Abstract
Avbildning av biologiske prøver ved hjelp av fluorescens mikroskopi har avansert betydelig med nye teknologier for å overvinne oppløsningen barrieren av diffraksjon av lys, slik super-oppløsning på live-prøver. Det er i dag tre hovedtyper av super-oppløsning teknikker - stimulert emisjon mangel (STED), single-molekyl lokalisering mikroskopi (inkludert teknikker som PALM, STORM, og GDSIM), og strukturert belysning mikroskopi (SIM). Mens STED og enkelt-molekyl lokalisering teknikker viser den største økningen i oppløsning, de har vært tregere til å tilby økte hastigheter på bildet oppkjøpet. Tredimensjonal SIM (3D-SIM) er et bredt felt fluorescens mikroskopi teknikk som tilbyr en rekke fordeler fremfor både enkelt-molekyl lokalisering og STED. Oppløsning er forbedret, med typiske lateral og aksial oppløsning på 110 og 280 nm, henholdsvis og dybden av prøvetaking av opp til 30 mikrometer fra dekkglass, slik at foravbildning av hele celler. Nye fremskritt (rask 3D-SIM) i teknologien øke fangstrate på RAW-bilder tillater rask fangst av biologiske prosesser som skjer i løpet av sekunder, mens betydelig reduserer fototoksisitet og fotobleking. Her beskriver vi bruken av en slik fremgangsmåte til bilde bakterielle celler som inneholder fluorescensmerket merkede cytokinetic FtsZ protein for å vise hvordan cellene blir analysert, og den type av unik informasjon på at denne teknikk kan gi.
Introduction
En rekke forskjellige avbildningsteknologier har vært brukt i løpet av årene for å studere bakterier, innbefattende forskjellige elektron og optisk mikroskopi-teknikker. Mens elektronmikroskopi har ekstremt høy oppløsning, ned til nanometer, har behovet for et vakuum, og bruk av kontrastmidler begrenses denne teknikken til faste og innvevde prøver. Gjenstander kan også bli introdusert på grunn av langvarige prøvepreparering og en dyktig utøver er nødvendig for å fremstille prøver, og til å analysere og tolke de resulterende bildene. Optisk mikroskopi tilbyr fordelene med enklere prøvepreparering og anvendelsen av flere etiketter med relativ letthet sammenlignet med elektronmikroskopi. Ved hjelp av fluorescerende proteiner og fargestoff konjugater, evnen til å studere levende celler med fluorescens mikroskopi er også mulig. Med forbedringer i fluoroforen stabilitet og fluorescerende protein størrelse / struktur fører til redusert celletoksisitet, samt fremskritt i kameragjenkjenning technology, fluorescens mikros bruke et vidt felt og konfokale bildesystemer har betydelig utvidet vår forståelse av romlige dynamikken i cellene. Ved å bruke disse teknikkene, er kunnskapen om den bakterielle cellen i løpet av de siste 20 år utviklet seg sterkt til en langt mer detaljert riss som viser en høy grad av strukturell og protein organisering innenfor bakteriecellen 1.
Imidlertid, konvensjonelle metoder for optisk mikroskopi er diffraksjon begrenset, noe som betyr at den iboende oppløsning er omtrent halvparten av bølgelengden til lyset som brukes eksitasjon. Følgelig, selv med de mest optimale konvensjonell optisk mikros system, er den beste lateral oppløsning ca 220 til 250 nm, og den aksielle oppløsning er omtrent 500 nm (for gjennomgang se Schermelleh et al. 2). For bakteriecelle biologer særlig dette fremdeles sterkt begrenser vår forståelse av den romlige organiseringen av disse ørsmå celler; blir bare 1-2 mikrometer i diameter og 1-10 um i lengde. Det er også behov for høyere teknikker oppløsning som kan utføres på levende celler hvor dynamiske romlige opptreden av et protein kan bli analysert for å komplettere in vitro-data.
I løpet av det siste tiåret har flere super-oppløsning fluorescens imaging teknikker blitt utviklet. Super-oppløsning mikros beskriver avbildningsteknikker at i det minste det dobbelte av lateral oppløsning kan oppnås med konvensjonelle lysmikroskopi, og derved overvinne diffraksjon barriere. Disse teknikkene manipulere belysning og / eller analyse av det utsendte lys til å lage ekte økning i den tilsynelatende oppløsning. Det er i dag tre hovedtyper av super-oppløsning teknikker - i) stimulert emisjon uttømming mikros 3 (STED); ii) single-molekyl lokalisering mikroskopi, inkludert teknikker som fotoaktivering lokalisering mikros 4,5 (PALM), stokastisk optisk gjenoppbygging mikros
Tredimensjonal strukturert belysning mikroskopi (3D-SIM) er et bredt felt teknikk som forbedrer både lateral og aksial oppløsning resulterer i en oppløsning på ca 110 og 280 nm, henholdsvis. Dybde av prøvetaking er opp til 30 mikrometer fra dekkglass, slik at for avbildning av hele celler. Variasjonen av 3D-SIM utviklet av Sedat, Agard, og Gustaffsson på plattformen optisk mikroskop eXperimental (OMX) innebærer belyse prøven med en kjent rutenett mønster som er flyttet inn i 15 forskjelligeposisjoner i hver z plan 9-11. Frynsene i de resulterende moaré som er opprettet i frekvens plass utenfor den observer regionen måles. Informasjonen fra frekvensområder som er beregnings rekonstruert for å generere en synlig super-oppløsning 10,11. Den relative hastigheten som de rå bildene kan bli kjøpt ved hjelp av denne teknikken muliggjør avbildning av levende celler. Det er imidlertid viktig å merke seg at for biologiske prosesser som forekommer i en tidsskala på sekunder, er anskaffelsen frekvensen av de rå bildene fremdeles er for treg til å fange opp dynamiske endringer. For tidsserier med en opptakshastighet sekunder, kan den gjentas oppkjøpet uten tilstrekkelig utvinning tid føre til fototoksisitet og fotobleking, spesielt under live avbildning av små bakterieceller.
