Abstract
蛍光顕微鏡を用いて生物学的試料の画像化は、生試料の超解像を可能にする光の回折の解像度の障壁を克服するための新しい技術と実質的に進んでいる。誘導放出の枯渇（STED）、（例えばPALM、嵐、そしてGDSIMなどの技術を含む）単一分子の局在顕微鏡、および構造化照明顕微鏡（SIM） - 超解像技術の3つの主要な種類が現在ありません。 STEDおよび単一分子局在化技術は、解像度が最大の増加を示したが、これらは、画像取得の増加速度を提供するために遅れている。三次元のSIM（3D-SIM）は、単一分子の局在とSTEDの両方に比べて多くの利点を提供する広視野蛍光顕微鏡法である。解像度は、それぞれ、110および280nmの典型的な横方向および軸方向の解像度で、改善され、カバーガラスから30μm程度までのサンプリングの深さ、を可能にされている全細胞のイメージング。かなりの光毒性および光退色を低減しつつ、原画像の捕捉率を増加させる技術の最近の進歩（高速3D-SIM）は、秒単位で発生する生物学的プロセスの迅速な取り込みを可能にします。ここでは、画像への細胞が分析されるかを示すために蛍光標識された細胞質分裂のFtsZタンパク質およびこの技術が提供できるユニークな情報のタイプを有する細菌細胞をそのような方法の使用を記載している。
Introduction
異なるイメージング技術の数は、さまざまな電子及び光学顕微鏡技術を含む細菌を研究するために長年にわたって使用されてきた。電子顕微鏡は、非常に高い解像度を提供しながら、ナノメートルまで、真空および造影剤の使用の必要性が固定され、埋め込まれた標本にこの技術を制限している。アーチファクトに起因長い試料調製及び当業者にも導入することができるサンプルを調製し、得られた画像を分析し、解釈するために必要とされる。光学顕微鏡は、より単純なサンプル調製および電子顕微鏡に比べて比較的容易に複数のラベルを適用することの利点を提供しています。蛍光タンパク質および色素コンジュゲートを使用して、蛍光顕微鏡で生細胞を研究する能力もまた可能である。フルオロフォアの安定性と蛍光タンパク質サイズ/構造の改善低下細胞毒性をもたらすだけでなく、カメラの検出？と思ったらにおける進歩広視野および共焦点イメージングシステムを用いて、学問、蛍光顕微鏡を大幅細胞の空間動態の理解を拡大している。これらの技術を使用して、過去20年間の細菌細胞の私たちの知識は、細菌細胞1内の構造やタンパク質、組織の高いレベルを明らかにし、はるかに詳細な図にも大きく進んでいる。
しかし、光学顕微鏡の従来の方法は、固有の解像度が使用される励起光の波長の約半分であることを意味し、回折限界である。したがって、さらに最も最適な従来の光学顕微鏡システムを用いて、最良の横方向の解像度が約220〜250ナノメートルであり、軸方向の分解能は約500nmである（総説についてはSchermelleh ら 2参照）。特に細菌の細胞生物学者は、これはまだ深刻なこれらの小さな細胞の空間的構成の理解を制限します。 DIAMにわずか1〜2程度であることETER、長さが1〜10μmの。タンパク質の動的空間挙動が、インビトロのデータに補完するように分析することができる生きた細胞で行うことができる高解像度技術も必要である。
過去10年間、いくつかの超解像蛍光イメージング技術が開発されている。超解像顕微鏡は、従来の光学顕微鏡を用いて得られる少なくとも2倍、横方向の解像度が、それによって、回折限界を克服するイメージング技術を説明しています。これらの技術は、見かけの解像度の実質の増加を作成するために放出される光の照明および/または分析を操作します。超解像技術の3つの主要な種類がまだあり- i）の放出の枯渇顕微鏡3（STED）を刺激し;そのような光活性化ローカライゼーション顕微鏡4,5（PALM）、確率的光学再構築顕微鏡法などの技術を含むⅱ）単一分子の局在顕微鏡、
三次元構造化照明顕微鏡（3D-SIM）は、それぞれ約110および280nmの決議結果として両側面と軸方向の解像度を向上させ、広い視野技法である。サンプリングの深さは、全細胞の画像化を可能にする、カバースリップから30ミクロンまでである。光学顕微鏡実験（OMX）プラットフォーム上セダト、AGARD、およびGustaffssonによって開発された3D-SIMの変化が異なる15内に移動される既知のグリッドパターンを試料に照射することを含む各z平面9-11の位置。観察可能領域外周波数空間で作成された結果として生じるモアレパターンの縞を測定する。周波数空間からの情報は、可視超解像画像10,11を生成することは、計算、再構成されている。生の画像は、この技術を用いて取得することが可能な相対速度は、生細胞のイメージングを可能にする。しかし、それは秒の時間スケールで発生する生物学的プロセスのために、生の画像の取得率は依然として動的な変更をキャプチャするには遅すぎることに注意することが重要です。秒の捕捉率との時系列については、十分な回復時間なしで繰り返さ買収は、特に小さな細菌細胞のライブイメージングの間に、光毒性および光退色につながることができます。
これらの問題を克服するために、高速な3D-SIM（F3D-SIM）のための最近の進歩が開発されている。ここでは、私だったOMXブレイズ16として知られているものを説明しますこの技術は、以前のシステムで使用されたような物理的なグリッドを使用することなく、パターン化された照明は、後半に2011年に作成されますntroduced。光束と新しいシャッター技術干渉の使用は非常に急速な方法で、試料上のパターン化された光の生成を可能にする。既存のEMCCDカメラと比較した場合、画像取得の速度はさらに、特に、科学的な相補型金属酸化膜半導体（sCMOS）カメラの導入により増強された。これらの変更は、秒16以内に起こる細胞内の動的な変更の監視を可能にする、1ミクロン（512×512ピクセル、9のzスライス）のサンプリング深さのために、毎秒1フレームの可能な画像取得速度をもたらした。この方法を用いて細胞を生きて見かけ上のエクスポージャーの減少（励起）時間が延長された時間キャプチャするシリーズまたは捕捉率の増加のいずれかを可能にする。
