Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

الساخنة البيولوجية الحفز: متساوي الكالوري المعايرة لوصف التفاعلات الإنزيمية

doi: 10.3791/51487 Published: April 4, 2014

Summary

متساوي التدابير الكالوري المعايرة تدفق الحرارة المنطلقة أو الممتصة في التفاعلات الكيميائية. هذه الطريقة يمكن استخدامها لقياس انزيم الحفز. في هذه الورقة، وبروتوكول لإعداد مفيدة، يوصف عموما تجربة تشغيل، وتحليل البيانات، وتطبيقها على توصيف الأنزيمية اليوريا التحلل بواسطة جاك الفول اليورياز.

Abstract

متساوي الكالوري المعايرة (ITC) هو أسلوب وصفها جيدا أن يقيس الحرارة المنطلقة أو الممتصة خلال تفاعل كيميائي، وذلك باستخدام مسبار على أنها جوهرية لتوصيف الواقع كل عملية كيميائية. في الوقت الحاضر، يتم تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع لتحديد المعلمات الحرارية من التوازنات ملزمة الجزيئية البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت ITC لتكون قادرة على قياس حركية مباشرة والمعلمات الحرارية القط، K ΔH) من التفاعلات الإنزيمية، حتى وإن كان هذا التطبيق لا يزال غير مستغلة. كما تحدث تغيرات الحرارة بشكل عفوي خلال الحفز الأنزيمي ومركز التجارة الدولية لا يتطلب أي تعديل أو وسم نظام قيد التحليل ويمكن أن يؤديها في الحل. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة تحتاج كمية قليلة من المواد. هذه الخصائص تجعل ITC أداة لا تقدر بثمن، قوية وفريدة من نوعها لدراسة حركية الانزيم في العديد من التطبيقات، مثل، على سبيل المثال، واكتشاف المخدرات.

معشوقة = "jove_content"> في هذا العمل أسلوب التجريبي القائم ITC-لقياس حركية والديناميكا الحرارية من التفاعلات الإنزيمية يوصف بدقة. يتم تطبيق هذا الأسلوب لتحديد ك القط وK M من الإنزيمية من اليوريا التي كتبها الخنجري Canavalia (جاك الفول) اليورياز. يتم إجراء حساب المحتوى الحراري المولي الجوهرية (ΔH كثافة) من رد الفعل. القيم التي تم الحصول عليها وبالتالي تتفق مع البيانات السابقة التي أعلن عنها في الأدب، مما يدل على موثوقية المنهجية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تقرير الكمي من التفاعلات الكيميائية الحيوية يوفر نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية في أساس الحياة. الكالوري يقدم منهجية خالية من التسمية لوصف كميا كل تفاعل كيميائي تقريبا في الحل. يقيس هذا الأسلوب الحرارة المنطلقة أو الممتصة مع مرور الوقت، وبالتالي فهو نظام الكشف الشامل ومنهجية مريحة للغاية لقياس كمية من رد فعل جزيئات (أي الديناميكا الحرارية ملزمة)، وكذلك لقياس معدل التفاعل (أي حركية). على وجه الخصوص، اعتمد متساوي الكالوري المعايرة (ITC) وطريقة الاختيار لتوصيف الديناميكا الحرارية من التوازنات الجزيئية البيولوجية، التي تنطوي على البروتين يجند، البروتين البروتين، البروتين أيونات المعادن والتفاعلات الحمض النووي البروتين 1-6. بالإضافة إلى ذلك، قدرة المركز على توفير المعلومات الحركية يجعل من نظام قوي جدا لقياس انزيم الحفز، على الرغم من أن إمكانات هذا التطبيق لا يزالالتقليل 7-9.

المعادلة ميكايليس-مينتن 10 هو الوصف الكمي من التفاعلات الإنزيمية، كما أنها توفر علاقة بين معدل التفاعل وتركيز الركيزة، اعتمادا على معلمتين الحركية: ثابت ميخائيل (K M) وثابت معدل الحفاز القط) . القط ك / يشار نسبة K M كما كفاءة الحفاز للانزيم. في الممارسة العملية، وتحديد K M وك القط لردة فعل معينة ويقدم وصفا كاملا للالحفز.

في رد فعل الأنزيمية نموذجي (الشكل 1)، وهي الركيزة (S) يتفاعل مع انزيم (E) تشكيل مجمع انزيم الركيزة (ES)، والتي يتم تفعيلها لاحقا في الحالة الانتقالية (ES *). يتم تحويل هذا الأخير إلى الإنزيم المنتج (EP) المعقدة التي تنأى في نهاية المطاف. هذه الخطوةموصوفة و من رد الفعل التالية.