For å overvinne disse problemene, har de siste fremskritt for rask 3D-SIM (F3D-SIM) blitt utviklet. Her beskriver vi en kjent som OMX Blaze 16 som var introduced sent 2011. Denne teknologi skaper det mønstrede belysning uten bruk av et fysisk nett som ble brukt i tidligere systemer. Bruken av forstyrrende lysstråler og ny lukkerteknologi gir mulighet for etablering av mønstret lys på prøven i en svært rask måte. Hastigheten på bildet oppkjøpet ble ytterligere forbedret med innføringen av vitenskapelig Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) kameraer, særlig i forhold til de eksisterende EMCCD kameraer. Disse endringene medførte en mulig bilde oppkjøpet rate på ett bilde per sekund for en prøvetaking dybde på 1 mikrometer (512 x 512 piksler, 9 z-skiver), slik at overvåking av dynamiske endringer i celler som oppstår i løpet av sekunder 16. Nedgangen i den tilsynelatende eksponering (eksitasjon) ganger å leve celler ved hjelp av denne metoden kan enten lengre tidsserier for å bli fanget eller en økning i fangst rate.
Her beskriver vi anvendelsen av F3D-SIM mikros å examine struktur og dynamisk bevegelse av cytokinetic Z ringen i cellene i to bakteriearter: de stavformede modellorganisme Bacillus subtilis og kokkoid humant patogen Staphylococcus aureus. FtsZ er en tubulin-lignende cytoskeletal protein som spiller en nøkkelrolle i celledeling i bakterier 17,18. Det lokaliserer til delingen for å rekruttere minst 20 andre divisjons proteiner, danner delingen anordningen 17,18, og er antatt å tilveiebringe kraften for celle innsnevring 19-23. Dette viser at metoden FtsZ er heterogent fordelt rundt Z-ringen i begge organismer i en perle-liknende arrangement; å løse det lange holdte spørsmålet om Z-ringen er en kontinuerlig ensartet belte rundt cellen, som visualisert ved konvensjonell bred-felt fluorescens mikroskopi, eller en diskontinuerlig struktur som foreslått av elektron kryo-tomografi (ECT) 24. Vi viser hvordan evnen til 3D-SIM kan langt bedre romlig undersøkelse av bittesmå (enmikrometer diameter) runde celler som S. aureus som deles i tre etterfølgende vinkelrette plan (x, y, z). Time-lapse studier ved bruk av disse teknikker viser at strukturen i Z-ringen er dynamisk, med brutto organisering endringer innenfor ringen, heller enn FtsZ molekyler beveger seg inn og ut av et fast stillaset 24..
Protocol
1. Prøvepreparering
- Utarbeidelse av B. subtilis Cells for Imaging
- Inokuler 10 ml Penassay Broth (PAB, også kjent som Antibiotic Medium 3) med en enkelt koloni av B. subtilis belastning SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP-spec) 16. Dyrk over natten i en lav hastighet (100 rpm) rister ved 30 ° C.
- Fortynn natten kultur til 0,05 A 600 (absorbans målt ved 600 nm) i friskt PAB ved 30 ° C med høy hastighet (215 rpm), risting og vokse til midten av eksponensiell fase (A 600 ~ 0,4).
- Tilsett 2 g av elektroforese-grade agarose i 100 ml 1x vekstmedium (PAB) i en med skrulokk glassflaske. Oppløse agarose ved autoklavering. Det kan lagres ved 4 ° C i noen få måneder, og varmes i mikrobølgeovn for å smelte agarose når det er nødvendig. Tillat å sette ved romtemperatur.
- Fest en selvklebende ramme (65 mikroliter kapasitet, se tabell of Materials) på en standard glass objektglass. For å gjøre dette, fjerner den tynne polyesterarket (hver kleberamme er plassert mellom to polyester ark, en tynn og en tykk, og har senteret firkantet fjernet) og anvende den eksponerte klebe overflaten av rammen til overflaten av objektglass. Dette skaper effektivt en firkantet godt på toppen av lysbildet. La tykk polyester-folie, festet til rammen, da dette vil hindre at dekk holde seg til det i etterfølgende trinn.
- Smelt agarose-løsning i en mikrobølgeovn til koking og 67 ul pipette ned i limet rammen. Umiddelbart plassere et dekkglass på toppen for å skape en flat overflate og forlater ved romtemperatur i 5-10 min. Fjern dekkglass for 1-2 min mens prøven er høstet.
- Høste en 1 ml aliquot av prøven og sentrifuger ved 5900 xg i 30 sek. Dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl friskt PAB.
- Ta 2,5 mL av den konsentrerte prøven og pipette på en pre-preparød agarose pad. Spre prøven jevnt langs den flate overflaten av agarose puten. Fjern kleberammen fra objektglass ved hjelp av pinsett mens ikke berøre agarose pad.
- Overfør agarose puten fra objektglass til en 35 mm diameter petriskål med et glass dekk bunnen. Snu agarose puten, slik at cellesuspensjonen, og dekkglass av petriskålen er i direkte kontakt med hverandre. Bunnen av petriskålen har en brytningsindeks på 1,525 for høy oppløsning avbildning.
- Utarbeidelse av Levende S. aureus Cells for Imaging
- Inokuler 10 ml L-buljong med en enkelt koloni av S. aureus stamme SA94 (SH1000 inneholder Plog-FtsZ-GFP og pGL485; Erm r, Cm r) 25. Dyrk over natten i en lav hastighet (100 rpm) rotasjonsrister ved 37 ° C.
- Fortynne natten kultur til 0,05 A 600 (absorbans måles ved 600 nm) i frisk L-buljong med 0,05 mM IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) for å indusere produksjonen av fusjonsproteinet.
- Inkuberes ved 37 ° C med høy hastighet (215 rpm) risting og vokse fram til midten av eksponentiell fase (A 600 ~ 0,4).
- Følg trinn 1.1.3 - 1.1.8 som beskrevet for B. subtilis levende celleforberedelsen.