ここでは、examinするF3D-SIM顕微鏡の適用を記述する電子構造と2細菌種の細胞内の細胞質分裂のZリングのダイナミックな動き：棒状のモデル生物の枯草菌と球形ヒト病原体黄色ブドウ球菌 。 FtsZは、細菌17,18における細胞分裂に重要な役割を果たしているチューブ状の細胞骨格タンパク質である。これは、分割装置17,18を形成する、少なくとも20の他の分割のタンパク質をリクルートする分割部位に局在し、細胞収縮19-23力を提供すると考えられている。この方法は、不均一のFtsZはビーズ状配置の両方の生物におけるZリングの周りに分布していることが明らかになった。クライオ電子断層撮影（ECT）24によって示唆されるように、従来の広視野蛍光顕微鏡、または不連続構造によって可視化されるように、Zリングは、セルの周囲に連続均一ベルトであるかどうかの長年の問題を解決することができる。私たちは、3D-SIMの能力は非常に小さな（1の空間的検査を改善する方法を示してミクロン径）S.のような丸い細胞3つの連続した垂直な平面（x、y、z）とに分割球菌 。これらの技術を用いてタイムラプス研究は、Z環の構造は、環内に、かなりのFtsZ分子が固定された足場24の内外に移動するよりも総組織変化と、動的であることを示している。
Protocol
1試料の調製
- Bの準備イメージングのための枯草菌細胞
- Bの単一コロニーPenassayブロス（抗生物質中3としても知られているPAB）の10ミリリットルを接種するズブチリス株 SU570（168 TRPC2のFtsZ ::のFtsZ-GFP-仕様 ）16。 30℃で低速（100 rpm）で振とう機中で一晩培養する。
- 高速（215 rpm）で振とうしながら30℃で新鮮なPABに0.05 600（600 nmで測定した吸光度）に一晩培養を希釈し、中期対数期（600〜0.4）まで成長する。
- スクリューキャップのガラス瓶に100ミリリットル1×増殖培地（PAB）での電気泳動グレードのアガロースの2グラムを追加します。オートクレーブでアガロースを溶解する。これは、数ヶ月間、4℃で保存し、必要に応じて、アガロースを溶融させるマイクロ波処理することができる。室温に設定できるようにします。
- 標準GLA上に、接着剤をフレーム（ 材料の表を参照してください65μlの容量）を取り付けssの顕微鏡スライド。これを行うには、薄いポリエステルシートを取り外します（各接着フレームが2ポリエステルシート、薄い1と厚い1との間に位置し、正方形の取り外しセンターがあります）と、顕微鏡スライドの表面にフレームの露出した粘着面を適用します。これは事実上のスライドの上に四角いうまく作成されます。これはその後の工程でそれにこだわってカバースリップを防止するようにフレームに取り付けられた厚さのポリエステルシートのままにしておきます。
- 接着剤フレームに67μlの沸騰ピペットまで電子レンジでアガロース溶液メルト。すぐに平坦な表面を作成し、5〜10分間室温で残すように上にカバースリップを配置。サンプルが採取されている間1〜2分間、カバースリップを削除します。
- 30秒間5,900×gで、サンプルと遠心分離機の1ミリリットルのアリコートを収穫。上清を除去し、200μlの新鮮なPABにペレットを再懸濁します。
- 事前prepaに濃縮サンプルピペット2.5μlのを取る赤アガロースパッド。アガロースパッドの平らな面に沿って均等にサンプルを広げた。アガロースパッドに触れずにピンセットを用いて顕微鏡スライドからの接着フレームを削除します。
- カバーガラスの底直径35mmのペトリ皿に顕微鏡スライドからアガロースパッドを転送します。ペトリ皿の細胞懸濁液とカバーガラスとが直接接触するようにアガロースパッドを反転させる。ペトリ皿の底には、高分解能イメージングのための1.525の屈折率を有する。
- ライブS.の調製イメージング用ブドウ球菌細胞
- S.の単一コロニーをLブロス10mlに接種黄色ブドウ球菌株のSA94（鋤-のFtsZ-GFPおよびpGL485を含むSH1000あり、r ERMは、のCm r）の25。 37℃での低速（100 rpm）でロータリーシェーカーで一晩培養する。
- 0.05のIPTG（イソ新鮮なL-ブロス中0.05 600（600 nmで測定した吸光度）の一晩培養物を希釈融合タンパク質の産生を誘導するためプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）。
- 高速（215 rpm）で振とうしながら37℃で培養し、中期対数期（600〜0.4）まで成長する。
- Bについて説明したように1.1.8 - 1.1.3、手順に従ってください枯草生細胞調製物。
注：誘導性の制御下に蛍光融合タンパク質を発現する菌株について、ステップ1.1.3にアガロース溶液に誘導物質の適切な濃度を追加します。
顕微鏡の調製
このメソッドは、ブレイズモジュールを装着しDeltaVision OMX（光学顕微鏡、実験的な）3D-SIMイメージングシステムを使用しています。記載される実験のために、唯一つのレーザとつのカメラが使用される。照明光路は、 図1に記載されている。この方法では、顕微鏡は、適切な較正、光学伝達関数（OTF）を有していることを前提としファイルや光視準メンテナンスを実施。
