Summary
Alle modeller av spontan metastatisk nyrecellekarsinom (RCC) sykdomsprogresjon kan brukes for å vurdere behandlinger i en klinisk relevant setting. Denne protokollen demonstrerer ulike prosedyrer for orthotopic nyre svulst celle implantasjon, riktig nefrektomi, og til slutt skisserer en obduksjon guide for visuell og bioluminescent scoring av metastatisk belastning og lokalisering.
Abstract
En av de viktigste utfordringene for økt testing av nye eksperimentelle behandlingsformer i nyrecellekreft (RCC) er utvikling av modeller som trofast rekapitulere tidlig og sent stadium metastatisk sykdom progresjon. Typiske tumorimplantasjonen modellene benytter ektopisk eller orthotopic primærtumor implantasjon, men få er systemisk spontan metastatisk sykdom som etterligner klinisk setting. Denne protokollen beskriver viktige skritt for å utvikle RCC sykdomsprogresjon iscenesetter lik pasienter. Først, bruker den en svært metastatisk mus tumor cellelinje i en syngene modell for å vise orthotopic svulst celle implantasjon. Metoder er overfladiske og indre implantering inn i sub-capsular plass med celler kombinert med matrigel for å unngå lekkasje og tidlig spredning. Neste det beskriver prosedyrene for eksisjon av tumor bærende nyre (nefrektomi), med kritisk pre-og postoperativ mus omsorg. Til slutt, skisserer den nødvendige skritt for å overvåke og vurderemikro-og makrometastatisk sykdom progresjon, inkludert bioluminescent bildebehandling i tillegg gir en detaljert visuell obduksjon guide å score systemisk sykdom distribusjon. Målet med denne protokollen beskrivelse er å legge til rette for utstrakt bruk av klinisk relevante metastatisk RCC modeller for å forbedre den prediktive verdien av fremtidig terapeutisk testing.
Introduction
Den viktigste årsaken til dødelighet hos pasienter med nyrecellekreft (RCC) er systemisk metastatisk sykdom som vanligvis oppstår etter kirurgisk fjerning av en primær tumor vokser i nyrene. Men svært få prekliniske tumormodeller evaluere eksperimentelle behandlingsformer i mus inkluderer metastatisk sykdom, og enda færre trofast rekapitulere de kliniske stadier av lokaliserte vekst, kirurgi, og spontan mikrometastatisk initiering og progresjon 1-3. Dette gapet i testing har blitt stadig viktigere i vurderingen av nye behandlingsformer som noen ganger slående anti-tumor effekter sett i dyremodeller har ikke alltid oversatt til tilsvarende vellykket behandling av pasienter fire. Slike forskjeller i resultater kan stamme fra differensial narkotika efficacies mellom lokaliserte ektopisk eller ortotopiske primærtumormodeller og sent stadium metastatisk sykdom 5-7. I tilfellet med RCC, har bare noen få studier anvendes etablertNimal protokoller som inkluderer spontan tilbakevendende sykdom som etterligner pasienter som vanligvis har hatt svulst bærende nyrer helt eller delvis fjernet 2,3. Årsakene til denne mangelen i musemodell testing varierer. Først, det er den høye dyret kostnader og iboende variabilitet av tumor celleutvalget og metastatisk potensial. For eksempel, menneskelige nyrecellelinjer har en tendens til å sjelden metastaserer, og må velges over flere runder med orthotopic primære implantasjon og metastatisk utvalg å utlede varianter som konsekvent spre og danne fjerne lesjonene (se beskrivelse av en slik human cellelinje avledning 8-10) . Motsatt, mus celler i immunkompetente modeller har en tendens til å oppføre seg aggressivt, og lave celle tall må injiseres med matrigel å redusere umiddelbar systemisk spredning tre. For det andre tekniske problemer i å utføre forsvarlig implantasjon, kirurgisk reseksjon (nefrektomi), og sporing (og kvantifisering) spontan metastatic vekst kan være utfordrende og flere kritiske variabler må vurderes ved ansettelse av denne teknikken (se diskusjon for detaljer). Hensikten med denne protokollen er å beskrive de grunnleggende trinnene (så vel som potensielle fallgruver) av orthotopic implantasjon, reseksjon (nefrektomi), og overvåking av spontan metastatisk RCC sykdom og å tilby en retningslinje for standardisert (og mer utbredt) bruker blant vitenskapelige laboratorier som vurderer effekten av eksperimentelle behandlingsformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Orthotopic Nyre tumorimplantasjonen
- Cell Culture
- Før orthotopic implantasjon, vokse mus Renca LUC celler som en monolayer til 75% konfluens.