Merk: Tilsett passende konsentrasjon av inducer til agarose-løsning i trinn 1.1.3 for stammer som uttrykker et fusjonsprotein i henhold til fluorescerende induserbar kontroll.
2. Utarbeidelse av mikroskopet
Denne metoden bruker en Deltavision OMX (optisk mikroskop, eksperimentelt) 3D-SIM imaging system utstyrt med en Blaze modul. For de eksperimenter som er beskrevet, er kun en laser og en kamera som brukes. Belysningen og lysbanen er beskrevet i figur 1. Denne metoden forutsetter at mikroskopet har passende kalibrering, optisk overføringsfunksjon (OTF)filer og lys collimation utført vedlikehold.
- For live cell imaging eksperimenter, sørg for varme fasen er knyttet til den keramiske scenen og målet oppvarming krage er festet til målet (60X 1,42 NA olje objektiv).
- Slå på de objektive og scene varmeovner minst 4 timer før bildebehandling og sakte rampen temperaturen til ønsket innstilling til en maksimal hastighet på 5 ° C / time. Det anbefales å starte denne prosessen kvelden før bildebehandling og rampe ved 3 ° C / 4 time. For live celle eksperimenter med B. subtilis, er de fleste eksperimenter utført ved 30 ° C. For S. aureus, er alle eksperimenter utført ved 37 ° C.
- På dagen for eksperimentet, slå på systemet på minst 1 time før avbildning for å tillate systemet og lasere for å stabilisere fullt. Laste liten skål scenen innsats på oppvarmet scenen for å forvarme.
- Slå på den overordnede styringen arbeidsstasjon.
- Slå på bildebehandling workstation.
- Slå på kameraet kjøligere plassert på gulvet utenfor mikroskopet kabinett.
- Slå på alle de sCMOS kameraer (selv om de ikke vil alle bli brukt).
- Inne i laser og elektronikk kabinett, slår du på:
- Instrument kontrolleren chassis.
- Nanomotion chassis.
- Jena kontrolleren for Z piezo.
- Alle fire galvo motor kontrollere.
- Primær laser kontroll modul.
- Sekundær laser kontroll modul.
- Alle kamera arbeidsstasjoner.
- OMXIC arbeidsstasjon.
- På den overordnede styringen arbeidsstasjon, åpne OMX programvaren ved å klikke på ikonet. Sett filbanen for data lagring til en passende datamappe.
- Å initialisere maskinvare, gå til Hardware-menyen, velg Maskinvare og klikk på Start på nytt Hardware knappen. Lukk vinduet.
- Start softWoRx software.Turn på lasere som kreves for forsøkene (488 nm).
- Slå på nøkkelbryteren for laser sikkerhet sperre.
- Sikre riktig dichroic filterskuffen er satt under målet. For GFP, det er standard (eller fast) skuff.
- I OMX SF, gå til Fil-menyen, velg Innstillinger og velger Fast skuff fra skuffen nedtrekksmenyen. Lukk vinduet.
- Gjør følgende fra hovedskjermen av programvaren, i lys Parametere seksjonen:
- Aktiver riktig kamera for eksitasjon laser og utslipp filter (FITC) kameraet fra Kanalvalg.
- Sjekk bildemodus er satt til sekvensiell.
- Kontroller lysbanen er satt til SI.
- Sjekk Mode er satt til 95 MHz.
- Sjekk 488 laser er valgt i eksitasjon.
- Sett
- I kategorien Experiment, sikre Type er satt til SI fra rullegardinmenyen.
- Sørg Seksjonering er aktivert, og at avstanden mellom den optiske delen er satt til 0.125.
- Sørg fokuspunktet når skanne starter er midten.
3. Image Acquisition
- Påfør en dråpe olje på toppen av målet. For 37 ° C, har de anbefalte startolje en brytningsindeks på 1,518 for å tilpasse brytningsindeksen av gelen puten brukes til å montere de bakterielle cellene ved 37 ° C (se trinn 1.1.3).
- Plasser prøven petriskål som inneholder de preparerte cellene inn scenen innfelt og dekk med den sirkulære oppvarming lokket. Senk scenen til oljen berører bunnen avprøven petriskål.
- La retten varme-likevekt i 15 min i den fasen. Ved hjelp av en lav eksponering innstilling på 5 ms eller mindre (i Lys Parametere seksjon), fokus på prøven ved hjelp av nano posisjonering steg kontroller (DZ, som ligger i Nano Positioning seksjon). Fokus opp og ned gjennom prøven å avgjøre om lyset er spredt jevnt over og under prøven fokusplanet. Dersom punktspredefunksjon er ikke engang (sfærisk aberrasjon), rense bunnen av prøve fatet og formålet med kloroform. Skift olje og gjenta dette trinnet til en passende match er funnet mellom olje og prøve brytningsindeks for å minimere sfærisk aberrasjon.
- Ved hjelp av 0,5 mikrometer DZ vise størrelser, markere toppen og bunnen av bildet stabelen. Tilbake til midten av prøven. Klikk på Get Tykkelse knappen i kategorien Prøv å angi prøven oppkjøpet tykkelse. Keep kapasitets til et minimum samtidig er forsiktig med å ikke skjære av toppen og bunnen av Z-ringer. Typiske tykkelser for B. subtilis prøver er 2-3 mikrometer.
- Bestem maksimal intensitet verdi (Max) av prøven bildet med gjeldende eksponering og% T innstillinger. Denne verdien er funnet under bildevinduet. For time-lapse imaging, justere eksponering og% T for å få en maksimal intensitet på 1,100-1,400 over bakgrunnen for bildet. Et minimum intensitet på 1000 over bakgrunnen er nødvendig for å oppnå bildet rekonstruksjon. For en one-off bilde, øke den maksimale intensiteten til 4000-5000.
- Aktiver Time-lapse delen i kategorien Experiment. Still inn ønsket bildefrekvens og total tid. I datafil, angir et passende filnavn. Klikk Kjør for å starte bilde oppkjøpet.
Merk: Bilde oppkjøpet er fullført når gReen Progress bar er ferdig og en loggfil vises for datasettet i den aktuelle data-mappen.