- 生細胞イメージング実験のために、加熱ステージを対物（60X 1.42のNA油浸対物）に取り付けられ、セラミックステージと客観加熱の襟に接続されていることを確認してください。
- イメージングは少なくとも4時間前に、客観的かつ段階のヒーターの電源を入れ、ゆっくりと5℃/時間の最大レートで必要な設定温度をランプアップします。これは、画像化の前に、夕方、このプロセスを開始し、3℃/ 4時間で上昇することをお勧めします。 Bとの生細胞実験のために枯草菌は 、ほとんどの実験は30℃で実施されている。 S.のために黄色ブドウ球菌は 、全ての実験は37℃で行われる。
- 実験の日に、システムおよびレーザーが完全に安定するまで画像化の前に少なくとも1時間電源を入れます。予熱する加熱されたステージに小皿段階インサートをロードします。
- マスタコントローラワークステーションの電源を入れます。
- 画像処理WORKSTATをオンにしますイオン。
- 顕微鏡柵の外階にあるカメラのクーラーの電源をオンにします。
- （これらはすべて使用されませんが）sCMOSカメラのすべての電源をオンにします。
- レーザーと電子エンクロージャの内部には、オンに：
- インストゥルメント·コントローラシャーシ。
- Nanomotionシャーシ。
- Zピエゾのためのイエナコントローラ。
- すべての4ガルボモータコントローラ。
- 一次レーザ制御モジュール。
- 二次レーザ制御モジュール。
- すべてのカメラワークステーション。
- OMXICワークステーション。
- マスタコントローラワークステーションで、アイコンをクリックしてOMXソフトウェアを開きます。適切なデータのフォルダに保存するデータのファイルパスを設定します。
- ハードウェアを初期化するには、 ハードウェアのメニューに移動し、ハードウェアを選択し、 再起動ハードウェアのボタンをクリックします。ウィンドウを閉じる。
- 4（実験に必要なレーザーにsoftWoRx software.Turnを開始88）である。
- レーザー安全インターロック用のキースイッチをオンにします。
- 正しいのダイクロイックフィルタ引き出しが目的の下に挿入されていることを確認。 GFPのためには、標準（または固定）引出しである。
- OMX SFでは、[ファイル ] メニューから[ 設定]を選択し、 引き出しドロップダウンメニューから固定ドロワーを選択します。ウィンドウを閉じる。
- ライトパラメータ]セクションで、ソフトウェアのメイン画面から次の操作を行います。
- チャンネル選択からの励起レーザーおよび発光フィルター（FITC）カメラに適したカメラをアクティブにします。
- モードが シーケンシャルに設定されている画像を確認してください。
- 光路が SIに設定されている確認してください。
- チェックモードが 95 MHzに設定されています。
- 488レーザー励起で選択されて確認してください。
- 設定する
- 実験タブで、 タイプドロップダウンメニューからSIに設定されていることを確認。
- セクショニングがアクティブになっていることを確認し、 光学部の間隔は、0.125に設定されていること。
- スキャン開始が 中間のときのフォーカスポイントを確認してください。
3画像取得
- 対物レンズの先端にオイルを一滴を適用します。 37°Cの場合、推奨される原料油は最高37℃で細菌細胞をマウントするために使用されるゲルパッドの屈折率と一致するように1.518の屈折率を有し（ ステップ1.1.3参照）。
- ステージインセットに準備された細胞を含む試料ペトリ皿を置き、円形の加熱蓋でカバーしています。オイルの底に触れるまで、ステージを下げサンプルペトリ皿。
- 料理は段階で15分間加熱し、平衡化することを許可する。 （ ライトパラメータセクションにあります）5ミリ秒以下の低露出の設定を使用して、（ ナノ位置決め部に位置dZと 、）ナノ位置決めステージコン トロールを使用してサンプルに焦点を当てる。アップフォーカスダウンサンプルを通る光が均等にサンプル焦点面の上下に広がっているかどうかを判断する。点広がり関数は、偶数（球面収差）でない場合、試料皿クロロホルムで対物レンズの底をきれい。油を変更し、適切な一致が、球面収差を最小限に抑えるために、石油·サンプルの屈折率との間で発見されるまで、この手順を繰り返します。
- 0.5μmのdZとステップ·サイズを使用して、画像スタックの頂部および底部をマークする。サンプルの中央に戻ります。サンプル取得の厚さを設定するための実験タブのGet厚ボタンをクリックします。ケーP Zリングの上部と下部を切断しないように注意している間最小限にスタックの高さ。 B.の典型的な厚さ枯草菌のサンプルは2〜3μmのです。
- 現在のエクスポージャーおよび％Tの設定でサンプル画像の最大輝度値 （Max） を決定します。この値は、イメージウィンドウの下に発見された。タイムラプスイメージングのために、イメージのバックグラウンドを超える1,100-1,400の最大強度を得るために、 露出および％Tを調整します。千上記の背景の最小強度は、画像再構成を得るために必要とされる。一回限りの画像の場合、4,000〜5,000に最大強度を増加させる。
- 実験タブでタイムラプスセクションをアクティブにします。必要なフレームレートと合計時間を設定します。 データファイルで、適切なファイル名を入力します。画像取得を開始するために[実行 ] ボタンをクリックします。
注：画像取得が完了したときにグラムREEN プログレスバーが終了し、ログファイルには、適切なデータのフォルダに設定されたデータのために表示されます。
データ品質のチェック4。