- Etter trypsinering og resuspensjon i 5% FBS inneholdende media, sentrifuger cellene ved 1000 rpm, 4 ° C i 5 min, gjentatt tre ganger for å vaske i PBS. Deretter resuspender cellene i serum-fritt media til en konsentrasjon på 5 x 10 4 Renca LUC / 5 mL serumfritt medium.
Merk: Avhengig av variant eller cellelinje som brukes, kan cellene resuspenderes i forholdet 1:1 av matrigel og serum frie medier å bremse svært aggressive mus cellevekst og spredning etter implantasjon.
- Kirurgi og celle implantasjon
Merk: Alle dyrestudier beskrevet der, inkludert vedlikehold og bestemmelse av eksperimentelle endepunkter, ble utført i henhold til en Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) protocol godkjent av Roswell Park Cancer Institute.- Anesthetize en Balb / C-mus ved bruk av isofluran (2-3%). Knip foten og sjekk for refleks for å sikre tilstrekkelig anesthetization. Apply Veterinæren salve til øynene for å hindre uttørking. Plasser musen i høyre lateral recumbency og barbere venstre side mellom for-og hind-lem. Påfør alkohol og jod langs rygg lumbar området til aseptisk forberede området for innsnitt.
- Bruk kirurgisk saks for å starte en 1 cm hud innsnitt i en lengderetning mellom siste ribbein og hofteleddet. Løsne bindevev under huden ved hjelp av en stump disseksjon saks. Bruk kirurgiske sakser for å lage en 0,5 cm snitt i en langsgående retning i bukveggen. Bruk buet pinsett til å forsiktig presse ned rundt åpent sår - dette vil exteriorize nyrene og gi rom for skånsom immobilisering av orgel før injeksjon.
- Laste Hamilton sprøyte med 5 mL forberedt celleblandingen. For sub-kapsel implanninger, kan to implantasjon metoder benyttes:
- Overfladisk: Kjører parallelt med lengde orientert nyre, sette inn nål under nyrene kapselen (men over parenchyma) med skråkanten opp. Når nålen er på plass, injisere alle cellene til små hvite boble former. Sakte fjerne nålen fra kapselen og umiddelbart klatt løpet injeksjon med en steril bomull tippet applikator å absorbere eventuelle lekkasjer og hindre celle spredning.
- Internt: Med skrå kant opp og starter fra siden av nyre motsatt endelig implantasjon området, sett nålen gjennom indre av nyre inntil nålen er synlige (men ikke punktering) underkapsel plass. Injiser alle cellene inntil hvite bobleformer og vattpinne injeksjonsstedet for å hindre enhver lekkasje.
- Forsiktig tilbake nyrene til kroppshulrommet. Lukk abdominal kroppen veggen med absorberbare 5-0 Vicryl sutur. Når prosessen er ferdig, trekker huden laget sammen og legg 2-3 wound klipp. Sørg klipp er fast og jevnt fordelt for å sikre ingen sår eksponering. Før utvinning administrere 500 mL av 0,9% NaCl og 100 pl av buprenorfin (0,01 mg / ml) subkutant ved hjelp av en 25 G nål. Rutinemessig overvåke klipp plassering og stabilitet, og fjerne etter 10 dager.
2. Nephrectomy / Primær Tumor fjerning
- Følg identisk protokoll for mus anesthetization, immobilisering, snitt, og eksponering av nyre som beskrevet i pkt. 1.2.1 og 1.2.2 (ovenfor).
- Bruk et andre par tenger for å isolere nyrene ved å forsiktig fjerne forbindelses fettvev fra haleenden og binyrene fra kranie ende av nyren. Mens forsiktig fatte nyrene, bruke absorberbare 5-0 Vicryl sutur å lage en dobbel knute rundt ureter, nyrearterien, og vene. Sakte sikker og deretter klippe over knuten for å fjerne nyren. Hvis en hvilken som helst tegn på en gang blodtap, eller det er en risiko for utilstrekkelig holdav sutur på ureter, arterie, og vene, deretter bruke cauterizer stedet for saks til å klippe over knuten.
- Når nyrene blir fjernet, nøye kontrollere for eventuelle blødninger fra bundet arterie og bruke cauterizer om nødvendig. Lukk abdominal kroppen veggen med 5-0 Vicryl. Trekk hudlaget sammen og legg 2-3 sår klipp følge samme forholdsregler som beskrevet i 1.2.4. Nøye overvåke dyr daglig etter operasjonen for tegn på stress, blødning, eller begrenset mobilitet. Følg institusjonelle retningslinjer for dyr trygt.
Tre. Overvåking metastatisk progresjon og lokalisering ved endepunkt
- Metastatisk sykdom kvantifisering: Bioluminescent overvåking
- Se metodikk som tidligere beskrevet i JOVE for overvåking av metastasering ved hjelp av celler transfektert med luciferase og kvantifisert ved hjelp av Xenogen IVIS imaging system 11,12.