4. Kontroll Data Quality
- Ved starten av bildeinnlastingen, er den maksimale intensitet verdien av bildet i begynnelsen av bildeinnlastingen for den første rammen i tidsserien. På slutten av oppkjøpet av det første bildet, sjekk at det ikke har vært mer enn en 10% reduksjon i signalintensitet gjennom z-stack for dette første bildet. Hvis det har vært mer enn dette nivået av fotobleking i første tidspunkt, vil dataene gjennom tidsserien være utilstrekkelig kvalitet for analyse og kan stoppes på tidsserier oppkjøpet.
- På slutten av oppkjøpet av tidsserien, åpner den resulterende rå bildefil med dv suffikset og konstatere nedgang i maksimal signalintensitet fra begynnelsen av tidsserien til det endelige bildet. Kast alle tidspunkter der det har been mer enn 30% fotobleking.
5. Reconstructing 3D-SIM-bilder
- Fra prosessen menyen, aktivere SI Reconstruction vinduet. Bruk pre-eksisterende innstillinger for alle parametrene.
- Aktiver Bruk Channel Spesifikk OTF-knappen, og satt til Standard filtersett. Aktiver Bruk Channel Specific KO vinkler knappen og satt til Standard filtersett.
- Dra og slipp rå (dv) fil inn i Input-filen plass. Klikk Gjør det. Utdatafilen vil ha samme navn som input filen med _SI lagt til på slutten.
Merk: Denne gjenoppbyggingen kan kjøres som en oppgave ved hjelp av oppgave Builder funksjon fra Process menyen hvis flere filer skal behandles.
6. Dataeksport og analyse
- Bruk Imaris å visualisere 3D-bilder i overgå modus og export bildedata som tiff (300 dpi) eller AVI-filer (ingen komprimering). Størrelse målinger i Imaris kan utføres ved hjelp av målinger verktøy i overgå modus.
- Genererer 3D intensitet plott av Z ring fra 3D-SIM bildedata:
- Undersøke fordelingen av FtsZ rundt Z-ringen og for å skape 3D-intensitetsplottene
- Åpne et 3D-bilde-fil for å vise enkelt z-skiver. Bruk volum viewer verktøyet plassert under kategorien Vis-menyen for å beskjære et område av interesse.
- Skriv inn vinduet nummer for denne 3D-bildet i MMS-vinduet og skriv inn en ny og ubrukt vindu nummeret i utgangsvinduet. Den velger region knappen vil bli tilgjengelig for å beskjære et individuelt Z ring av interesse fra den opprinnelige 40 × 40 mikrometer synsfelt.
- Juster ønsket akse og graden av rotasjon i kategorien rotasjon. Klikk på Do It knappen. Rull gjennom volumet for å oppnå den ønskede perspektiv av Z-ringen.
- Bruk data inspektør verktøyet og justere than kolonne / raddimensjoner å opprette et nytt område av interesse rundt en individuell Z ring. Klikk midt på bildet for å plassere denne nye regionen av interesse. Teksten bildedata er en automatisk generert tabell som viser fluorescens intensiteten i hver piksel i regionen av interesse.
- Klikk på 3D-graf-knappen for å i utgangspunktet se intensiteten tomten.
- Alternativt tekst bildedata kan eksporteres ved å klikke på lagre tabellen data-knappen i filmenyen.
- Kopier bildedataene fra den lagrede tekstfilen inn i en ny regneark. Velg alle cellene i regnearket, og skape en ny 3D-Surface grafen. Formater 3D intensitet plottet grafen for publisering.
- For time-lapse data gjenta trinn 6.2.1.1 - 6.2.1.7 på hver av de ulike tidspunkter fra 3D bildefilen.
- Undersøke fordelingen av FtsZ rundt Z-ringen og for å skape 3D-intensitetsplottene
- Sporing Gjennomsnittlig fluorescens intensitet over tid
- Bruk tekst bildedata for å spore fluorescence intensitet over tid i et område av interesse.
- Velg cellene som tilsvarer regionen av interesse.
- Beregn den gjennomsnittlige fluorescensintensitet ved hvert tidspunkt for denne regionen av interesse.
- Bruk gjennomsnittlig fluorescens-intensitetsverdier til å generere et separat linjegraf.
Representative Results
I denne studien visualisert vi bakterie celledeling protein FtsZ, uttrykt i levende celler som en FtsZ-GFP fusjon, for å illustrere de kraftige fordelene med F3D-SIM fremfor konvensjonelle fluorescens mikroskopi for å studere bakteriell protein lokalisering og dynamikk. FtsZ er et tubulin-lignende cytoskeletal protein som polymeriserer til en dynamisk ringstruktur rundt hele omkretsen av cellen. Z ringen har en viktig funksjon i celledeling: sin samling markerer fremtiden stedet av divisjon, det rekrutterer alle celledeling proteiner til dette området, og Z ring innsnevring ser ut til å gi kraft til å tillate innover bevegelse av cellen konvolutten under cytokinese 17 18.
Når visualisert ved konvensjonell bred-felt fluorescensmikroskopi, vises Z ringen som en enkelt tverrgående bånd av fluorescens i stavformede bakterier, inkludert de mest studerte organismer som B. subtilis (figur 2A), <em> E. coli og C. crescentus. Viktigere, fluorescensintensiteten gjennom dette båndet synes å være mer eller mindre ensartet, og den lokaliseringsmønster gir svært liten innsikt i den strukturelle organisasjon og fordeling av FtsZ polymerer innenfor Z-ringen. Når de samme celler blir undersøkt ved hjelp av F3D-SIM-metoden som beskrives her (figur 2B), men fordelene ved denne teknikken er umiddelbart synlig. Først rotasjon av 3D-SIM bildet rundt z-aksen muliggjør visualisering av Z-ringen som en ekte ringstruktur i tre-dimensjonalt rom (figurene 2C og 3A). Sammen med økningen i oppløsning, viser dette at fordelingen av FtsZ i Z-ringen er i virkeligheten svært heterogent (figur 3). Forbedringen i oppløsning også gir oss mulighet til å se Z ringene som har begynt prosessen med innsnevring for å danne en divisjon septum (indikert av invagination av cellemembranen i <strong> Figur 2C og 2D).
