Summary
Modelli di spontanea carcinoma renale (RCC) progressione della malattia metastatica possono essere usate per valutare i trattamenti in un ambiente clinicamente rilevante. Questo protocollo dimostra procedure diverse per l'impianto ortotopico di cellule tumorali del rene, la corretta nefrectomia, e, infine, delinea una guida necroscopico per il punteggio visiva e bioluminescente di carico metastatico e localizzazione.
Abstract
Una delle sfide chiave per una migliore sperimentazione di nuove terapie sperimentali in carcinoma a cellule renali (RCC) è lo sviluppo di modelli che ricapitolano fedelmente la progressione della malattia metastatica-precoce e tardiva fase. Modelli di tumore impianto tipici utilizzano ectopica o ortotopico impianto tumore primario, ma pochi comprendono la malattia metastatica spontanea sistemica che imita la clinica. Questo protocollo descrive i passaggi chiave per sviluppare la progressione della malattia RCC mette in scena simile ai pazienti. In primo luogo, esso utilizza un mouse linea cellulare tumorale altamente metastatico in un modello singenici visualizzare ortotopico impianto delle cellule tumorali. I metodi includono l'impianto superficiale e interna nello spazio sub-capsulare con celle combinate con Matrigel per evitare perdite e la diffusione precoce. Accanto descrive le procedure per escissione del tumore-cuscinetto rene (nefrectomia), con la critica cure pre-e post-chirurgica del mouse. Infine, si delinea i passi necessari per monitorare e valutaremicro-e macro-progressione della malattia metastatica, tra cui l'imaging bioluminescente e fornisce una guida dettagliata necroscopia visiva di segnare distribuzione malattia sistemica. L'obiettivo di questa descrizione protocollo è facilitare l'uso diffuso di clinicamente rilevanti modelli RCC metastatico a migliorare il valore predittivo di futuri test terapeutico.
Introduction
La principale causa di mortalità nei pazienti con carcinoma a cellule renali (RCC) è la malattia metastatica sistemico che si verifica in genere dopo la rimozione chirurgica di un tumore primario crescente nel rene. Tuttavia, ben pochi modelli tumorali preclinici che valutano terapeutica sperimentale nei topi includono la malattia metastatica, e ancora meno fedelmente ricapitolano le fasi cliniche della crescita localizzata, la chirurgia, e spontaneo iniziazione micro-metastasi e la progressione 1-3. Questo divario nei test è diventato sempre più importante nella valutazione di nuove terapie come a volte sorprendenti effetti anti-tumorali visto in modelli animali non sono sempre tradotti in un successo simile trattamento di pazienti 4. Tali differenze nei risultati possono derivare da efficacies differenziali di droga tra i modelli tumorali localizzate ectopiche o ortotopici primarie e in fase avanzata di malattia metastatica 5-7. Nel caso del RCC, solo pochi studi hanno impiegato istituito unprotocolli Nimal che includono la malattia ricorrente spontanea che imita i pazienti che in genere hanno avuto reni tumore interamente o parzialmente rimosse 2,3. Le ragioni di questa carenza nei test modello murino variano. In primo luogo, vi è il costo elevato degli animali e variabilità intrinseca di selezione delle cellule tumorali e potenziale metastatico. Ad esempio, linee di cellule renali umane tendono a metastatizzare raramente, e devono essere selezionati su più cicli di impianto primario orthotopic e la selezione metastatico derivare varianti che costantemente diffondono e formano lesioni lontane (vedi descrizione di come un essere umano linea di cellule di derivazione 8-10) . Al contrario, le cellule di topo in modelli immunocompetenti tendono a comportarsi in modo aggressivo, e il numero di cellule bassi devono essere iniettati con matrigel per ridurre la diffusione sistemica immediato 3. In secondo luogo, le difficoltà tecniche nello svolgimento corretto impianto, la resezione chirurgica (nefrectomia), e il monitoraggio (e quantificare) metastati spontaneala crescita c può essere difficile e più variabili critiche bisogno considerazione quando si impiegano questa tecnica (vedi la discussione per i dettagli). Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere i passi essenziali (così come potenziali insidie) di impianto ortotopico, la resezione (nefrectomia), e il monitoraggio della malattia spontanea carcinoma renale metastatico e per offrire una linea guida per standardizzata (e più diffusa) utilizzare tra i laboratori scientifici che valutano l'efficacia di terapie sperimentali.