(1)

حيث ك 1 هو ثابت معدل لتشكيل مجمع ES، ك -1 هو ثابت معدل لتفكك المجمع ES، في حين ك القط هو ثابت معدل الحفاز أو عدد دوران.

وفقا للمعادلة ميكايليس-مينتن 10، ومعدل التفاعل يمكن أن تحسب على النحو التالي:

(2)

التي K M = + ك -1 القط) / ك 1 ك والقط = V ماكس / [E]، مع V ماكس كونها السرعة القصوى عندما وصلت كل انزيم منضما إلى الركيزة.

المعايرة المسعر متساوي هو الأداة المستخدمة في هذه الدراسة لوصف الإنزيمية من اليوريا. يرصد هذا الصك من درع ثابت الحرارة التي تحتوي على اثنين صاغ شكل خلايا (الشكل 1). وترتبط هذه إلى الخارج مع أنابيب الوصول الضيقة. يتم تحميل خلية العينة (حوالي 1.4 مل) مع الحل الانزيم، في حين يتم تعبئة الخلية المرجعية عموما مع الماء أو مع المذيبات المستخدمة في التحليل. A حقنة بالتناوب مع إبرة طويلة ومجداف ضجة المرفقة، التي تحتوي عادة كاليفورنيا. 0.3 مل من محلول الركيزة، هي التي شنت على الخلية العينة. يقيس جهاز الحرارية الفرق في درجة الحرارة بين العينة والخلية المرجعية و، وذلك باستخدام "شبكة ردود الفعل الخلية"، فإنه يحافظ على هذا الفارق في صفر عن طريق إضافة أو طرح الحرارة. أثناء التجربة، يتم حقن الركيزة في حل الانزيم عند درجة حرارة اختار ثابتة. عندما ENيأخذ رد فعل zymatic مكان، وكمية الحرارة المنطلقة أو الممتصة يتناسب مع عدد جزيئات الركيزة التي يتم تحويلها إلى جزيئات المنتج. بالإضافة إلى ذلك، فإن معدل تدفق الحرارة ويرتبط مباشرة إلى معدل التفاعل. البيانات المقاسة، والتي تظهر على أنها انحراف من أثر الحرارة من خط الأساس الأولي (الشكل 1)، وتمثل الطاقة الحرارية (μcal / ثانية) التي قدمتها الصك إلى الخلية عينة، والتي تتناسب مع تدفق الحرارة التي تحدث في الخلية عينة مع مرور الوقت.

الشكل 1
الشكل 1. التمثيل التخطيطي من المسعر المعايرة متساوي لدراسة التفاعلات الإنزيمية. رد الفعل الأنزيمية التي تحدث عند المعايرة الركيزة (في حقن حقنة) في حل انزيم (في الخلية العينة) النتائج في تغيير ذرقوة القانون النموذجي للتحكيم صادر عن مسعر، اللازمة للحفاظ على الفرق في درجة الحرارة بين الخلية عينة وثابت مرجع الخلية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

وعموما، فإن تغير الحرارة (س) يتناسب مع المحتوى الحراري المولي للتفاعل (ΔH) وعدد الشامات من الناتج لدت (ن)، والتي بدورها تعطى من قبل مجموع مرات حجم تركيز:

(3)

تشكيل المنتج مع مرور الوقت (DP / دينارا)، والتي تتطابق مع معدل التفاعل، وبالتالي يمكن أن تكون ذات صلة لكمية من الحرارة المتولدة مقارنة بنفس الفترة من (DQ / ت) من خلال العلاقة:

(4)

وفقا لهذه المعادلة، من أجل الحصول على ميكايليس-منتن مؤامرة فمن الضروري لقياس ط) مجموع المحتوى الحراري ΔH الرحى، والثاني) الحرارة تدفق DQ / دينارا بتركيزات الركيزة مختلفة. عادة، هذه تتم في تجربتين مختلفتين: في التجربة الأولى (الطريقة 1، M1)، يتم حقن الركيزة في حل الانزيم ويتم قياس الحرارة لاستكمال تحويل الركيزة؛ في التجربة الثانية (الطريقة 2، M2)، يتم تنفيذ الحقن متعددة من الركيزة ويقاس معدل إنتاج الحرارة في تركيزات الركيزة مختلفة. هاتين المجموعتين من المعطيات كافية لاستخلاص المعلمات الحركية K M وك القط.

