterligare exempel på B. subtilis-Z ringar visualiserade med denna teknik är visade i figur 3BI - 3Biv och illustrera hur fluorescensintensiteten runt Z-ringen är aldrig densamma. Dessutom är regioner med mycket låg fluorescensintensiteten ofta observeras. Vi hänvisar till dessa regioner som brister (vita pilar). Vi observerar dessa luckor i 15% av alla Z ringar undersökta (n = 84) och främst Z ringar med en diameter på 800-900 nm (93%). För att kvantifiera dessa observationer var 3D intensitets tomter skapas av Z ring och visas i figur 3Ci och 3Cii använder Z-ringar som visas i figurerna 3Biii och 3Biv. Intensitets tomter visar att typiskt mängden fluorescens i Z ringen kan variera upp till 3-4 gånger i olika regioner av B. subtilis Z ring. Dessutom 3D intensitet tomter visar att gaps av fluorescens inuti Z ringen nästan läst basnivån för bakgrundsfluorescens (svart pil i figur 3Ci). Dessa ovanstående exempel skildra goda rekonstruktioner av Z ringen och är beroende av tillräckligt med ljus som avges från provet utan betydande fotoblekning. Detta sker genom att ljusstyrkan på GFP fluoroforen smält till FtsZ och sitt överflöd i cellen under dessa förhållanden (högt signal-brus-förhållande). I andra celler där signalbrusförhållandet är lågt rekonstruktionen av bilden är dålig. För att simulera denna händelse med FtsZ-GFP, mängden av emissionssignalen uppsamlas från B. subtilis-celler minskades genom att sänka den exciteringsenergi. Såsom visas i fig 3D en 100-faldig reduktion av exciteringsenergi resulterar i en bild av Z-ring som har signifikanta artefakter. Detta sker som en följd av otillräcklig lokal kontrast mellan FtsZ-GFP-signalen och bakgrunden som leder till poor rekonstruktion av bilden.

Interestingly B. subtilis-Z ringar visade mer uttalade brister och heterogenitet i de övre och nedre regionerna av ringen men inte i sidorna av ringen (Figur 3B). Detta inträffar på grund av skillnaden i upplösning uppnås genom denna variation av 3D-SIM i lateralplanet i förhållande till det axiella planet. Detta resulterar i de övre och nedre regionerna av Z ringen (lateralplanet) som avbildas med optimal upplösning. Luckorna i Z-ringen är för små för att detekteras i sidorna av Z ring såsom visualiseras i det axiella planet, som har ungefär halva upplösningen av den laterala planet. Bakterier som har en kockoida morfologi, såsom S. aureus, har Z-ringar som är placerade i alla plan. Så avbildning Z ringen när den ligger i sidoplanet (eller nära den) ger möjlighet att bilden alla regioner i ringen med optimal upplösning. Med utnyttjande av detta har vi granskat strukturZ ringen i levande S. aureus-celler, med användning av en stam som innehåller en plasmid bärande ett ftsZ-GFP fusion. Produktion av denna fusion är under kontroll av en P _spac inducerbar promotor (se steg 1.2.1). När avbildas med i axiell planet, S. aureus Z ringar föll identisk med B. subtilis-Z ringar som är närvarande i samma plan (figur 4Ai). Men bild Z ringar i lateralplanet bekräftade att hela Z ringen verkade både pärlliknande och heterogen. Om 26% av dessa ringar visade också åtminstone en synlig "lucka" på fluorescens (figur 4Aii, 4B). Liknande till B. subtilis FtsZ, fluorescensintensitets tomter visar att fluorescensintensiteten i Z ringen varierar så mycket som 4-6 gånger i olika områden av S. aureus Z ring (Figur 4C).