- Visuell obduksjon guide for sammenlignende vurdering av metastatisk fordelingsjon
- Ofre dyr i henhold til institusjonelle retningslinjer ved hjelp av endepunkter, inkludert tegn på stress, tung pust, vekttap, osv.
Merk: Tett oppfølging av dyr er kritisk som spontan metastatisk progresjon kan være svært variabel og rask. - Bruk kirurgisk saks for å sette i gang et snitt over urinrøret som fortsetter opp brysthulen til underkjeven. Bruk butt-endte saks for å skille huden fra muskler av bukveggen.
- Initiere snitt langs armer og ben. Peel huden vekk. Nøye undersøke huden fascia og bukveggen for knuter, så overfladiske lymfeknuter: lyske, brachialis, armhule og overfladisk livmor.
- Gjør et snitt i bukveggen og kutt langs venstre og høyre laterale sidene opp til mellomgulvet. Med en horisontal kutt fjerne den fremre delen av bukveggen til bart innvoller.
- Undersøk uforstyrret utseende av viscera feller grovt bemerkelsesverdige svulster. Legg også merke til innholdet i magesekken og tarmene; hvis de er tomme, kan musen ikke har vært i stand til å spise. Hvis innholdet er mørk, kan dette tyde bevis på øvre / nedre gastrointestinal blødning.
- Visuell vurdering hvert organ for tumor nærvær eller fravær, tildele en total poengsum for hver gruppe mus (fire dyr per gruppe er brukt som eksempel i figur 1D-i).
Merknader: 1) Utvidelse av lymfeknuter betyr ikke nødvendigvis at det er en svulst vekst; hvis det er sterkt størrelse, veldig fast, og en hvitaktig farge, er det sannsynlig en metastatisk nodule. 2) Overdreven melkeaktig eller klart væske i magen indikerer ascites. Ascites kan omfatte faste ansamlinger på de abdominale organer, særlig mellom flikene i leveren og mage. 3) for organer som lunger, kan flere knuter være til stede og telles for sammenligninger mellom individuelle dyr (se 13 for eksempel). - Identifiser brutto svulster eller forandringer i det enkelte abdominal organer: lever, milt, nyrer og bukspyttkjertel ved å forsiktig fjerne og vask med PBS fra en skvett flaske.
- Etter å ha fjernet abdominal organer, inspisere mage lymfeknuter, inkludert lumbar, sakrale, nyre, og mesenteric lymfeknute.
- Vurdere membran for bevis for metastatisk spredning.
Merk: Omfattende spredning på membranen kan føre til at det å miste sin kontraktilitet, som fører til arbeidet eller tap av pust. - Fjern membran og lage to laterale snitt i brysthulen, fjerner frontal del å utsette lungene og hjertet.
- Fjern lunger og hjerte ved å forsiktig ta tak i og løfte opp spiserøret og kutte luftrøret over hjertet. Vurdere vev for knuter. Klem hjerte. Mangel på spenstig konsistens kan tyde på tumor stede.
- Bruk kirurgisk saks til å klippe lineært gjennom skallen. Forsiktig fjerne små biter av kraniet til than hele hjernen er utsatt. Se hele hjernen for synlige knuter eller unormalt misfarging.
- Ofre dyr i henhold til institusjonelle retningslinjer ved hjelp av endepunkter, inkludert tegn på stress, tung pust, vekttap, osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1a viser en skjematisk skisserte prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen sammendraget. Flere viktige faktorer må vurderes for hvert trinn. For eksempel, i trinn 1 viser det to metoder for sub-kapsulært tumorcelle implantasjon inn i nyrene. Tumor-celler kan bli implantert inn i sub-capsular plass med en liten hvit-boble som bekrefter den lokaliserte plasseringen av celler med lekkasje hindres ved forsiktig fjerning av nålen og swabbing skytende væskeutslipp (figur 1B-i). For å hindre lekkasje, kan cellene bli implantert internt først å nå under capsular plass (figur 1B-ii), og i kombinasjon med matrigel å hindre den opprinnelige fordelingen av tumorceller i blodet. For kirurgisk fjerning av nyrer, nøyaktige tidspunkt er avhengig av vekst og metastatisk potensiale av cellelinjen som benyttes. Optimal nefrektomi praksis inkluderer en rask, men kontrollert, kirurgisk inngrep for å minimere muse nød og utvinning. Tight og sikker knyting av Vicryl å lukke ureter, nyrearterien og venen er nøkkelen til å unngå hemorrhaging (se figur 1C). Cauterization skal brukes, men bare hvis potensialet overskytende blødning krever intervensjon. Endelig tillater sporing av spontan sykdom ved ikke-invasiv bioluminescent vurdering fortsatt overvåkning av okkult lesjoner og vekst, samt kvantifisering ved endepunkt (se figur 1D). Imidlertid kan bruk av luciferase-merkede celler i spontane metastase modeller noen ganger føre til klonal svulst celle utvalg av varianter som kanskje ikke uttrykker trans genet, og derfor kan ikke alltid være synlig etter flere runder med valg eller langsiktig tumorvekst. I dette tilfelle kan klinisk relevant histologisk analyse utføres for å identifisere mikrometastatiske lesjoner, eller, hvis den ikke er teknisk (til økonomisk) bart, kan en visuell scoring metode for å bedømme visuelt makro-metastatisk sykdom brukes som et mål på overflate presence / fravær av lesjoner i organvevet (figurene 1D-i og 1D-ii).