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Protocol
1. Ortotopico Rene Tumore impianto
- Cell Culture
- Prima di impianto ortotopico, crescere le cellule del mouse Renca LUC come un monostrato al 75% di confluenza.
- Seguendo tripsinizzazione e risospensione in 5% FBS contenente supporti, centrifugare le cellule a 1.000 rpm, 4 ° C per 5 minuti, ripetendo 3 volte per lavare in PBS. Poi sospendere nuovamente le cellule in mezzi privi di siero ad una concentrazione di 5 x 10 4 Renca LUC / 5 dei media privo di siero microlitri.
Nota: A seconda della variante o linea cellulare utilizzata, le cellule possono essere risospese in un rapporto 1:1 di matrigel e mezzi di comunicazione liberi siero di rallentare la crescita delle cellule del mouse altamente aggressivo e la diffusione dopo l'impianto.
- Chirurgia e cellule impianto
Nota: Tutti gli studi su animali ivi descritte, compresa la manutenzione e la determinazione degli endpoint sperimentali, sono state eseguite secondo un Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC) protocol approvato dal Roswell Park Cancer Institute.- Anestetizzare un topo Balb / C con isoflurano (2-3%). Pinch piede e controllare la reflex per garantire anestesia sufficiente. Applicare vet unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione. Posizionare il mouse in decubito laterale destro e la barba sinistra tra anteriori e posteriori degli arti. Applicare alcol e iodio lungo dorsale zona lombare per preparare asetticamente zona di incisione.
- Utilizzare forbici chirurgiche di avviare una incisione cutanea 1 cm di una direzione longitudinale fra l'ultima costola e l'anca. Allentare tessuto connettivo sotto la pelle con una dissezione forbice smussa. Utilizzare forbici chirurgiche per fare una incisione 0,5 centimetri in una direzione longitudinale nella parete addominale. Utilizzare pinze curve per spingere delicatamente intorno ferita aperta - questo esteriorizzare il rene e consentire delicata immobilizzazione di organo prima dell'iniezione.
- Caricare la siringa Hamilton con 5 microlitri della miscela di cellule preparato. Per impiantazione sub-capsularitazione, due metodi di impianto possono essere impiegati:
- Superficiale: Parallelamente al rene, inserto ago orientato longitudinalmente sotto la capsula renale (ma soprattutto il parenchima) con il bordo smussato up. Una volta che l'ago è a posto, iniettare tutte le cellule fino a piccole forme bolle bianche. Rimuovere lentamente l'ago dalla capsula e asciugare subito sopra iniezione con una punta di cotone applicatore sterile per assorbire eventuali perdite e prevenire la diffusione delle cellule.
- Interno: Con bordo smussato e partendo dal lato opposto rene al sito dell'impianto definitivo, inserire l'ago attraverso l'interno del rene fino dell'ago è visibile (ma non pungere) lo spazio sub-capsulare. Iniettare tutte le celle fino a forme bolla bianca e sito di iniezione tampone per evitare eventuali perdite.
- Dolcemente tornare rene alla cavità corporea. Chiudere la parete del corpo addominale utilizzando assorbibile 5-0 Vicryl sutura. Una volta completata, tirare lo strato di pelle insieme e mettere 2-3 wound clip. Assicurarsi clip sono fermi e distribuiti uniformemente per garantire l'assenza di esposizione ferita. Prima del recupero somministrare 500 ml di NaCl allo 0,9% e 100 ml di buprenorfina (0,01 mg / ml) per via sottocutanea utilizzando un ago G 25. Ordinariamente monitorare clip di posizionamento e stabilità, e togliere dopo 10 giorni.
2. Nefrectomia / Primary rimozione del tumore
- Seguire il protocollo identico per anestesia del mouse, immobilizzazione, incisione, e l'esposizione del rene come descritto nelle sezioni 1.2.1 e 1.2.2 (di cui sopra).