Längden och bredden av pärlorna kan mätas (se schematisk i figur 4D). Detta visade att 80% av Z-ringar (n = 43) som undersöktes hade en vulst längden 200 nm, och nådde en maximal längd av 400 nm. Bredden av pärlor, å andra sidan, mätt upp till 200 nm. Det fanns i genomsnitt 12 ± 2 (SEM) FtsZ pärlor per Z ring. Liknande lokalisering uppgifter observerades när infödda FtsZ visualiserades med dessa metoder använder immunofluorescensmikroskopi (IFM) som visar att denna heterogena och pärlliknande lokalisering mönster var äkta och inte en artefakt orsakad av uttryck av ftsZ-GFP förutom infödda FtsZ (data visad). Denna utveckling av 3D-SIM kan visa att Z ringen visas som en heterogen struktur och är möjligen diskontinuerliga karaktär.

För att ta upp frågan om hur denna heterogena Z-ringstruktur genomgår sammandragning och underlättar celldelning, kan en tidsförlopp analys av Z ring dynamik. En av de största utmaningarna medfluorescens mikroskopi tidsförlopp studierna är i minimering av provfotoblekning och fototoxicitet under avbildning. 3D-SIM kräver ett stort antal råbilder uppnås som innebär att fotoblekning av ett prov över tid kommer att resultera i en dålig signal-till-brus-förhållande vilket leder till otillräcklig signal för att möjliggöra lämpliga bildrekonstruktioner. Tillämpningen av den nya tekniken minimerar mängden exciteringsenergi som används för varje exponering och följaktligen en minskning av den energi som kommer in i levande celler. Det gör detta genom en kombination av ljusstråle interferometri för att skapa strukturerade mönstret på provet och användningen av vetenskapliga CMOS-kameror som ökar känsligheten och kvanteffektivitet. Denna kombination ger z-stack förvärv av 1 um per sekund (512 × 512 pixlar x 8 z-skivor) jämfört med 1 mm per 5-8 sek (512 x 512 pixlar x 8 z-skivor) som erhållits med vår tidigare iteration av 3D-SIM-kort (beskrivet i Riglar et al. ^26).Minska bildanskaffningstiden och exponeringsinställningar kan också bidra till att minimera fototoxicitet av levande celler, vilket är särskilt relevant i time-lapse studier. Den nya tekniken presenteras här tar också ett annat problem i live-cell imaging som vi kallar "rörelseoskärpa" som i detta sammanhang hänvisar till lokalisering av proteiner förändras under bildtagning. Genom att minska bildinsamlingstiden beloppet "rörelseoskärpa" minimeras därmed skapa en mer korrekt bildrekonstruktion.

Tidigare studier som har tagit upp hur FtsZ organiseras inom Z ringen har inte kunnat visa hur Z ringstruktur förändras över tiden. För att undersöka denna aspekt vi utfört tidsförlopp med hjälp F3D-SIM. Detta möjliggjorde förvärv av en 3D-SIM bild av Z ring i B. subtilis varje 5-10 sek under en period av 50 sekunder, vilket tidigare inte var möjlig på denna tidsskala. I fig 5A är en example av de snabba förändringarna i FtsZ fördelning inom Z ringen över tid (diameter på 890 nm). Andra Z ringar som var synligt i processen av sammandragning har också visat sig ha liknande dynamik som påverkat fördelningen av FtsZ runt Z ringen (visas ej). 3D intensitet tomter kan också genereras för varje tidpunkter att kvantifiera och uppskatta de ständiga fluorescensintensiteten förändringar och därmed relativa förekomsten av FtsZ i olika regioner av Z ringen på en tidsskala sekunder (figur 5B). Regioner av intresse kan identifieras från dessa intensitets tomter att spåra variationer av fluorescensintensiteten (figur 5C). Att spåra dessa förändringar i Z ringstruktur under dessa förhållanden skulle vara praktiskt taget omöjligt utan den avancerade F3D-SIM-teknik. Dessutom visade det arbete som i S. aureus den dynamiska rörelse FtsZ liknar den som observerats i B. subtilis. S. aureus RN4220 celler producing FtsZ-GFP avbildades för 50 sek vid 10 sek tidsintervall. Ändringar heterogenitet Z ring i S. aureus med F3D-SIM var också liknande B. subtilis (se pilspetsar och pilar i fig 6). Dessa tids lapse studier stöder en modell av Z ring sammandragning (den iterativa klämmande modellen) som förutsades genom granskning av fasta C. crescentus celler, men kunde inte påvisas på grund av behovet att undersöka Z-ring dynamik i levande celler ^27.