في هذه المادة، يتم وصف بروتوكول العامة لتحديد معالم الحركية للتفاعلات الأنزيمية تنفيذها باستخدام مركز التجارة الدولية. طبقنا طريقة لاليوريا التحلل بواسطة Canavalia الخنجري اليورياحد ذاتها، ونظام مرجعي. اتفاق جيد بين النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة والبيانات المبلغ عنها في الأدب يدل على موثوقية هذا النهج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. عينات إعداد

  1. إعداد 2 مل من محلول أنزيم و 0.5 مل من محلول الركيزة لكل تشغيل تجريبي. تمييع الحلول الأسهم مركزة من الانزيم والركيزة في المحاليل وجود تركيبة متطابقة للحد من حرارة التخفيف والخلط خلال إضافة الركيزة.
    1. اختيار الظروف العازلة التي هي كافية لمنع تغير الرقم الهيدروجيني أثناء التجربة. على سبيل المثال، 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7 كافية لقياس درجة الحموضة في محايدة.
      ملاحظة: إذا كان الأمر ينطوي تبادل البروتون، يجب النظر في المحتوى الحراري أيون الهيدروجين الموجب من المخازن المؤقتة المستخدمة، لأنها تؤثر على قياس ΔH للتفاعل. يجب أن تؤخذ آثار محددة ممكنة من المخزن المؤقت أو جزيئات المواد المضافة على النظام قيد التحليل في الاعتبار. إذا لم يتم تضمين المذيبات العضوية (مثل DMSO) في حل الانزيم، وإضافتها في تمام نفس التركيز في حل الركيزة.
    2. للتجربة M1، بدءمع تركيز الانزيم في نطاق نانومتر (1 نانومتر على سبيل المثال) ومع تركيز الركيزة لا يقل عن ثلاثة أوامر من حجم أعلى من تركيز الانزيم وفوق K M.
    3. للتجربة M2، وتبدأ مع تركيز الانزيم في نطاق مساء نانومتر (على سبيل المثال 15 م). تركيز الركيزة في حقنة هي في حدود ملي (على سبيل المثال 400 ملم).
      ملاحظة: في حقن التجربة M1 واحد، وينبغي أن تكون تركيزات كافية لتحقيق مجموع التحويل الركيزة في المنتج أكثر من مرة التجريبية. وبالتالي فإن تركيز الانزيم يعتمد على معدل انزيم: إذا الانزيمات مع انخفاض ك القط هي قيد الدراسة، وتركيزات الإنزيم أعلى (تصل إلى 10 ميكرومتر) يجب استخدام. من ناحية أخرى، يجب أن تركيزات الإنزيم المستخدم في التجربة M2 أؤكد أن الركيزة حقن هو هامشي فقط (أقل من 5٪) والتي تستهلك العائدات رد فعل الانزيم في حالة مستقرة. لهذا السبب، وارتفاعالكفاءة الانزيم، وانخفاض تركيز انزيم المطلوبة. في نهاية التجربة، وينبغي أن يكون تركيز الركيزة في الخلية العينة أعلى من K M.
  2. التحقق بعناية الانزيم وتركيزات الركيزة مع إجراء التحليل المناسب (على سبيل المثال الامتصاصية في 280 نانومتر، واللونية، المقايسات BCA 11. هذا مطلوب للحصول على حساب دقيق وموثوق بها من المعلمات الحرارية والحركية.
  3. قياس درجة الحموضة من الحلول والتحقق من أن عدم تطابق الرقم الهيدروجيني لكل من الانزيم والحلول الركيزة هو الحد الأدنى في ظل الظروف التجريبية (± 0.05 وحدة الحموضة).

2. أداء التجربة

ملاحظة: يجب تطبيق نفس الإجراء على حد سواء لM1 M2 والتجربة، والتي يتم تنفيذها واحدا تلو الآخر.