- 画像取得の開始時に、時系列の最初のフレームのための画像取得の開始時に画像の最大輝度値を確認します。最初のフレームの取得の終了時に、この最初のフレームのためのzスタックを介してシグナル強度が10％低下以上に存在していないことを確認する。最初の時点で光退色このレベル以上あった場合、時系列を介したデータは、分析のために不十分な品質のものとなり、時系列の取得を停止することができる。
- 時系列の取得の終了時に、といった拡張子得られた原画像ファイルを開き、最終的な画像の時系列の先頭から最大信号強度の減少を把握する。蜂が持つ任意の時点を捨てるnは30％以上の光退色。
5。再構築、3D-SIM像
- Processメニューから、SI再構成ウィンドウをアクティブにします。すべてのパラメータのための既存の設定を使用します。
- 利用チャネル固有OTFボタンをアクティブにして、 標準のフィルタセットに設定されています。 KOボタンを角度および標準フィルタセットに設定を使用してチャンネルの特定をアクティブにします。
- 入力ファイル·スペースにファイル（の.Dv）生をドラッグ＆ドロップします。 それを行う ]をクリックします。 _SIと入力ファイルが最後に追加されたように、出力ファイルは同じ名前になります。
注：複数のファイルが処理される場合、この再構成プロセスは、 プロセス·メニューからタスクビルダ機能を使用してタスクとして実行することができる。
6。データのエクスポートおよび分析
- モードとexを上回るに3D画像を視覚化するImarisを使用して、TIFF（300 dpi）のまたはAVIファイル（圧縮なし）としてポート画像データ。 Imarisサイズ測定は上回るモードでの測定ツールを用いて行うことができる。
- 3D-SIM画像データからZ環の3次元の強度プロットを生成する。
- Zリングの周りのFtsZの分布を調べ、3D強度プロットを作成する
- 個別のz軸のスライスを表示するには、3D画像ファイルを開きます。関心領域をトリミングするビューメニュー]タブの下にあるボリュームビューアツールを使用します。
- 入力ウィンドウに、この3D画像用のウィンドウ番号を入力し、出力ウィンドウに新しい、未使用のウィンドウ番号を入力してください。地域を選択ボタンは、ビューの元の40×40μmのフィールドから関心のある個別のZリングをトリミングするために利用可能になります。
- 回転タブで目的の軸と回転の度合いを調整します。それを行う]ボタンをクリックします。 Zリングの所望の視点を得るために、ボリュームをスクロールします。
- データインスペクタツールを使用とtを調整彼の列/行の寸法は、個別のZリングの周りに関心のある新しい領域を作成します。この関心新しい領域を配置するために画像の中心をクリックします。テキスト画像データは、関心領域内の各画素の蛍光強度を表示し、自動的に生成されたテーブルである。
- 最初は強度プロットを表示するには、3Dグラフ]ボタンをクリックします。
- 別の方法として、テキスト画像データは、ファイルメニューで保存するテーブルデータ]ボタンをクリックしてエクスポートすることができます。
- 新しいスプレッドシートに保存されたテキストファイルから画像データをコピーする。スプレッドシート内のすべてのセルを選択して、新しい3Dサーフェスグラフを作成します。出版物のための3D強度プロットグラフをフォーマットします。
- 3D画像ファイルとは別の時点のそれぞれに6.2.1.7 -時系列データの繰り返しの場合は6.2.1.1を繰り返します 。
- Zリングの周りのFtsZの分布を調べ、3D強度プロットを作成する
- 時間にわたる平均蛍光強度の追跡
- fluorescenを追跡するために、テキスト、画像データを使用する関心領域の経時CE強度。
- 関心領域に対応するセルを選択します。
- この関心領域についての各時点での平均蛍光強度を算出する。
- 独立した折れ線グラフを生成するために、平均蛍光強度値を使用します。
Representative Results
私たちは、細菌の細胞分裂タンパク質FtsZの可視化本研究では、細菌のタンパク質の局在とダイナミクスを研究するための従来の蛍光顕微鏡を介しF3D-SIMの強力な利点を説明するために、のFtsZ-GFP融合として生きた細胞内で発現。 FtsZは、セルの周囲動的環構造中に重合するチューブリンのような細胞骨格タンパク質である。 Z環は細胞分裂において重要な機能を有している：そのアセンブリは部門の将来の部位をマークすると、このサイトへのすべての細胞分裂タンパク質を動員し、Zリング狭窄分裂17の間の細胞エンベロープの内 側への移動を可能にする力を提供するように思われる、18。
従来の広視野蛍光顕微鏡によって可視化すると、Z環は、B.として最もよく研究生物を含む、桿菌における蛍光の単一横バンドとして現れる枯草菌 （ 図2A）、<em>のE。大腸菌およびC. crescentus。重要なのは、このバンドを通じて蛍光強度は多かれ少なかれ均一であることが表示され、局在パターンは、Zリング内のFtsZポリマーの構造組織と流通にはほとんど洞察力を提供しています。同じ細胞を、ここに記載F3D-SIM法（ 図2B）を使用して検査される場合には、しかしながら、この技術の利点は直ちに明らかである。まず、z軸の周りの3D-SIM像の回転は、三次元空間（ 図2Cおよび3A）に本物の環構造としてZ環の可視化を可能にする。一緒に解像度の増加に伴って、これはZ環中のFtsZの分布は実際には（ 図3）非常に不均一であることがわかる。解像性の向上にも私たちは細胞膜の陥入によって示さ分割隔壁を形成する（くびれのプロセスを開始しているZリングを見ることができます<強い>図2Cおよび2D）。