Figur 1 Schematisk bild av den optiska konfigurationen av F3D-SIM som används i denna studie. Laserljus från lasertabellen riktas genom ett SIM-fibern till en kollimatorlins och fast gitter, sedan in i fas styrmodulen som skapar både våglängden specifik optimala mellanrummet of de ± 1 ^st order strålar från noll ordning centralbalk och fas stegen för SIM-samlingen. Balkarna ange sedan vinkeln styrenhet där strålarna reflekteras på de 3 olika kluster för att skapa de 3 vinklar belysning. Balkarna ange sedan mikroskopet och ljusvägen enligt bilden (Ändrad med tillstånd från Paul Goodwin, API).

Figur 2 Jämförelse mellan konventionell brett fält fluorescens och 3D-SIM avbildning av B. subtilis-celler som uttrycker ftsZ-GFP. (A) Konventionell brett fält fluorescens avbildning av B. subtilis-celler som uttrycker ftsZ-GFP (SU570; grön) som en enda kopia färgades också med membranet färgämne FM4-64 (röd). Scale bar = 5 | im. Bilden förvärvades med hjälp av en upprätt fluorescensmikroskop.(B) 3D-SIM avbildning av samma B. subtilis stam som uttrycker ftsZ-GFP, färgades med FM4-64. Regioner av intresse från bilden kan väljas (streckad box) för att zooma in. Bilden kan även roteras kring z-axeln för att visa 3D FtsZ ringar i axiell planet. (C, D) Avlägsnandet av out-of- fokus ljus och förbättrad bildupplösning från 3D-SIM möjliggör tydlig visualisering av Z ringar (inklusive de som är tvingande) och den inre cellmembranet under delning (markeras med vita pilar). Observera att protokollet texten beskriver visualisering av ett enda fluorofor. Emellertid kan förfarandet anpassas för att förvärva upp till fyra olika våglängder samtidigt. Denna siffra har omtryckt från Strauss et al ^16.

Figur 3. Representativa bilder av Z-ring i levande stavformade bakterieceller (B. subtilis) uttrycker FtsZ-GFP med hjälp av 3D-SIM. (Ai) Z ring observeras som ett band av fluorescens vinkelrätt mot den långa axeln av cellen som är i xy-planet. (All) Bilden har roterats kring z-axeln med hjälp Imaris 3D-visualisering programvara (se protokollet steg 6.1) så att man tittar genom ringstrukturen för att tydligt se hur FtsZ fördelas i Z-ringen. Denna bild, nu i zx planet visar att ringen har en ojämn fördelning av FtsZ med regioner av obefintligt eller begränsat fluorescens (vita pilar). Bilden måste roteras för att följa dessa "gap" regioner fluorescens. Bi-Biv visar ytterligare exempel på roterade Z ringar som nu ligger i zx planet. Z ringar i (Bi-iii) har en diameter på ~ 0,9 um. (Biv) visar en Z-ring med en diameter av only 0,65 um genomgår sammandragning. (Ci) Denna typiska 3D intensitetsprofilen visar fluorescensintensiteten (dvs. koncentration) skillnader i FtsZ-GFP runt Z ringen har en diameter på 0,85 um (se protokoll steg från 6,1 till 6,3). Nivån av fluorescens i dessa luckor är låg och närmar bakgrundsfluorescens nivåer (svart pil). (CII) En liknande 3D ​​intensitetsprofilen för en Z-ring i processen för sammandragning. FtsZ-GFP koncentration är också icke-uniform; diameter, 0,65 | im. Paneler A, B, CI och Cii har omtryckt från Strauss et al ^16.