Andre eksempler på B. subtilis Z ringene visualisert ved denne teknikk er vist i figur 3BI - 3Biv og illustrerer hvordan fluorescensintensiteten rundt Z-ringen aldri er den samme. Dessuten er delene av meget lav fluorescensintensitet ofte observert. Vi henviser til disse regionene som hull (hvite pilspisser). Vi observerer disse gapene i 15% av alle Z ringene undersøkt (n = 84) og hovedsakelig i Z-ringer med en diameter på 800-900 nm (93%). For å kvantifisere disse observasjonene ble det 3D intensitetsplottene er laget av Z-ringen og er vist i figur 3Ci og 3Cii ved hjelp av Z-ringer som er vist i fig 3Biii og 3Biv. Den intensitetsplottene viser at vanligvis mengden av fluorescens i Z-ringen kan variere opp til 3 - 4 ganger i forskjellige regioner av B. subtilis Z ring. Videre 3D intensitet tomter viser at gaps av fluorescens inne i Z ring nesten lese baseline nivåer av bakgrunnen fluorescens (svart pil i figur 3Ci). Disse ovennevnte eksemplene viser gode rekonstruksjoner av Z-ringen og er avhengig av tilstrekkelig lyset som emitteres fra prøven uten betydelig fotobleking. Dette oppnås gjennom lysstyrken på GFP fluoroforen smeltet til FtsZ og sin overflod i cellen under disse forholdene (høy signal til støyforhold). I andre celler hvor signal-til-støy-forholdet er lavt rekonstruksjonen av bildet er dårlig. For å simulere denne forekomsten med FtsZ-GFP, mengden av utslipp signal hentet fra B. subtilis celler ble redusert ved å senke eksitasjonsenergien. Som vist i figur 3D en 100 ganger reduksjon av energi eksitasjon resulterer i et bilde av Z-ringen som har signifikante gjenstander. Dette skjer som følge av utilstrekkelig lokal kontrast mellom FtsZ-GFP-signal og bakgrunn, som fører til lavr rekonstruksjon av bildet.
Interessant, B. subtilis Z ringene viste mer uttalt hullene og heterogenitet i de øvre og nedre regioner av ringen, men ikke på sidene av ringen (figur 3B). Dette skjer på grunn av forskjellen i oppløsningen oppnås ved denne variant av 3D-SIM i sideplanet i forhold til det aksialplan. Dette resulterer i de øvre og nedre regioner av Z ringen (lateral plan) som er avbildet med optimal oppløsning. Hullene i Z-ring er for små til å bli detektert i sidene av Z-ringen som visualiseres i aksialplan, som har omtrent halvparten av oppløsningen av den laterale planet. Bakterier som har en kokkoid morfologi, slik som S. aureus, har Z-ringer som er plassert i alle plan. Så imaging Z ringen når den ligger i sideplanet (eller nær den) gir mulighet til bilde alle regioner av ringen med optimal oppløsning. Benytte seg av dette, undersøkte vi strukturen iZ ring i levende S. aureus-celler, ved å benytte en stamme som inneholder et plasmid-bærende en ftsZ-GFP fusjon. Produksjon av denne fusjon er under kontroll av en induserbar promoter P SPAC (se trinn 1.2.1). Når avbildes med i aksialplan, S. aureus Z ringene dukket opp identisk med B. subtilis Z ringer som er til stede i det samme plan (figur 4Ai). Imidlertid avbildning Z ringer i sideplanet fastslått at hele Z ringen først på begge kulelignende og heterogen. Om 26% av disse ringene viste også minst en synlig "gap" av fluorescens (figur 4Aii, 4B). I likhet med B. subtilis FtsZ, fluorescens-intensitetsplottene viser at intensiteten av fluorescens i Z-ringen varierer så mye som 4-6 ganger i forskjellige områder av S. aureus Z ringen (figur 4C).
Lengden og bredden av perlene kan måles (referere til skjematisk i figur 4D). Dette viste at 80% av Z-ringer (n = 43) som ble undersøkt hadde en limstreng lengde på 200 nm, og nådde en maksimal lengde på 400 nm. Bredden av perler, på den annen side, målt på opptil 200 nm. Det var i gjennomsnitt 12 ± 2 (SEM) FtsZ perler per Z ring. Lignende lokalisering data ble observert når innfødte FtsZ ble visualisert med disse metoder ved hjelp av immunfluorescens mikroskopi (IFM) som viser at dette heterogene og perle-lignende lokalisering mønster var ekte og ikke en gjenstand forårsaket av uttrykk for ftsZ-GFP i tillegg til mors FtsZ (data ikke vist). Denne utvikling av 3D-SIM er i stand til å vise at Z ringen vises som en heterogen struktur og er muligens diskontinuerlig natur.
For å adressere spørsmålet om hvordan denne heterogene Z-ringstruktur gjennomgår innsnevring og forenkler celledeling, kan en time-lapse analyse av Z ring dynamikk utføres. En av hovedutfordringene medfluorescens mikros time-lapse undersøkelser er i minimering av prøven fotobleking og fototoksisitet under avbildning. 3D-SIM krever et stort antall av rå-bilder som skal oppnås som betyr at fotobleking av en prøve over tid vil resultere i et dårlig signal-til-støy-forhold som fører til manglende signal for å tillate passende bilde rekonstruksjoner. Anvendelsen av den nye teknologien minimaliserer mengden av eksitasjonsenergien brukes for hver eksponering og således en reduksjon i energi legge inn de levende celler. Den gjør dette ved en kombinasjon av lysstrålen interferometri for å skape det strukturerte mønster på prøven og bruk av vitenskapelige CMOS kamera som øker sensitiviteten og kvantumutbytte. Denne kombinasjonen resulterer i z-stack oppkjøp av en mikrometer per sekund (512 × 512 piksler x 8 z-skiver) i forhold til 1 mikrometer per 5-8 sek (512 x 512 piksler x 8 z-skiver) oppnådd med vår forrige iterasjon av 3D-SIM (beskrevet i Riglar et al. 26).Avtagende bildeinnlastingen tid og eksponeringsinnstillinger kan også bidra til å redusere fototoksisitet av levende celler som er spesielt relevant i time-lapse undersøkelser. Den nye teknologien som presenteres her tar også et annet problem i live cell imaging som vi refererer til som "motion blur", som i denne sammenheng refererer til lokalisering av proteiner skiftende under bilde oppkjøpet. Ved å redusere bildeinnlastingen tid mengden av "motion blur 'er minimert og dermed skape et mer nøyaktig bilde gjenoppbygging.