- Utilizzare una seconda coppia di pinze per isolare il rene rimuovendo delicatamente il tessuto grasso collegamento dall'estremità caudale e la ghiandola surrenale dall'estremità craniale del rene. Mentre afferrare delicatamente il rene, utilizzare assorbibile 5-0 Vicryl sutura per fare un doppio nodo intorno al uretere, dell'arteria renale, e la vena. Lentamente sicuro e poi tagliare sopra il nodo per rimuovere il rene. Se uno qualsiasi segno di subito perdita di sangue, o vi è il rischio di hold insufficientedi sutura sul dell'uretere, arteria e vena, quindi utilizzare cauterizer invece di forbici per tagliare sopra nodo.
- Una volta rene è stato rimosso, controllate attentamente per qualsiasi sanguinamento dal arteria legato e utilizzare cauterizer se necessario. Chiudere la parete del corpo addominale utilizzando 5-0 Vicryl. Estrarre lo strato di pelle insieme e mettere 2-3 clip ferita seguenti precauzioni come descritto in 1.2.4. Seguire da vicino animali al giorno dopo un intervento chirurgico per segni di sofferenza, sanguinamento o mobilità limitata. Seguire le linee guida istituzionali per animali in tutta sicurezza.
3. Monitoraggio metastatico progressione e localizzazione a Endpoint
- Metastatica quantificazione malattia: monitoraggio Bioluminescent
- Vedere la metodologia precedentemente descritta in JOVE per il monitoraggio metastasi utilizzando cellule transfettate con luciferasi e quantificati con il sistema di imaging Xenogen IVIS 11,12.
- Guida visiva necroscopia di valutazione comparativa di distribuzione metastaticozione
- Sacrificare gli animali secondo le linee guida istituzionali che utilizzano punti finali compresi segni di sofferenza, respiro affannoso, perdita di peso, ecc
Nota: attento monitoraggio degli animali è fondamentale in quanto spontanea progressione metastatica può essere molto variabile e rapido. - Utilizzare forbici chirurgiche di avviare un'incisione sopra l'uretra che continua la cavità toracica per mandibola inferiore. Usare le forbici blunt-ended per separare la pelle dal muscolo della parete addominale.
- Avviare incisioni lungo braccia e gambe. Pelle a buccia di distanza. Esaminare attentamente la fascia di pelle e la parete addominale per i noduli, quindi i linfonodi superficiali: inguinali, brachiale, ascellari e cervicali superficiali.
- Fare un'incisione nella parete addominale e tagliare lungo i lati laterali sinistro e destro fino al diaframma. Con un taglio orizzontale rimuovere la porzione anteriore della parete addominale a nudo le viscere.
- Esaminare l'aspetto indisturbata dei visceri fo grossolanamente tumori notevoli. Da notare anche il contenuto dello stomaco e dell'intestino; se sono vuote, il mouse potrebbe non essere stato in grado di mangiare. Se il contenuto è scuro, puo indicare prove gambale emorragia / gastrointestinale inferiore.
- Visivamente punteggio per ciascun organo presenza o assenza del tumore, assegnando un punteggio totale per ogni gruppo topo (4 animali per gruppo viene utilizzato come esempio in Figura 1D-i).
Note: 1) l'allargamento dei linfonodi non vuol necessariamente dire che si tratta di una crescita tumorale; se è notevolmente di dimensioni, molto costante e un colore biancastro, è probabile un nodulo metastatico. 2) lattiginoso eccessiva o liquido torbido nell'addome indica ascite. Ascite possono includere accumuli solidi sugli organi addominali, in particolare tra i lobi del fegato e lo stomaco. 3) per organi come i polmoni, noduli multipli possono essere presenti e contati per il confronto tra i singoli animali (cfr. 13, per esempio). - Identificare i tumori lordi o anomalie dei singoli organi addominali: fegato, milza, reni e pancreas, rimuovendo con cura e lavaggio con PBS da uno spruzzatore.
- Dopo aver rimosso gli organi addominali, ispezionare linfonodi addominali, compreso il lombare, sacrale, renale e linfonodi mesenterici.