Figur 1. A) Skjematisk av kirurgiske prosedyrer inkludert implantasjon (trinn 1), kirurgisk reseksjon / nefrektomi (trinn 2), og evaluering av post-kirurgisk metastatisk sykdom (trinn 3). B) Eksempel på sub-kapselpolysakkarid implantasjon inkludert (i) overflate og (ii) indre teknikk. C) Eksempel kirurgisk nefrektomi prosedyre (i), og representative bilde av fjernet nyre med implantert tumor (ii). D) Vurdering av post-kirurgiske spontan metastatisk sykdom ved hjelp av i) en visuell scoringssystem for å vurdere sykdomsfordeling (representative resultater fra 5 grupper på 4 dyr), og ii) bioluminescent data umiddelbart før og etter avliving quantitatively vurdere mikro-og makrometastatiske lesjoner. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med denne protokoll er å vurdere klinisk relevant spontan metastatisk sykdom ved hjelp av en syngen tumor mus modell for å beskrive implantasjon / reseksjon teknikker. Foreløpig gjør de fleste av prekliniske studier som evaluerte nye eksperimentelle behandlingsformer ikke inkluderer studier av metastatisk sykdom og bare få rekapitulere stadier av primær tumorvekst, kirurgisk reseksjon, og eventuell spontan metastatisk spredning. Til dags dato, genmanipulerte mus modeller (GEMMs) genereres å lokke fram spontan nyrecellesykdomsprogresjon (se 14 for oppsummering) inkluderer ikke sent stadium metastasering og kirurgisk intervensjon strategier har så langt ikke blitt rapportert. Derfor er studiet av spontane metastatisk RCC for tiden begrenset til modeller av orthotopic tumorcelle implantasjon. Selv om disse modellene har tidligere blitt utviklet 2,3, er denne protokollen ikke mye brukt i evalueringen av nye behandlinger, spesielt iperioperative setting der det kan ha mest prediktiv verdi. Denne protokollen tar sikte på å detalj en steg-for-steg guide for de nødvendige prosedyrer som kan legge til rette for mer utbredt bruk i terapeutiske evalueringer. I forhold til potensielle fallgruver i å utføre teknikkene som er beskrevet, er det flere viktige hensyn som kan påvirke resultatene. For det første kan tumorcellelekkasje etter implantasjon føre til peritoneal sykdomsspredning, og derfor ikke representerer innledende lokaliserte primære vekst. For det andre må optimale reseksjon ganger etableres for hver cellelinje som brukes. Dette er viktig fordi kirurgisk nefrektomi av tumor-bærende nyre for tidlig ikke kan gi rom for sykdomsspredning (dvs. det kan være helbredende), og operasjonen for sent, kan føre til ikke-lokalisert sykdom, og organ-fiksering (vanligvis i milten), slik at operasjon og innledende mus utvinning ikke er gjennomførbart. Til slutt må overvåke spontan metastatisk sykdom med bioluminescens være sammenfallende med strict tilslutning til institusjonelle retningslinjer overvåkings tegn på dyr sykelighet som sykdommen kan være svært variabel i form av både lokalisering og samlede påvirkningen. Riktig statistisk slått av dyreforsøk vil tillate all variasjon som skal inkluderes, og vil mer trofast rekapitulere kliniske sykdomsutvikling og behandlingstiltak. Til sammen i denne artikkelen har vi demonstrert teknikker brukt for å kunne rekapitulere lokaliserte orthotopic RCC og postoperativ tilbakefall av sykdommen med sikte på å forbedre klinisk relevans i prekliniske tumormodeller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til laboratoriet av Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) for teknisk hjelp og ekspertise i utviklingen av denne prosedyren. Vi vil også gjerne takke Dr. Sandra Sexton og Roswell Park Cancer Institute Institutt for Forsøksdyr Resources. Dette arbeidet ble støttet av en pris fra Roswell Park Alliance Foundation (til JMLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L.
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