  1. تحقق من أن خلية العينة وحقن حقنة يتم تنظيفها وفقا لالصانعالتعليمات. ملء حقنة التحميل المتوفرة مع الصك مع الماء المقطر، إدراج بلطف الإبرة في الخلية العينة، وملء الخلية وإزالة السائل باستخدام نفس الحقنة. باستخدام هذا الأسلوب، وغسل الخلية عينة مرتين مع الماء المقطر ومرتين مع العازلة.
  2. تحميل خلية العينة مع 2 مل من محلول أنزيم باستخدام حقنة التحميل، وتجنب بعناية تشكيل فقاعات الهواء. حقن ببطء الحل في الخلية حتى تسرب من الجزء العلوي من جذع الخلية. تنتج طفرة من كاليفورنيا. 0.25 مل من محلول داخل الخلية. كرر مرتين. هذه الخطوة تزيل فقاعات الهواء المحتبسة في الخلية العينة.
  3. وضع إبرة الحقنة التحميل على الحافة بين الخلايا الجذعية وميناء الخلايا وإزالة أي حل الزائدة.
  4. بدء برنامج VP-عارض و، من واجهة الكمبيوتر، تتوازن الصك ITC إلى درجة حرارة 3 درجات مئوية تحت درجة حرارة التجريبية المطلوب. هذا أمر مطلوب لتجنب موازنة طويلةفترات قبل التجربة، ويرجع ذلك إلى جهاز تبريد فعال السلبي.
  5. ملء الخلية المرجعية بالماء المقطر مع نفس الإجراء أعلاه. عندما مخازن مع القوة الأيونية عالية أو الأسمولية عالية في محلول العينة، يجب استخدام نفس المخزن المؤقت كحل المرجعية.
  6. ربط حقنة بلاستيكية لميناء تعبئة الحقنة الحقن، وذلك باستخدام أنبوب السيليكون رقيقة. ملء حقنة حقن وضع طرف الإبرة في المياه ووضع، حتى يخرج الماء من ميناء ملء أعلى، مشيرا إلى أن حقنة حقن ممتلئ. ثم نقل معلومات سرية حقنة من المياه ووضع الهواء، لإفراغ الحقنة الحقن. مع هذا الإجراء، وغسل حقنة حقن مع العازلة، وسحب الهواء من خلال النظام. بعد ذلك، ضع إبرة حقن في أنبوب ضيق تحتوي على 0.5 مل من محلول الركيزة، ورسم بعناية حتى وملء تماما حقن حقنة، وترك كمية صغيرة من الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. منواجهة الكمبيوتر، اضغط على "إغلاق ميناء التعبئة". إزالة أنبوب السيليكون التحميل. اضغط على "تطهير وإعادة ملء" الزر للسماح للحقن حقنة لطرد أي فقاعات الهواء وطردهم مرة أخرى إلى الحل السائبة. كرر مرتين.
  8. نقل حقنة الحقن، ويمسح على الجانبين لإزالة أي قطرات ووضع إبرة الحقنة الحقن في الخلية العينة.
  9. على جهاز الكمبيوتر، قم بتعيين المعلمات المناسبة التوالي. يمكن الإشارة إلى انزيم التجريبية وتركيزات الركيزة.
    1. في التجربة M1، وتعيين اثنين على الأقل الإضافات (5-30 ميكرولتر) من الركيزة للتحقق من التكاثر. ضبط الوقت تباعد بين كل حقنة (على سبيل المثال 1،000 ثانية) كبيرة بما يكفي لضمان أن عوائد إشارة الحرارة إلى خط الأساس قبل إضافة المقبل.
    2. في التجربة M2، مجموعة متعددة (على سبيل المثال 15 × 5-10 ميكرولتر) عن طريق الحقن. تعيين الفاصل الزمني بين الحقن (مثل 180 ثانية) مما يتيح للنظام لياليtabilize والطاقة الحرارية إلى خط أساس جديد بعد كل حقنة.
      ملاحظة: الساعة التباعد بين الحقن في التجربة M2 يجب أن تكون قصيرة بما يكفي لتجنب تحويل كمية كبيرة من الركيزة، والسماح للقياسات التي يتعين القيام بها في ظل ظروف مستقرة.
    3. في التجربة M2، استخدام كميات صغيرة (مثل 2 ميكرولتر) لالحقنة الأولى، التي يتم تجاهلها خلال تحليل بيانات لاحقة القيمة المقابلة. في الواقع، فإنه غالبا ما يعرض القطع الأثرية بسبب نشر الركيزة الأولي من خلال طرف الحقنة، وعن وجود فقاعات الهواء المحتبسة في إبرة حقنة.
    4. تعيين قوة الإشارة، ومستوى التقريبية التي سيتم وضع خط الأساس قبل رد الفعل يبدأ بقيمة 20،. ثم تحديد انزيم التجريبية وتركيزات الركيزة واختار اسما للتجربة.
    5. تحديد درجة حرارة التجريبية، وعادة عند 25 درجة مئوية. يسمح ITC درجات الحرارة بين العمل 2 ° C و 80 درجة مئوية. التجربة هي جاهزة للتشغيل. اضغط على زر "ابدأ" لبدء التجربة.
  10. بمجرد الانتهاء من التجربة، وتنظيف الخلية العينة والمحاقن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  11. تكرار تجربة واحدة على الأقل أو مرتين أكثر للتحقق من استنساخ البيانات.