- Valutare diaframma per l'evidenza di diffusione metastatica.
Nota: spread estesa sul diaframma può causare a perdere la sua contrattilità, portando a affannoso o la perdita della respirazione. - Rimuovere il diaframma e fare due incisioni laterali nella cavità toracica, rimozione della porzione frontale per esporre i polmoni e il cuore.
- Rimuovere polmoni e cuore delicatamente sollevando l'esofago e tagliando la trachea sopra il cuore. Valutare i tessuti per noduli. Spremere il cuore. La mancanza di consistenza elastica può indicare tumore presente.
- Usare le forbici chirurgiche per tagliare linearmente attraverso il cranio. Rimuovere delicatamente piccoli pezzi di cranio fino al tegli intero cervello è esposto. Cercare in tutto il cervello per i noduli visibili o anomalie macchie.
- Sacrificare gli animali secondo le linee guida istituzionali che utilizzano punti finali compresi segni di sofferenza, respiro affannoso, perdita di peso, ecc
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Representative Results
La figura 1A mostra uno schema che illustra le procedure descritte in questa sintesi protocollo. Diversi fattori importanti devono essere considerati per ogni passaggio. Ad esempio, nel passo 1 mostra due metodi per sub-capsulare impianto del tumore cellule nel rene. Le cellule tumorali possono essere impiantati nello spazio sub-capsulare con un piccolo bianco-bolla confermando il posizionamento localizzata di cellule con perdite evitate grazie attenta rimozione dell'ago e tampone eccesso fuoriuscita di fluido (Figura 1B-i). Per evitare perdite, le cellule possono essere impiantate internamente prima di raggiungere lo spazio sub-capsulare (Figura 1B-ii), e combinati con Matrigel per impedire la distribuzione iniziale di cellule tumorali nel sangue. Per la rimozione chirurgica del rene, tempi esatti dipendono la crescita e il potenziale metastatico della linea cellulare utilizzata. Pratica nefrectomia Optimal comprende un veloce, ma controllata, procedura chirurgica per ridurre al minimo il mouse angoscia e di recupero. Tannodatura di Vicryl ight e sicuro per chiudere uretere, l'arteria renale e la vena è la chiave per evitare emorragie (vedere Figura 1C). Cauterizzazione deve essere usato, ma solo se il potenziale di sanguinamento eccesso richiede intervento. Infine, il monitoraggio della malattia spontanea bioluminescente valutazione non invasiva consente un monitoraggio continuo delle lesioni occulte e crescita, così come quantificazione all'endpoint (vedere Figura 1D). Tuttavia, l'uso di cellule luciferasi marcato nei modelli metastasi spontanee a volte può portare alla selezione clonale delle cellule tumorali di varianti che non possono esprimere il gene trasfettate, e quindi non possono essere sempre visibile dopo vari cicli di selezione o di crescita tumorale a lungo termine. In questo caso, clinicamente rilevante analisi istologica può essere eseguita per identificare le lesioni micro-metastatiche o, se non tecnicamente (finanziariamente) fattibile, un metodo di punteggio visivo per valutare la malattia metastatica macro-visivo può essere utilizzato come misura superficiale di PreseSNO / assenza di lesioni in tessuto dell'organo (Figure 1D-i e 1D-ii).