B.のさらなる例この技術によって可視化枯草菌のZリングは、 図3BIに示されている- 3BivとZリングの周りの蛍光強度が同じになることはありません方法を示しています。また、非常に低い蛍光強度の領域がしばしば観察される。私たちは、ギャップ（白矢印）として、これらの領域を参照してください。 900nmで（93％） - 私たちは、800の直径を有するZ環に主に調べた全てのZ環の15％でこれらのギャップを観察した（n = 84）と。これらの観察を定量化するために、3次元の強度プロットは、Z環から作成され、 図3Biiiと3Bivに示すZリングを用いて、図3CIと3Ciiに示されている。 B.の異なる領域で4倍-強度プロットは、典型的には、Z環中の蛍光の量は、最大3を変化させることができることを示して枯草菌のZリング。さらに、3D強度プロットは、GAことを示しているZのリングの内側に蛍光のpsのは、ほぼバックグラウンド蛍光（ 図3CIの黒矢印）のベースラインレベルをお読みください。これらの上記の例は、Zリングの良い再構成を示すものであり、十分な光が著しい光退色することなく、試料から放出されているに依存している。これは、FtsZは、これらの条件下で細胞におけるその存在量（高い信号対雑音比）に融合したGFPフルオロフォアの明るさによって達成される。信号対雑音比が低い他の細胞中で画像の再構成が悪い。のFtsZ-GFP、Bから収集された発光信号の量と、この発生をシミュレートするために、 枯草菌細胞は、励起エネルギーを低下させることによって減少した。 図3Dに著しいアーティファクトを持つZ-リングの画像における励起エネルギー結果の100倍の減少を示すようにこれはのFtsZ-GFPシグナルとうんちに至る背景との間の不十分な局所的なコントラストの結果として起こる画像のr個の再建。
興味深いことに、B。枯草菌のZリングは、リングの上部と下部の領域ではなく、リング（ 図3B）の側面でより顕著ギャップや不均一性を示した。これは、軸平面に比べて横方向の平面内に3D-SIMのこの変化によって達成され、解像度の違いが原因で発生します。これは、Z環（横面）は、最適な解像度で画像化されるの頂部および底部の領域をもたらす。 Zリングのギャップは、横方向平面の約半分の解像度を有する軸平面に可視化されるようにZリングの側面において検出されるには小さすぎる。例えばS.として球形形態を有する細菌、 黄色ブドウ球菌は 、全ての平面内に配置されるZ環を有する。それは、横方向平面（またはそれに近い）にあるときに、Zリングを画像化する画像化する能力に最適な解像度を持つリングのすべての領域を提供します。この利点を生かし、構造を検討しライブS.のZリング黄色ブドウ球菌細胞 、プラスミド保有のFtsZ-GFP融合が含まれている菌株を利用。この融合体の生産がP SPACの誘導性プロモーターの制御下にある（ ステップ1.2.1を参照）。軸平面、Sにして画像化されたとき黄色ブドウ球菌 Z環がBに同一の登場同一平面（ 図4AI）に存在する枯草菌のZリング。しかし、横方向の平面内における撮像Zリングは、全体のZリングがビーズ状と異種両方登場していることを確認した。これらの環の約26％が蛍光（ 図4Aii、4B）の少なくとも1つの可視の「ギャップ」を示した。 B.と同様にS.の異なる領域における6倍- 枯草菌のFtsZは、蛍光強度のプロットは、Z環の蛍光強度は、最大4が変化することを示して黄色ブドウ球菌のZリング（ 図4C）。
ビーズの長さおよび幅を測定することができる（） 図4Dに回路図を参照してください。これは、試験したZ環た（n = 43）の80％が400nmの最大長に達し、200nmのビード長さを有することを示した。ビーズの幅が、他方で、200nmの最大測定した。 Zリング当たりの平均12±2（SEM）のFtsZビーズ上でありました。ネイティブのFtsZは、（ネイティブのFtsZに加えのFtsZ-GFPの発現に起因するこの不均一とビーズ状の局在パターンが本物であることを示す免疫蛍光顕微鏡を使用して、これらの方法（IFM）とないアーチファクトではなくデータを可視化した場合にも同様のローカリゼーションデータが観察された示されている）。 3D-SIMのこの進歩は、Zリングが不均質構造として表示され、自然の中で可能性が不連続であることを示すことができている。
この不均一Z環構造は収縮を受け、細胞分裂を促進するかという問題に対処するために、Z環動態の経時的分析を行うことができる。主な課題の一つ蛍光顕微鏡タイムラプス研究は撮影時のサンプル光退色や光毒性の最小化である。 3D-SIMは、生の多数の画像が経時的に試料の光退色が適切な画像再構成を可能にするために不十分なシグナルをもたらす劣悪な信号対雑音比をもたらすであろうことを意味し得ることが必要である。新技術の適用は、各露光、したがって、生細胞に入るエネルギーの減少のために使用される励起エネルギーの量を最小にする。これは、サンプルおよび感度及び量子効率を向上させる科学的なCMOSカメラの使用時に構造化パターンを作成するために、光ビーム干渉法の組み合わせによってこれを行う。私たちの前の繰り返しで得られた5-8秒（512×512ピクセル×8のzスライス）あたり1程度と比較して、毎秒1ミクロン（512×512画素×8のzスライス）のzスタック取得におけるこの組み合わせの結果（Riglar ら 26に記載されている）、3D-SIM。画像取得時間と露出設定を減少させることもタイムラプス研究において特に関連する生細胞の光毒性を最小限に抑えることができます。ここで紹介する新技術はまた、私たちは、この文脈で画像取得中変化するタンパク質の局在を指し「モーションブラー」と呼んで生細胞イメージングにおける他の問題に対処する。画像取得時間を減少させることにより「動きボケ」の量は、より正確な画像再構成を作成したがって最小化される。