Figur 4. Representant 3D-SIM bilder av S. aureus-celler som producerar FtsZ-GFP. Eftersom dessa celler är runda (kocker), kommer Z-ringen have olika inriktningar. Celler som visar ett band av fluorescens i normalt visningsorientering (dvs i xy-planet) som visas i (Ai), ser mycket liknar dem i stavformade celler när roteras runt Z-axeln som för figur 1ai. I (All) Z ringen redan i xy-planet; sidoorientering och upplösning är maximal över hela ringen som nu ger en pärlliknande struktur (B). (C) En 3D intensitet plot av den relativa förekomsten av FtsZ-GFP i Z ringen. (D) Schematisk representation av S . aureus Z ring. Röda pilar indikerar pärla längd och breddmått (se protokollsteg 6.1). Denna siffra har modifierats Strauss et al ^16.

<strong> Figur 5 F3D-SIM möjliggör snabb analys av FtsZ lokalisering över tid i 3D-SIM. (A) Förändringar i FtsZ-GFP distributionen inom Z ringen i stavformade B. subtilis-celler kan visualiseras för att indikera dynamiken i ringen. Tid (sek) visas i det övre vänstra hörnet på varje bild. (B) 3D fluorescensintensiteten tomter visar den icke-enhetlig och dynamisk fördelning av FtsZ i Z ringen. (C) FtsZ dynamik (FtsZ-GFP fluorescens förändringar i ring) kan också granskas mer i detalj genom att kvantifiera fluorescensintensiteten över tiden i två regioner av intresse. Denna siffra har omtryckt från Strauss et al ^16.

Figur 6 F3D-SIM tidsförlopp bilder visar förändringar i FtsZ lokalisering inom ringen över tid i S. enureus. En vit pilspets indikerar en lucka när den initialt upptäcktes i Z ringen. Uppträdandet och försvinnandet av gap vid samma position (som markeras med den vita pilspets) över tiden åskådliggör hur FtsZ omfördelas runt Z-ringen. Vita pilar indikerar bildandet av gap i Z-ringen vid senare tidpunkter. Tid (s) visas på den övre vänstra sidan av bilderna. Denna siffra har modifierats Strauss et al ^16.

Discussion

Fluorescerande live-cell imaging är ett kraftfullt verktyg som gör att observation av dynamiska förändringar inom celler över tiden. Live avbildning av bakteriell cellbiologi har varit utmanande på grund av den lilla cellstorlek och minskad förmåga bakteriecellerna att motstå upprepad exponering för excitation ljus. F3D-SIM har utökat de verktyg som finns för att förhöra alla cellbiologi, men det är nödvändigt att noggrant utföra denna teknik som artefakter kan införas om bristfälligt. Det finns ett antal viktiga överväganden för en framgångsrik användning av denna teknik. Eftersom det är ett brett fält fluorescerande avbildningsmetod som bygger på användning av punktspridningsfunktionen för det emitterade ljuset, brytnings mismatch index och sfärisk aberration av det emitterade ljuset måste undvikas för att möjliggöra noggrann bildrekonstruktion. Användningen av täckglas av 0,17 mm tjocklek av en hög kvalitet för att undvika variationer i signalintensitet på grund av glastjocklek variabilitet i omslagenläpp rekommenderas starkt. Det är mycket viktigt att noggrant utvärdera den sfäriska aberrationen av det emitterade ljuset under de inledande skedena av alla experiment och justera immersionsolja brytningsindex som behövs. Detta kan variera från dag till dag, eftersom det är beroende av både temperatur och monteringsmedia / substrat av provet. Användningen av den felaktiga oljan kommer att leda till sämre rekonstruktion av bilder med artefakter såsom glorior och ekosignaler.