Tidligere studier som har adressert hvordan FtsZ er organisert innenfor Z ring har ikke vært i stand til å vise hvordan Z ringstruktur endrer seg over tid. For å undersøke dette aspektet vi utførte time-lapse bruker F3D-SIM. Dette aktivert anskaffelse av en 3D-SIM bilde av Z ring i B. subtilis hvert 5-10 sekund over en periode på 50 sek, noe som tidligere ikke var mulig på denne tidsskalaen. Vist i figur 5A er en eksempelvis sone av de raske endringene i FtsZ fordeling innen Z ring over tid (diameter på 890 nm). Andre Z ringer som var synlig i ferd med å sammensnøring ble også vist å ha lignende dynamikk som påvirket fordelingen av FtsZ rundt Z-ring (ikke vist). 3D intensitet tomter kan også genereres for hver av tids poeng å kvantifisere og sette pris på de stadige fluorescens intensitet endringer og dermed relativ overflod av FtsZ i ulike regioner av Z ring på en tidsskala på sekunder (figur 5B). Regioner av interesse kan identifiseres fra disse intensitet tomter å spore svingningene i fluorescens intensitet (figur 5C). Sporing av disse endringene i Z ringstruktur under disse forholdene ville være nesten umulig uten den avanserte F3D-SIM-teknologi. I tillegg er dette arbeidet viste at i S. aureus den dynamiske bevegelse av FtsZ er lik den som er observert i B. subtilis. S. aureus RN4220 celler producing FtsZ-GFP ble fotografert for 50 sek 10 sek tidsintervaller. Endringer i heterogenitet av Z ring i S. aureus med F3D-SIM var også lik B. subtilis (se pilspisser og piler i figur 6). Disse tid forfalle studier støtter en modell av Z ring innsnevring (iterativ klemming modell) som ble spådd gjennom undersøkelse av fast C. crescentus celler, men kunne ikke påvises på grunn av behovet for å undersøke Z-ring dynamikk i levende celler 27.
Figur 1. Skjematisk av den optiske konfigurasjonen av F3D-SIM brukt i denne studien. Laser lys fra laseren bordet er rettet gjennom et SIM-fiber til en kollimeringslinse og fast rist, og deretter inn i fasekontrollmodul som skaper både bølgelengdespesifikke optimal avstand of ± 1 st ordre bjelker fra null orden sentrale bjelke og fasetrinn for SIM samling. Bjelkene deretter inn vinkelen kontrollmodulen der reflekteres til de tre ulike klynger for å skape de tre vinkler av belysning. Bjelkene deretter inn mikroskop og lysbanen som vist (Modifisert med tillatelse fra Paul Goodwin, API).
Figur 2. Sammenligning av konvensjonell bredt felt fluorescens og 3D-SIM avbildning av B. subtilis celler uttrykker ftsZ-GFP. (A) Konvensjonell bredt felt fluorescens avbildning av B. subtilis celler uttrykker ftsZ-GFP (SU570, grønn) som ett eksemplar ble også farget med membranen fargestoff FM4-64 (rød). Scale bar = 5 mikrometer. Bildet ble ervervet ved å bruke en oppreist fluorescens mikroskop.(B) 3D-SIM avbildning av den samme B. subtilis belastning uttrykke ftsZ-GFP, farget med FM4-64. Regioner av interesse fra bildet kan velges (stiplet boks) å zoome inn. Bildet kan også roteres rundt z-aksen for å vise 3D FtsZ ringene i aksialplan. (C, D) fjerning av ut-of fokus lys og forbedret bildeoppløsning levert av 3D-SIM lar klar visualisering av Z ringer (inkludert de som er sammentrekkende) og den indre cellemembran under divisjon (angitt med hvite piler). Legg merke til at protokollen teksten beskriver visualiseringen av et enkelt fluoroforen. Imidlertid kan fremgangsmåten tilpasses for å skaffe opptil fire forskjellige bølgelengder samtidig. Dette tallet har blitt gjengitt fra Strauss et al 16.
Figur 3. Representative bilder av Z-ring i levende stavformede bakterieceller (B. subtilis) som uttrykker GFP-FtsZ ved hjelp av 3D-SIM. (Ai) Z-ring er observert som et band av fluorescens vinkelrett på lengdeaksen av cellen som er i xy-planet. (Aii) Bildet er blitt rotert rundt z-aksen ved hjelp av Imaris 3D visualiseringsprogram (se protokollen trinn 6.1) slik at man ser gjennom ringstrukturen til å tydelig se hvordan FtsZ er fordelt i Z ringen. Dette bildet, nå i zx planet viser at ringen har en heterogen fordeling av FtsZ med regioner i ingen eller svært lite fluorescens (hvite pilspisser). Bildet må roteres for å observere disse "gap" regioner av fluorescens. Bi-Biv viser ytterligere eksempler på roterte Z ringene som nå ligger i zx planet. Z ringer i (Bi-iii) har en diameter på ~ 0,9 mikrometer. (BIV) viser en Z-ring med en diameter på only 0,65 mikrometer under innsnevring. (Ci) Denne typiske 3D illustrerer intensitetsprofilen fluorescensintensiteten (dvs. konsentrasjon) forskjeller i FtsZ-GFP rundt Z ring med en diameter på 0,85 mikrometer (se protokoll trinn 6.1 til 6.3). Nivået av fluorescens i disse hullene er lav og nærmer bakgrunnsfluorescens nivåer (sort pil). (Cii) En tilsvarende 3D intensitetsprofilen til en Z-ring i prosessen med innsnevring. FtsZ-GFP konsentrasjon er også ikke-uniform; diameter, 0,65 mikrometer. Paneler A, B, CI og Cii blitt gjengitt fra Strauss et al 16.