Figura 1. A) Schema di procedure chirurgiche, tra cui l'impianto (punto 1), la resezione chirurgica / nefrectomia (Step 2), e la valutazione della malattia metastatica post-chirurgico (punto 3). B) Esempio di impianto sub-capsulare tra cui (i) superficiale e (ii) tecnica interna. C) Esempio di procedura chirurgica nefrectomia (i) e un'immagine rappresentativa di rene asportato con tumore impiantato (ii). D) Valutazione della malattia metastatica spontanea post-chirurgico usando i) un sistema di punteggio visivo per valutare distribuzione della malattia (risultati rappresentativi di 5 gruppi di 4 animali), e ii) i dati bioluminescenti immediatamente prima e dopo il sacrificio a quantitatively valutare le lesioni micro-e macro-metastatici. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare metastasi spontanea clinicamente rilevante utilizzando un modello di topo tumore singenici per descrivere le tecniche di impianto / resezione. Attualmente, la maggior parte degli studi preclinici che valutano nuove terapie sperimentali non comprendono lo studio della malattia metastatica e solo pochi ricapitola le fasi di crescita del tumore primario, la resezione chirurgica, e l'eventuale spontanea diffusione metastatica. Ad oggi, modelli murini geneticamente (GEMMs) generati per suscitare la progressione della malattia a cellule renali spontanea (vedi 14 per riassunto) non comprendono metastasi fase tardiva e strategie di intervento chirurgico hanno finora non è stato segnalato. Pertanto, lo studio di spontanea metastatico RCC è attualmente limitato ai modelli di ortotopico impianto delle cellule tumorali. Anche se questi modelli sono stati precedentemente sviluppato 2,3, questo protocollo non è ampiamente utilizzato nella valutazione di nuovi trattamenti, in particolare nelimpostazione perioperatorio quali può avere il valore più predittivo. Questo protocollo ha lo scopo di dettaglio una guida step-by-step delle procedure necessarie che possono facilitare un uso più diffuso nelle valutazioni terapeutiche. In termini di potenziali insidie nell'eseguire le tecniche descritte, ci sono diverse considerazioni importanti che potrebbero influenzare i risultati. Primo, tumore perdite cella dopo impianto potrebbe portare a diffusione peritoneale malattia e pertanto non rappresentare crescita iniziale primario localizzato. In secondo luogo, i tempi ottimali di resezione devono essere stabiliti per ciascuna linea cellulare utilizzato. Questo è importante perché nefrectomia chirurgica del rene tumore-cuscinetto troppo presto non può consentire la diffusione della malattia (cioè può essere curativo), e chirurgia troppo tardi può portare a malattie non localizzato e organo-fusione (tipicamente di milza), rendendo la chirurgia e recupero iniziale mouse non fattibile. Infine, il monitoraggio della malattia metastatica spontaneo con bioluminescenza deve essere concomitante con sDistrettuale aderenza alla istituzionali segni di monitoraggio linee guida di morbilità animale malattia può essere molto variabile sia in termini di localizzazione e impatto complessivo. Alimentazione corretta statistica degli esperimenti sugli animali consentirà a tutti variabilità da includere e verrà più fedelmente ricapitolare progressione della malattia e il trattamento risposte cliniche. Nel loro insieme, in questo articolo abbiamo utilizzato le tecniche dimostrate ricapitolare successo localizzata RCC orthotopic e post-chirurgica recidiva di malattia, con l'obiettivo di migliorare la rilevanza clinica nei modelli preclinici di tumore
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati al laboratorio del Dr. Robert S. Kerbel (Università di Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Canada) per l'assistenza tecnica e la competenza nello sviluppo di questa procedura. Vorremmo anche ringraziare il Dott. Sandra Sexton e il Roswell Park Cancer Institute Dipartimento di Laboratorio risorse animali. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio da Roswell Park Alliance Foundation (a JMLE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose with Pyr. And L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0.25% Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS without Calcium & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | must be kept on ice |
| Artifical tears-lubricant opthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Pocket pro pet trimmer | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Alcohol swab | VWR | 326895 | |
| Betadine solution swab | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors straight,blunt - 25 mm blades - 4.5" | Southpointe surgical | RS-5982 | |
| Iris Forceps, serrated, curved, 10 cm long | Kent scientific | INS15915 | need two of these |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 degree, RN needle | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterile cotton tipped appicator | VWR | 10805-144 | |
| High temperature cautery kit | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 coated Vicryl, conventional cutting needle | Ethicon | J834 | |
| Reflex clip applier for 7 mm clips | Kent scientific | INS500343 | |
| Reflex clips, 7 mm, non-sterile | Kent scientific | INS500344 | |
| Removing forceps, 12 cm long | Kent scientific | INS500347 | |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorphine 0.01 mg/ml | |||
| 25 G 5/8" needle | VWR | BD305122 | |
| 1 ml syringe w/out needle | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio technology | LUCK-1G |
References
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