I slutet av bildåteruppbyggnadsprocessen, för varje fas ett mått på kvaliteten i återuppbyggnaden kan erhållas genom den "bästa passform för kO vinkel" för varje fas / vinkeln på belysningen. Om detta värde är lägre än en för varje vinkel, då kvaliteten på det rekonstruerade kommer mest sannolikt att vara hög. Om värdet är över 6, så är det att den återskapade bilden innehåller artefakter troligen. Vanliga artefakter inkluderar i) utseende ränder i bilden som motsvararatt en av vinklarna i rutnätet. Detta kan bero på lägre signal från det gallervinkel; ii) bara de bästa kommentarerna runt strukturer. Detta kan bero på mycket ojämna nivåer av signal från ljusa strukturer jämfört med omgivande strukturer, en obalans mellan brytningsindex för olja och provet eller kan bero på de strukturer i bilden är för amorft och inte innehåller tillräckligt med "struktur" som erkänts av algoritmen; iii) 'honeycombing' som resulterar från ett lågt signal-brusförhållande i bilden, vanligtvis på grund av hög bakgrundssignal; iv) strukturer som sträckta / avlånga i xy vilket kan bero på brytningsindex obalans av olja och prov. Denna artefakt är svår att urskilja för en oerfaren användare. Det rekommenderas att nya användare konsultera en erfaren SIM forskare för råd om bildtolkning och analys när du börjar använda denna teknik.

Som med alla fluorescerande live-cell imaging experiment, är det important att noga balansera excitation energitillförseln för att minimera graden av fotoblekning och fototoxicitet av cellerna med tillräcklig emissionssignal krävs för att rekonstruera bilder med minimal artefakt. Överdriven fotoblekning (större än 30% över en enda z-stack förvärvet) kommer att leda till en randning mönster i den återskapade bilden. Med hjälp av sCMOS kameror, kan super upplösning framgångsrikt rekonstrueras från råbilder med emissionssignal så lågt som 1.000 räkningar över bakgrunden. Detta kan göra det möjligt för mycket korta exponeringstider vilket minskar fotoblekning och möjliggöra snabb fångst för varje bildruta. Det ökar också mängden tid mellan ramar för celler att återhämta sig från den excite energitillförsel. Dessutom, som infångningstiden för varje enskild bildruta kan vara mycket kort, är graden av artefakt introduceras med "rörelseoskärpa" under en enskild fånga reduceras med hjälp av denna metod.

Detta VARIring av 3D-SIM erbjuder ett antal andra fördelar jämfört med andra tillgängliga super och högupplöst bildteknik för levande avbildning av bakteriella cellbiologer. Ökningen 2 gånger i upplösning i alla 3 dimensioner och förmågan att bilden upp till 30 nm i en prov möjliggör avbildning av hela bakteriella (och däggdjurs) celler under ett experiment. Tekniker såsom enda molekyl lokalisering som vanligen utförs i försvinnande vågen inte kan uppnå djup inträngning i ett prov och inte erbjuder information om hela celler. Senaste framstegen som möjliggör högre djup provtagning av denna teknik kan leda till en bättre axiell upplösning på hela celler. Dessutom enda molekyl lokaliseringsteknik som kräver tusentals råbilder som ska förvärvas är också begränsade i bildhastigheten som kan fångas upp och kan kräva kompromisser mellan capture bildhastighet och den ultimata uppnått rumslig upplösning, eftersom den rumsliga upplösningen är beroende av antal events registrerats inom ett definierat utrymme. Minskning av antalet fångade ramar kommer att resultera i en lägre spatial upplösning, men kan vara tillräckligt för att uppnå den temporala upplösningen som erfordras för den biologiska processen av intresse. Mängden återhämtningstid mellan ramar kan också behöva ökas för att minimera fototoxicitet i levande celler och därmed begränsar varaktighet och frekvens som kan erhållas tidsserier. Högupplösta tekniker såsom elektronmikroskopi (EM) eller elektron cryotomography (ECT) ger ökad upplösning över 3D-SIM (och andra super upplösning optisk mikroskopi tekniker), men måste utföras på fasta prover. Fastställande och bearbetning kan införa artefakter och bristen på märkning kan försvåra tolkningen. Label fritt ECT har dålig kontrast och kan uppnå provpenetrationsdjup på cirka 500-200 nm ^24, så även om proteinet av intresse kan identifieras, inte kan observeras strukturen av proteinet i ett helt bakteriecell.Även när märkning kan användas i EM, såsom med immunoguld är avbildning endast utförs i 2D. 3D är bara uppnås med tunna sektionering och beräknings rekonstruktion av sektionerna. Den tunna sektionering kräver en erfaren tekniker men kan vara problematiskt och leda till artefakter. Med levande eller fixerade celler, gör 3D-SIM behöver inte vara inbäddade i ett visst sätt och celler kan snabbt förberedd för avbildning i ett nära naturliga tillstånd.