のFtsZをZリング内に編成されているどのように取り組んできたこれまでの研究では、Z環構造が時間とともにどのように変化するかを示すことができなかった。この側面を調査するために私たちはF3D-SIMを使用して、タイムラプスを行った。 BのZリングの3D-SIM像のこの有効に買収この時間スケールで、以前には不可能であった50秒の期間にわたって枯草菌ごとに5〜10秒。 examplは、 図5Aに示されている時間をかけてのZリング内のFtsZ分布の急激な変化の電子（890ナノメートルの直径）。狭窄の過程で目に見えていた他のZ環もZリング（図示せず）の周りのFtsZの分布に影響を同様のダイナミクスを有することが示された。 3D強度プロットはまた、定量化秒の時間スケール（ 図5B）上の継続的な蛍光強度の変化およびZ環の異なる領域でのFtsZの、したがって相対存在量を鑑賞する時間点毎に生成することができる。関心領域は蛍光強度（ 図5C）の変動を追跡するために、これらの強度のプロットから同定することができる。これらの条件下でのZ環構造中にこれらの変更を追跡することは、高度なF3D-SIM技術なしで、事実上不可能であろう。また、この作品はSにそれを明らかにした黄色ブドウ球菌は、FtsZののダイナミックな動きは、Bで観察されたものと同様である枯草菌。S.黄色ブドウ球菌 RN4220細胞PRoducingのFtsZ-GFPは、10秒の時間間隔で50秒間画像化した。 S.のZリングの異質性への変更F3D-SIMと黄色ブドウ球菌はまた、Bと同様であった枯草菌 （ 図6の矢印と矢印を参照）。これらの時間経過の研究は、固定Cの審査を通して予測されたZリング狭窄（反復ピンチモデル）のモデルをサポートcrescentus細胞があるが、原因、生細胞27のZリングのダイナミクスを検討する必要性を実証することができなかった。
本研究で使用F3D-SIMの光学構成の図1の回路図。レーザーテーブルからのレーザ光 はコリメートレンズにSIMファイバを通して導かれ、回折格子固定し、特定の波長の両方を作成する位相制御モジュールにされている最適な間隔oをゼロ次ビーム中心から±1次ビームとSIM収集のための位相ステップF。ビームは、その後、ビームは、照明の3角を作成するために3つの異なるクラスタに反映されている角度制御モジュールを入力します。示すようにビームは、その後、（ポール·グッドウィン、APIからの許可を得て修正済）顕微鏡と光パスを入力します。
従来の広視野蛍光の図2の比較とBの3D-SIMイメージングFtsZは、GFPを発現する枯草菌細胞 。 （A）Bの従来の広視野蛍光イメージングをFtsZは-GFPを発現する枯草菌細胞 ;単一のコピーとして（SU570緑）も、膜色素FM4-64（赤）で染色した。スケールバー=5μmである。画像は直立蛍光顕微鏡を用いて取得した。（B）同Bの3D-SIMイメージングFM4-64で染色のFtsZ-GFPを発現するサブチリス株 。画像から関心領域にズームインする（破線のボックス）を選択することができる。画像はまた、軸平面に3次元のFtsZリングを表示するために、z軸を中心に回転させることができる。（C、D）アウトオブの除去フォーカス光と3D-SIMによって提供される改善された画像の解像度は、（収縮されているものを含む）は、Z環の明確な視覚化および（白矢印）分裂中の細胞内膜を可能にする。プロトコルのテキストは、単一のフルオロフォアの可視化を記述していることに注意してください。しかし、この手順は、同時に最大4つの異なる波長までの取得に適合させることができる。この図は、シュトラウスら 16から再版されました。
図3。 3D-SIMを使用してのFtsZ-GFPを発現するライブ棒状の細菌細胞（ 枯草菌 ）のZリングの代表的な画像。 （藍）Z環はxy平面内にあるセルの長軸に垂直な蛍光のバンドとして観察される。（AII）画像は、zを中心に回転してきたこと（プロトコルを参照Imaris 3D可視化ソフトウェアを使用してγ軸ステップ6.1）ように一つのFtsZをZリング内に分布しているかをはっきりと見るためにリング構造を介して探しています。この画像は、今zx平面にリングがないか、または非常に少ない蛍光（白矢印）の地域とのFtsZの不均質な分布を有することを示している。画像は、蛍光のこれらの「ギャップ」領域を観察するために回転させなければならない。バイBIVは今zx平面内に位置、回転、Z環のさらなる例を示している。 （バイⅲ）〜0.9ミクロンの直径を有する。（BIV）のZリングは、ONLの直径のZリングを示しているyのくびれを受けて0.65以下である。（CI）この典型的な3次元強度プロファイルは、蛍光強度0.85ミクロンの直径を有するのZリングの周りのFtsZ-GFP（ すなわち濃度）の違いを（プロトコルを参照して6.1から6.3ステップ ）を示している。これらのギャップ中の蛍光のレベルが低く、バックグラウンド蛍光レベル（黒矢印）に近づく。（CII）狭窄の過程におけるZ環の類似の3次元強度プロファイル。のFtsZ-GFPの濃度が不均一なこともある。直径、0.65程度である。パネルA、B、CIおよびCIIはシュトラウスら 16から再版されました。
Sの4。代表的な3D-SIM像を図これらの細胞は（球菌）ラウンドであるためのFtsZ-GFPを産生する黄色ブドウ球菌細胞 。、Zリングが場海ますさまざまな向きにメール。 図1AI用としてZ軸周りに回転したとき（藍）に示すように、通常の観察向きで蛍光のバンドを示す細胞（すなわち、xy平面で）、棒状の細胞のものと非常によく似ています。 （AII）においてZ環は、xy平面内にすでに存在する;横方向の向きと解像度は現在、ビーズ状の構造体（B）を与えるリング全体にわたって最大である。（C）のZリング内のFtsZ-GFPの相対的存在の3D強度プロット（D）は 、Sの概略図。黄色ブドウ球菌のZリング。赤い矢印は、ビーズの長さと幅の寸法を（プロトコールステップ6.1参照）を示している。この図は、シュトラウスら 16から変更されている。