Figur 4. Representant 3D-SIM-bilder av S. aureus celler som produserer FtsZ-GFP. Siden disse cellene er runde (kokker), vil Z ring have ulike retninger. Celler som viser et bånd av fluorescens i normal betraktningsretningen (det vil si i xy-planet), som vist i (Ai), se svært lik de i stavformede celler når de roteres rundt Z-aksen som for figur 1Ai. I (Aii) Z-ringen er allerede i xy-planet; lateral orientering og oppløsning er maksimal i hele ringen som nå gir en perle-lignende struktur (B). (C) En 3D intensitet plott av den relative overflod av FtsZ-GFP i Z-ringen. (D) Skjematisk fremstilling av S . aureus Z ring. Røde piler indikerer perle lengde og bredde dimensjoner (se protokoll trinn 6.1). Dette tallet har blitt forandret fra Strauss et al 16.
<strong> Figur 5. F3D-SIM gir rask analyse av FtsZ lokalisering over tid i 3D-SIM. (A) Endringer i FtsZ-GFP distribusjon innenfor Z ring i stavformet B. subtilis celler kan visualiseres for å indikere dynamikken i ringen. (Sek) vises i øvre venstre hjørne av hvert bilde. (B) 3D fluorescens intensitet grafene viser de ikke-uniform og dynamisk fordeling av FtsZ i Z ringen. (C) FtsZ dynamikk (FtsZ-GFP fluorescens endringer i ring) kan også bli undersøkt i nærmere detalj ved å kvantifisere fluorescensen intensitet over tid på to regioner av interesse. Dette tallet har blitt gjengitt fra Strauss et al 16.
Figur 6. F3D-SIM-time-lapse bilder viser endringer i FtsZ lokalisering innenfor ringen over tid i S. enureus. Et hvitt pilhode angir et gap når den opprinnelig oppdaget i Z-ringen. Den tilsynekomst og forsvinning av hullene i samme posisjon (som markert med hvitt pilspiss) over tid illustrerer hvordan FtsZ blir omfordelt rundt Z-ring. Hvite piler indikerer dannelsen av hull i Z-ringen på senere tidspunkter. (Sek) vises i øvre venstre side av bildene. Dette tallet har blitt forandret fra Strauss et al 16.
Discussion
Fluorescent live cell imaging er et kraftig verktøy som gjør det mulig observasjon av dynamiske endringer i cellene over tid. Sanntids avbildning av bakteriecellebiologi har vært vanskelig på grunn av den lille cellestørrelse og redusert evne av de bakterielle cellene for å tåle gjentatt eksponering for eksiteringslys. F3D-SIM har utvidet verktøy tilgjengelig for å avhøre alle cellebiologi, men det er nødvendig å nøye utføre denne teknikken som gjenstander kan innføres dersom dårlig implementert. Det finnes en rekke viktige betraktninger for vellykket bruk av denne teknikken. Som det er en bred-felt fluorescens avbildningsmetode som baserer seg på bruk av punktet spre funksjon av det utsendte lys, brytningsindeks mismatch og sfærisk aberrasjon av det avgitte lys, må unngås for å muliggjøre nøyaktig bilde rekonstruksjon. Bruken av dekkglass på 0,17 mm tykkelse på en høy kvalitet for å unngå variasjon i signalintensitet på grunn av variasjoner i glasstykkelse dekslerleppe er sterkt anbefalt. Det er kritisk viktig å nøye vurdere sfærisk aberrasjon av lyset i de innledende stadier av alle eksperimenter og justere immersjonsolje brytningsindeks etter behov. Dette kan variere fra dag-til-dag som det er avhengig av både temperatur og monterings media / substrat av prøven. Bruken av den uriktige olje vil resultere i dårligere rekonstruksjon av bildene med gjenstander slik som halo og ekkosignaler.
Ved slutten av bildet gjenoppbyggingen, for hver fase er et mål på kvaliteten av rekonstruksjonen kan oppnås ved den "beste tilpasning for kO vinkel" for hver fase / vinkel på belysning. Dersom denne verdien er mindre enn 1 for hver vinkel, da kvaliteten av den rekonstruerte vil mest sannsynlig være høy. Hvis denne verdien er over 6, er det mest sannsynlig at den rekonstruerte bildet vil inneholde gjenstander. Vanlige gjenstander omfatter i) utseende av striper i bildet som korresponderertil en av vinklene i rutenettet. Dette kan skyldes lavere signal fra at gitteret vinkel; ii) haloing rundt strukturer. Dette kan skyldes meget ujevn nivåer av signalet fra de lyse strukturer i forhold til omkringliggende strukturer, en mismatch av brytningsindeksen for olje og prøven, eller kan være på grunn av strukturene i bildet blir for amorf og ikke inneholdende nok "struktur" å bli gjenkjent ved hjelp av algoritmen; iii) 'honeycombing' som resulterer fra et lavt signal til støyforhold i bildet, vanligvis på grunn av høy bakgrunn signal; iv) strukturer som er strukket i / avlange xy som kan være på grunn av brytningsindeksen mismatch av olje og prøven. Denne gjenstanden er vanskelig å skjelne for en uerfaren bruker. Det anbefales at nye brukere konsultere en erfaren SIM forsker for råd om bildetolkning og analyse når du begynner å bruke denne teknikken.