3. تحليل البيانات

  1. من برنامج تحليل، انقر على "قراءة البيانات" الزر، وانتقل إلى المجلد حيث يقع ملف ITC التجربة M2 يؤدونها. انقر على السهم لأسفل التمرير من "ملفات من نوع" وحدد "فحص انزيم (ذلك؟)". في وقت لاحق، انقر فوق وفتح ملف ITC التجربة M2.
  2. الحصول على ΔH من ردود الأفعال من دمج منحنى التجربة M1 وفقا للمعادلة 5.
    "العرض =" 126 "/> (5)
    1. انقر على زر "قراءة البيانات"، وحدد الملف. ITC التجربة M1 أداؤها. استخدام المنشأ، تقسيم التتبع في أجزاء مختلفة تحتوي على ذروة واحدة في كل وحفظ كل ذروة كملف OPJ. فتح الملف الموافق الذروة الأولى، الناجمة عن انحراف خط الأساس في حراري من حقن M1 تجربة واحدة، ودمج ذلك وتقسيم قيمة المنطقة التي تم الحصول عليها، وأعرب في μcal، من خلال تركيز الركيزة النهائية في الخلية العينة، التي أعرب عنها في ميكرومتر، وحجم الخلية وأعرب في لتر، وتحديد، وفقا للمعادلة 5، وΔH للتفاعل.
    2. كرر نفس الإجراء الذروة الثانية من التجربة M1 والحصول على متوسط ​​قيمة للقياسات ΔH اثنين.
  3. تحديد DQ / دينارا من التجربة M2 قياس الفارق بين خط الأساس الأصلي والأساس الجديدة التالية كل حقنة. تحويل البريدالبيانات xperimental إلى معدلات التفاعل وفقا للمعادلة 4، وذلك باستخدام قيمة المحتوى الحراري التي تم الحصول عليها في التجربة M1 وتناسب البيانات إلى المعادلة ميكايليس-منتن.
    1. من برنامج تحليل، انقر على زر "قراءة البيانات"، وحدد الملف. ITC التجربة M2 يؤدونها. انقر على السهم لأسفل التمرير من "ملفات من نوع" وحدد "فحص انزيم (ذلك؟)".
    2. يفتح مربع الحوار فحص انزيم، مما يتيح اختيار واحدة من أربعة نماذج. حدد "الأسلوب 2 - الركيزة فقط" من النافذة.
    3. في إطار ΔH، تشير قيمة ΔH حصلت عليه في الخطوة 4.2.
    4. انقر على زر "تركيز" للتحقق من قيم تركيز لاستخدامها في الإجراء المناسب. انقر على "متوسط ​​الوقت (P)" الزر. يفتح مربع الحوار وإعطاء الفرصة لتغيير أو قبول القيمة الافتراضية. تمثل هذه القيمة الوقت قبل كل حقنأيون التي المتوسطات أداة إشارة السلطة لتحديد مستوى الطاقة في كل تركيز الركيزة. انقر فوق موافق لتأكيد القيمة الافتراضية.
    5. انقر فوق الزر "Y محور صفر". المؤشر يتحول إلى الشعر عبر السماح لمضاعفة فوق النقطة، لوضع في ص = 0. انقر مرتين فقط قبل نقطة الحقن الأولى.
    6. انقر على زر حساب قيم. يتم رسم مقابل معدل تركيز الركيزة، ويمكن حسابه بقسمة الركيزة أضاف خلال المعايرة لحجم الخلية العينة (مع الأخذ في الاعتبار الآثار التخفيف). هذه العملية تعطي نموذجية مؤامرة ميكايليس-منتن التي يمكن تركيبها للحصول على K M وك القط.
    7. إذا كان ينبغي حذف بعض النقاط، حدد زر "اقتطاع البيانات". نقل علامات البيانات لاستبعاد نقاط البيانات السيئة وانقر مرتين على واحدة من علامات أو دخول الصحافة.
    8. استخدام وظيفة "صالح لنموذج" لتناسب المنحنى والحصول على الثوابت الحركية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

اليورياز (EC 3.5.1.5؛ اليوريا amidohydrolase) هو انزيم multisubunit المحتوية على النيكل وجدت في archea والبكتيريا وحقيقيات النوى وحيدة الخلية والنباتات. أعمال هذا البروتين في الخطوة الأخيرة من العضوية تمعدن النتروجين، تحفيز التحلل من اليوريا إلى الأمونيا وكاربامات، والتي تتحلل تلقائيا إلى إعطاء جزيء الثاني من الأمونيا وبيكربونات (المعادلة 6) 12.