Denna metod är relativt enkel att implementera vid forskare med minimal erfarenhet av fluorescensmikroskopi. Experiment kan utföras i media som främjar en hälsosam cellfunktion, så länge den inte fluorescerar eller generera onödig bakgrundssignal. För bakterieceller kan detta tillåta användningen av många typer av komplexa och minimala media eller användning av fasta eller halvfasta medier för att styra bakteriecell motilitet. Många biologer som redan manipulerade fluorescerande protein (FP) fusioner och testade funktionalitetdessa fusioner kan ta upp denna teknik snabbt utan ytterligare teknik och validering med nya fotoaktiverbara FP fusioner. Vi fann, som en allmän iakttagelse, att S. aureus var mer mottaglig för fotoblekning under avbildning med FP fusioner än B. subtilis. Med hjälp av våra ursprungliga 3D-SIM metoder där gallermönstret som genereras av en fysisk galler, kunde vi inte spela live cell imaging med ett antal S. aureus FP fusioner. Men med denna avancerade F3D-SIM-metoden, kunde vi bild dessa FP fusioner och utför korta tidsserier för att fånga dynamiken i dessa taggade proteiner. Det är förmodligen på grund av de minskade exponeringstider som behövs för avbildning och ökad tid mellan ramar för cellåtervinning.

OMX Blaze 3D-SIM är en kommersiellt tillgänglig teknik som kan relativt enkelt implementeras i ett enda laboratorium eller en kärnavbildningsanläggning. Försiktighet måste vidtas för att utföra tekniken att undvika artifakta på grund av dålig förberedelse prov eller dålig bildfångst. När tekniken behärskas, kan studier av proteinstruktur och dynamik i små organismer såsom bakterier utföras i enstaka eller flerfärgsfluorescens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose I (Biotecnology grade)	AMRESCO	0710-500G	Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media.
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Lipophylic dye used for staining cell membranes.
1.5 ml microtube, graduated Natural	Scientific specialties Inc.	1210-00	Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization.
Luria broth base, Miller	BD	241420	Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving.
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3	BD	210932	Prepared according to manufacturer's instructions.
Adhesive frame	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm).
Microscope cover glass	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 No. 1 Thickness
35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom	World precision instruments	FD35-100	Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Lincomycin hydrochloride	Sigma	L6004-5MU	Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol.
Erythromycin	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Combined orbital/linear shaking waterbath	Grant scientific Instruments	OLS-200	Shaking speed used for cultures: 215 rpm
UV visible spectrophotometer	Shimadzu	UV-1601	600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures.
Centrifuge	Eppendorf	5415R	Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	15502-10G	Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use.
softWoRx software	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	version 5.0
Imaris data analysis software	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	version 7.0.0	Matlab XTensions included
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Blaze module fitted on OMX V3
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axioplan 2