Som med alle fluorescerende levende celler avbildnings eksperimenter, er det importmaur å nøye balansere eksitasjon energitilførsel for å minimalisere graden av fotobleking og fototoksisitet av cellene med tilstrekkelig emisjonssignal er nødvendig for å rekonstruere bilder med minimal artefakt. Overdreven fotobleking (større enn 30% på tvers av en enkelt Z-stabel anskaffelse) vil føre til en stripemønster i det rekonstruerte bildet. Med bruk av sCMOS kameraer, kan super-oppløsning med hell rekonstruert fra rå bilder med utslipp signal så lavt som 1000-tall over bakgrunnen. Dette kan tillate for meget korte eksponeringstider for derved å redusere fotobleking og muliggjør rask fangst for hver ramme. Det øker også mengden av tid mellom rammer for celler å gjenopprette fra eksitasjon energi. I tillegg, som fangsttiden for hver enkelt ramme kan være meget kort, er graden av gjenstanden innføres ved 'bevegelse uklarhet "under en individuell fangst reduseres med bruk av denne metoden.
Dette Variasjon av 3D-SIM tilbyr en rekke andre fordeler fremfor andre tilgjengelige super og høy oppløsning imaging teknologi for direkte avbildning av bakteriell cellebiologer. Den 2-ganger økning i oppløsning i alle tre dimensjoner, og evnen til å bilde på opptil 30 um inn i en prøve muliggjør avbildning av hele bakterier (og pattedyr)-celler i løpet av et eksperiment. Teknikker slik som enkelt-molekyl lokalisering som vanligvis utføres i den flyktige bølge ikke kan oppnå dybden av gjennomtrengning inn i en prøve og ikke gir informasjon om hele celler. Nylige fremskritt som tillater høyere samplingdybder for denne teknikken kan føre til bedre aksial oppløsning på hele celler. I tillegg er enkelt-molekyl lokaliseringsteknikker som krever tusenvis av rå bilder som skal erverves er også begrenset i bildefrekvensen som kan fanges opp og kan kreve kompromiss mellom opptaksbildefrekvens og den endelige oppnådde romlig oppløsning, som den romlige oppløsningen er avhengig antall eveNTS registrert innenfor en definert plass. Reduksjon av antall fangede rammer vil resultere i et lavere romlig oppløsning, men kan være tilstrekkelig til å oppnå den tidsmessig oppløsning er nødvendig for den biologiske prosess er av interesse. Mengden av utvinning tid mellom rammer kan også være nødvendig å øke for å minimere fototoksisitet i levende celler og dermed begrense varigheten og frekvensen som tidsserier kan skaffes. Høyoppløselige teknikker som elektronmikroskopi (EM) eller elektron cryotomography (ECT) gir økt oppløsning i 3D-SIM (og andre super-oppløsning optiske mikroskopi teknikker), men må utføres på faste prøver. Fikse og prosessering kan introdusere artefakter og mangel på merking kan gjøre tolkningen av resultatene vanskelig. Etikett-fri ECT har dårlig kontrast og kan oppnå prøvepenetreringsdybder på omkring 500 til 200 nm 24, slik at selv om for proteinet av interesse kan bli identifisert, kan strukturen av proteinet i en hel bakteriecellen ikke observeres.Selv når merking kan anvendes i EM, for eksempel med en immun, blir avbildning kun utføres i 2D. 3D er bare oppnåelig med tynn seksjonering og beregnings rekonstruksjon av delene. Den tynne seksjonering krever en erfaren tekniker, men kan være problematisk og føre til artefakter. Med levende eller faste celler, gjør 3D-SIM trenger ikke å være forankret i en bestemt måte og celler kan raskt forberedt for bildebehandling i en nær naturlig tilstand.
Denne fremgangsmåte er forholdsvis enkel å gjennomføre ved forskere med minimal erfaring fluorescerende mikroskopi. Eksperimenter kan utføres i medier som støtter sunn cellefunksjon, så lenge den ikke fluorescerer eller generere utilbørlig bakgrunnssignal. For bakterieceller, kan dette tillater bruk av mange typer av komplekse og minimalt medium, eller ved bruk av faste eller semi-fast medium for å kontrollere bakteriecelle motilitet. Mange biologer som allerede har utviklet fluorescerende protein (FP) fusjoner og testet funksjonalitetendisse fusjoner kan ta opp denne teknologien raskt uten videre prosjektering og validering med nye photoactivatable FP fusjoner. Vi fant, som en generell observasjon, at S. aureus var mer utsatt for fotobleking under bildebehandling med FP fusjoner enn B. subtilis. Ved hjelp av vår opprinnelige 3D-SIM-metoder, der rutenett mønster ble generert av en fysisk rist, var vi ikke i stand til å opptre live cell imaging med en rekke S. aureus FP fusjoner. Men med denne avanserte F3D-SIM-metoden, kunne vi image disse FP fusjoner og utføre korte tidsserier for å fange dynamikken i disse merkede proteiner. Dette er mest sannsynlig på grunn av den reduserte eksponeringstider som trengs for bildebehandling og økt tid mellom rammer for celle utvinning.
OMX Blaze 3D-SIM er en kommersielt tilgjengelig teknologi som kan relativt enkelt implementeres i en enkelt laboratorium eller en kjerne bildestudio. Hensyn må tas for å utføre teknikken for å unngå artifakta på grunn av dårlig bildefangst dårlig prøveopparbeidelse eller. Når teknikken beherskes, kan studier av proteinstruktur og dynamikk i små organismer som bakterier bli utført i enkelt eller flerfarge fluorescens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media. |
| N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
| 1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization. |
| Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving. |
| BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
| Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm). |
| Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22 x 22 No. 1 Thickness |
| 35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol. |
| Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Combined orbital/linear shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
| UV visible spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use. |
| softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
| Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
| DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |
References
- Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison. Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving. Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).
- Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens. Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).
- Urban, N. icolai T., Willig, K. atrin, Hell, S. tefan W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).
- Strauss, M. P., et al. 3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis. PLoS biol. 10, e1001389 (2012).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. J. Advances in understanding E coli cell fission. Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).
- Erickson, H. P. Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).
- Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One. Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).
- Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).
- Murphy, G. E., Jensen, G. J.
- Liew, A. T. F., et al. A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus. Microbiology. 157, 666-676 (2011).
- Riglar, D. T., et al. Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte. Cell Hos., & Microbe. 9, 9-20 (2011).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).