(6)

يسبب هذا التفاعل زيادة عامة من درجة الحموضة للبيئة، والتي هي المسؤولة عن الآثار السلبية على الصحة البشرية والزراعة 13. في النباتات، والدور الأساسي للاليورياز هو إعادة تدوير النيتروجين من العناصر الغذائية المشتقة أرجيناز اليوريا 14. ureases النبات عموما هومو hexamers 6 مع كل الوحيدات يحتوي موقع نشط مع اثنين من ني 2 + أيونات 15. فيما بينها،وقد الخنجري Canavalia (جاك الفول) اليورياز (JBU) أول بروتين أن تبلورت في عام 1926 16. منذ ذلك الحين، وتتميز العديد من الدراسات على نطاق واسع النشاط الأنزيمي من الهيكلية وureases من عدة مصادر 13، 17. وبالتالي، تم اختيار النشاط حال اليوريا من JBU كرد فعل ممثل لإثبات انطباق ITC في تحديد كميا الحفز الأنزيمي. وقد تم قياس قيمة ΔH = -10.5 كيلو كالوري / مول في تجربة M1 (الشكل 2A) من خلال دمج الطاقة الحرارية الناتجة عن طريق حقن اليوريا الركيزة في حل اليورياز والسماح للرد فعل على المضي قدما حتى النهاية. تم تحويل الطاقة الحرارية المسجلة في تجربة M2 (الشكل 2B) لمعدل التفاعل باستخدام المعادلة 4 (الشكل 2C). نوبة من البيانات التي تم الحصول عليها للمعادلة ميكايليس-منتن توفير معلمات الحركية للJBU في20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7 كما ك القط = 30،200 ثانية -1 و K = M 3.45 ملم، بالاتفاق مع ذكرت سابقا البيانات 18 و 19.

الرقم 2
الشكل 2. تم شراء اليوريا التحلل بواسطة اليورياز التي يحددها المركز. JBU (نوع C3) كما انزيم مجفف بالتجميد (النشاط الاسمي 1،538 U / ملغ) والمخففة مع 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7 إلى تركيز النهائي. تم حساب تركيز الانزيم في خليط التفاعل بمقارنة النشاط العزم من المنتج الذي تم شراؤه لنشاط انزيم النقي، تشير التقارير إلى أن 6،200 U / ملغ من انزيم النقي 20، والكتلة المولية من 545 كيلو دالتون، المقابلة ل البروتين وطي hexameric. (أ) الطاقة الحرارية لوحظ في التجربة M1، أجريت في 25 درجة مئوية مع 2 × 5 ميكرولتر injecستعقد من 20 ملي اليوريا (في حقن حقنة) في 1 نانومتر JBU (في الخلية العينة). تم تطبيق تباعد من 750 ثانية بين حقن للسماح الأساس تعود إلى القيمة الأولية. يتم حساب المحتوى الحراري للتفاعل من إدماج كل الذروة وبلغ متوسط ​​القيمتين، وفقا للمعادلة 5. وذكرت وقيمة في النص. (ب) الطاقة الحرارية لوحظ في التجربة M2، التي حصلت عليها المعايرة 400 ملي اليوريا (20 × 5 حقن ميكرولتر) في 15 من مساء JBU. تم تطبيق تباعد من 180 ثانية بين الحقن، من أجل السماح للنظام للوصول والحفاظ على مستوى الدولة ثابتة. يتم الحصول DQ / دينارا بتركيزات مختلفة مثل الركيزة النزوح من خط الأساس بعد كل إضافة. يظهر حرارة التخفيف كتجربة فارغة (الرمادي)، التي يؤديها المعايرة الركيزة في المخزن المؤقت وحده. (C) تم تحويل النزوح خط الأساس في الشكل 2B إلى معدل التفاعل باستخدامالمعادلة 4. تم إجراء مناسبا من البيانات التي تم الحصول عليها (مربعات معبأة) باستخدام المعادلة 2، ويتم تمثيل كخط ثابت. وذكرت وقيمة K M ك القط والحصول عليها من يصلح في النص.