<強い>図5 F3D-SIMは、3D-SIMに時間をかけてのFtsZの局在の迅速な分析を可能にする。 （A）棒状B.におけるZ環内のFtsZ-GFPの分布の変化枯草菌細胞は、リングの動態を示すために可視化することができる。時間（秒）は、各画像の左上隅に表示されている。（B）は 、3D蛍光強度プロットが不均一とZ環中のFtsZの動的分布を示す。（C）のFtsZダイナミクス（内のFtsZ-GFPの蛍光の変化リング）もまた、目的の2つの領域に経時的に蛍光強度を定量することによって、より詳細に検討することができる。この図は、シュトラウスら 16から再版されました。
図6 F3D-SIMタイムラプス画像は、S内時間をかけてリング内のFtsZの局在の変化を示すAそれが最初のZリングに検出されたときにureus。白い矢印は、ギャップを示している。時間をかけて同じ位置にあるギャップの出現と消失は（白矢印でマークされたように）のFtsZがZリングの周りに再配布する方法を示しています。白い矢印は、後の時点でZリングのギャップの形成を示している。時間（秒）は、画像の左上側に示されている。この図は、シュトラウスら 16から変更されている。
Discussion
蛍光ライブセルイメージングは、時間とともに細胞内の動的変化の観察を可能にする強力なツールです。細菌細胞生物学のライブイメージングは小さいため、セルサイズが挑戦されて励起光への反復曝露に耐える細菌細胞の能力が低下している。 F3D-SIMは、すべての細胞生物学を調べるために利用可能なツールを拡大してきましたが、それは不十分な実装されていればアーティファクトが導入することができるように、慎重にこのテクニックを行う必要がある。この技術の使用の成功のための重要な考慮事項がいくつかあります。それが放出された光の点広がり関数の使用に依存広視野蛍光イメージング法であるように、放出された光の屈折率不整合と球面収差が正確な画像再構成を可能にするために避けなければならない。高品質0.17ミリメートルの厚さのカバースリップの使用は、カバーガラスの厚さのばらつきによる信号強度の変化を避けるために唇を強くお勧めします。これは、慎重にすべての実験の初期段階の間に放出される光の球面収差を評価し、必要に応じて、液浸油の屈折率を調整することが非常に重要である。それは、温度と試料の封入剤/基板の両方に依存しているので、これは、日常的に異なる場合があります。間違ったオイルの使用は、ハローやエコー信号などのアーチファクトを有する画像の劣っ再建になります。
画像再構成プロセスの最後に、各相毎に再構成の品質の尺度は、照明の各相/角度「KO角に対するベストフィット」することによって得ることができる。この値は、各角度は1未満である場合には、再構成された品質がおそらく高くなる。この値が6を超える場合には、再構成画像は、アーチファクトを含むことになる可能性が最も高い。コモンアーティファクト）が対応して、画像内のストライプの外観を私を含むグリッドの角度のいずれかに。これは、グリッドの角度から低い信号から生じ得る。 ⅱ）構造体の周囲ハローイング。これは周囲の構造に比べて明るい構造からの信号の非常に不均一なレベルに起因する、オイルの屈折率の不整合およびサンプルやイメージがするのに十分な「構造」を含むすぎ非晶質ではなく、中の構造が原因である可能性がありアルゴリズムによって認識;通常、高いバックグラウンド信号を、画像内のノイズ比の低い信号から生じるiii）の「蜂巣 '; iv）はオイルによる試料の屈折率不整合にすることができる延伸/のxyに細長い構造。このアーティファクトは、不慣れなユーザのために識別することは困難である。それは、この技術の使用を開始するときに、新しいユーザーが読影と分析に関するアドバイスを経験豊富な研究者のSIMに相談することをお勧めします。
全ての蛍光生細胞イメージング実験と同様に、インポートされ慎重に最小限のアーチファクトを有する画像を再構成するために必要十分な発光信号が光退色し、細胞の光毒性の程度を最小限にするために、励起エネルギーの入力をバランスさせるアリ。過度の光退色（シングルzスタック取得全体で30％を超える）は、再構成画像内のストライピングパターンにつながる。 sCMOSカメラを用いて、超解像画像が正常にバックグラウンドより上のカウント数千程度の低い放射信号と原画像から再構成することができる。これは、非常に短い露光時間がそれによって光退色を低減し、各フレームの迅速な捕捉を可能にするために可能にすることができる。また、細胞が励起エネルギー入力から回復するためのフレーム間の時間の量を増加させる。各個別のフレームのキャプチャ時間は非常に短くすることができるように、さらに、個別の取り込み中に「モーションブラー」によって導入されるアーティファクトの程度は、この方法を用いて低減される。