مجموع تغير الحرارة تقاس في التجربة M1 يمثل مجموع كل الأحداث التي تحدث أثناء التفاعل قيد التحليل، ويعتمد على المحتوى الحراري المولي من جميع العمليات المعنية، بما في ذلك، عند الاقتضاء، وإطلاق سراح بروتون أو امتصاص من المخزن المؤقت. في العملية الشاملة التي تستحوذ على رد فعل النظام البروتونات في حل مخزنة، المخزن المؤقت يطلق البروتونات، وتنتج حرارة إضافية داخل الخلية التفاعل. وبالتالي، فإن قياس ΔH هو واضح (ΔH التطبيق)، ويتضمن ΔH لا يتجزأ من رد فعل (ΔH الباحث)، فضلا عن المحتوى الحراري التأين المخزن المؤقت (ΔH أيون)، والثاني) في عدد من التبادل، وفقا المعادلة 7 البروتونات (ن) جي:

(7)

باستخدام هذه المعادلة، في التجارب M1، يمكننا تحديد ن وΔH الباحث عن طريق أداء نفس التجربة في مخازن مع المحتوى الحراري التأين المختلفة، والتآمر التطبيق ΔH تقاس بوصفها وظيفة من ΔH أيون محددة لالعازلة. من الانحدار الخطي الناتج، ن مشتق من منحدر: منحدر سلبي يعكس البروتونات التي حصل عليها المخزن المؤقت، في حين يمثل انحدار إيجابي البروتونات صدر من المخزن المؤقت؛ مشتق ΔH كثافة من اعتراض على المحور الصادي.

كما لوحظ في المعادلة 6، ونتائج تفاعل اليوريا المائي الكلي في اكتساب البروتون H + من المخزن المؤقت. وفقا لذلك، وديمكتوب أعلاه، فإن حرارة التفاعل يتضمن مساهمة من العازلة نزع بروتون. من أجل حساب ΔH لا يتجزأ من رد فعل التحلل، وأجريت ثلاث تجارب M1 في مخازن مختلفة (HEPES، TrisHCl والفوسفات)، تتميز بثلاثة أيون ΔH مختلفة. ΔH كثافة ويحسب عدد بروتون صدر من المخزن المؤقت، من اعتراض والمنحدر من تناسب خطية من البيانات التجريبية (الشكل 3) وفقا للمعادلة 7، كانت -14.7 كيلو كالوري / مول و 0.98 على التوالي، في اتفاق كامل مع بيانات أبلغ عنها سابقا لنفس رد الفعل يحفزه هيليكوباكتر بيلوري اليورياز 7. على حد علمنا، لم ترد تقارير عن البيانات الحرارية لJBU، حتى الآن.

الرقم 3
ΔH كثافة من رد فعل اليورياز. تم تحديد قيم ΔH التطبيق في مخازن مختلفة (مربعات معبأة) عن طريق إجراء التجارب M1 في 20 ملي HEPES (ΔH = 4.88 أيون كيلو كالوري / مول)، و 20 ملي TrisHCl (ΔH = أيون 11.34 كيلو كالوري / مول)، و 20 ملي فوسفات (ΔH = 0.86 أيون كيلو كالوري / مول) 21. تبادل تحليل الانحدار الخطي (خط الصلبة) من البيانات يسمح تحديد ΔH كثافة من رد الفعل، فضلا عن عدد البروتونات أثناء دوران اليوريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أهمية المركز لدراسة النشاط الأنزيمي فيما يتعلق بأساليب القائمة