このバリ3D-SIMのationは、細菌の細胞生物学者のライブイメージングのための他の利用可能な超高解像度イメージング技術よりも、他の多くの利点を提供しています。サンプルにすべての3次元で解像度が2倍の増加とイメージする能力、最大30ミクロンは、実験中に全体の細菌（および哺乳動物）細胞の画像化を可能にします。一般的にエバネッセント波で行われているような単一分子の局在化などの技術は、サンプルへの浸透の深さを達成することはできませんし、細胞全体についての情報を提供していません。この技術のためのより高いサンプリング深さを可能にする最近の進歩は、細胞全体のより良い距離分解能になることがあります。さらに、取得する原画像の数千を必要単一分子局在化技術は、空間分解能が依存するように、捕獲することができ、キャプチャフレームレートと究極達成空間分解能との間の妥協を必要とすることが、フレームレートが制限されている前夜の数規定された空間内に記録NTS。キャプチャされたフレームの数を減らすと、より低い空間分解能をもたらすが、目的の生物学的プロセスに必要な時間分解能を達成するのに十分であり得る。フレーム間の回復時間の量は、それによって、時系列を得ることが可能な期間および頻度を制限する生細胞における毒性を最小限にするために増加する必要があるかもしれない。そのような電子顕微鏡（EM）または電子cryotomographyなどの高解像技術（ECT）オファーは、3D-SIM（および他の超解像光顕微鏡技術）上の解像度を増加したが、固定したサンプルを実行する必要があります。固定及び処理がアーティファクトを導入する可能性およびラベリングの欠如は解釈が困難になる場合があります。ラベルフリーECTが悪いコントラストを有し、周囲に500から200 nmの24のサンプルの浸透深さを達成することができるので、目的のタンパク質が同定できたとしても、全細菌細胞中のタンパク質の構造を観察することはできない。標識は、免疫金と同様に、EMで使用することができる場合であっても、イメージングは、2Dのみで行われる。 3Dは、薄い切片とセクションの計算再建のみ達成可能である。薄い切片は、経験豊富な技術者が必要ですが、問題が発生するとアーティファクトにつながることができます。生細胞または固定細胞で、3D-SIMは、特定の様式で埋め込まれると、細胞が急速に近い天然の状態で画像化のために調製することができる必要はない。
この方法では、蛍光顕微鏡での最小限の経験を持つ研究者によって実施が比較的容易である。実験は、それが過度のバックグラウンド信号を発するか発生しないように、健康な細胞機能をサポートする媒体中で行うことができる。細菌細胞の場合、これは複雑で、最少培地又は細菌細胞の運動性を制御するための固体または半固体培地の使用の多くの種類の使用を可能にすることができる。すでに蛍光タンパク質（FP）の融合を設計しそれらの機能をテストしている多くの生物学者これらの融合は、新しい光活性化、FP融合でさらにエンジニアリングおよび検証されずに、急速にこの技術を取ることができます。私たちは、一般的な観察 として、見られるS.黄色ブドウ球菌は、Bより、FP融合で撮像中に光退色をより受けました枯草菌 。グリッドパターンは、物理的な格子によって生成された独自の3D-SIM法を用いて、S.数と生細胞イメージングを行うことができなかった黄色ブドウ球菌 、FP融合。しかし、この高度なF3D-SIM法では、これらのFPの融合イメージすることができたし、これらのタグ付きタンパク質のダイナミクスをキャプチャするために、短い時系列を実行します。これはおそらく画像形成に必要な縮小露光時間によるものであり、細胞の回復のためのフレーム間の時間を増加させた。
OMXブレイズ3D-SIMは、比較的容易に、単一の実験室またはコアイメージング設備に実装することができる商業的に利用可能な技術である。ケア人工を回避するための技術を実行するように注意しなければならない貧弱な試料調製や貧弱な画像キャプチャのための事実。技術が習得されると、細菌などの小さな生物におけるタンパク質の構造およびダイナミクスの研究は、単色または多色の蛍光を行うことができる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media. |
| N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
| 1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization. |
| Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving. |
| BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
| Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm). |
| Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22 x 22 No. 1 Thickness |
| 35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol. |
| Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Combined orbital/linear shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
| UV visible spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use. |
| softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
| Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
| DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |
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