بالإضافة إلى التطبيقات الكلاسيكية لدراسة التوازنات ملزمة، متساوي الكالوري المعايرة يوفر طريقة موثوقة وسريعة لتوصيف التفاعلات الإنزيمية في حل باستخدام حرارة التفاعل باعتباره التحقيق، دون الحاجة إلى تعديل نظام أو وضع العلامات. المعلمات الحركية ك القط وعادة ما يتم الحصول على K M من خلال مجموعة من التجارب المرة بالطبع، التي يتم رصدها تشكيل المنتج (أو الاستهلاك الركيزة) في فحوصات مستمرة أو متقطعة. عادة، يتم قياس تركيز الركيزة أو منتج عن طريق امتصاص الضوء أو مضان في موجات مميزة. ومع ذلك، فإن معظم ركائز و / أو المنتجات ليست نشطة الطيفي، وبالتالي يجب أن تدرج حامل اللون أو fluorophore لمتابعة رد فعل. بدلا من ذلك، إلى جانب المقايسات، معالمنتج من الحفز كونها الركيزة للتفاعل آخر مع المنتج قابلة للقياس، يمكن استخدامها. هذه الأساليب، ومع ذلك، وإدخال متغيرات إضافية تقلل من دقة تحديد القيم من K M وك القط. بالإضافة إلى ذلك، توصيف انزيم تثبيط من قبل بروابط صغيرة باستخدام الطرق التقليدية يمكن أن يكون معقدا من قبل الامتصاصية أو مضان من يجند الصغيرة نفسها، والتي قد تغير من الاعتماد على الفحص الطيفي. طرق بديلة تنطوي على تقنيات تدفق توقف، حيث يتم كميا كمية من المنتج باستخدام مطياف الكتلة أو اللوني. هذه التقنيات هي دقيقة جدا وموثوق بها، ولكن هي مضيعة للوقت ومكلفة للتحليل الروتيني. يتبع التحقيق في التجارب ITC، وهذا هو الحرارة المنطلقة أو الممتصة، هو خاصية جوهرية من التفاعلات الكيميائية كلها تقريبا. لذا ITC لا يتطلب أي تعديل أو وسم نظام قيد التحليل. علاوة على ذلك، رأسلوبه واضح ومباشر وسريع، يتطلب كمية صغيرة من المواد ويمكن القيام بها في حل 22 و 23.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول والتعديلات الممكنة

يتم إجراء تحليل رد فعل عموما في اثنين من تجارب مختلفة، والتي توفر مجموع المحتوى الحراري المولي للتفاعل والتغيير الحرارة مع مرور الوقت بتركيزات الركيزة مختلفة. من أجل الحصول على بيانات ذات نوعية جيدة، يجب أن يخطط لها التجربة بالتفصيل في بداية التحقيق. البروتين وتركيزات الركيزة يجب أن تحدد بعناية، وقيمتها الصحيحة أمر ضروري لحساب المعلمات يمكن الاعتماد عليها في تحليل البيانات. يجب أن يكون تكوين العازلة ودرجة الحموضة كل من الانزيم والحلول الركيزة متطابقة، من أجل تقليل الحرارة من خلال خلط بالإضافة الركيزة. ويكفل هذا عموما عن طريق إجراء غسيل الكلى أو الاستبعاد حجمسيون خطوة اللوني على حل انزيم قبل تشغيل التجربة، واستخدام عازلة يبلغ حجمه من العمود إلى حل الركيزة. يجب إجراء تجربة التحكم مع حلول متطابقة من الركيزة حقنها في المخزن المؤقت رد الفعل في حالة عدم وجود الانزيم، من أجل طرح الحرارة التخفيف أو للتحقق من أنه لا يكاد يذكر.

يتم تنفيذ تحليل البيانات عموما مع البرنامج المنشأ لمركز التجارة الدولية المقدمة من قبل الشركة المصنعة. برنامج بديل من خيار لتحليل البيانات ويمكن استخدام، إذا لزم الأمر.

المشاكل والقيود المفروضة على تقنية

يتم الحصول على نسبة جيدة إشارة إلى الضوضاء فقط إذا العائدات رد فعل بمعدل يسمح النظام لإنتاج ما يكفي من الحرارة في الخلية ITC للتغلب على حد الكشف مفيدة. وعادة ما يتحقق هذا لأنظمة مع ك القط أعلى من 1 دقيقة -1. في هذه الحالة،البرنامج المنشأ لITC تلقائيا بحساب مؤامرة ميكايليس-منتن من البيانات الخام، واستخدام غير الخطية تحليل المربعات الصغرى الانحدار، فإنه يحسب ك القط والقيم K M. هذا التحليل لا تتحمل أية تثبيط المنتج كبيرة. وهذا الأخير هو مرئية عادة عندما حقن اللاحقة في التجربة M1 إنتاج القمم ذات أشكال مختلفة، وعلى وجه الخصوص، مع تتبع السلطة من الذروة الثانية يستغرق وقتا أطول للعودة إلى خط الأساس الأولي. في حالة حدوث تثبيط المنتج، وبرامج أخرى في الاختيار، وتنفيذها مع معادلات محددة الغرض، يجب استخدام.

نظرا لاختلاف جوهري في كل نظام الأنزيمية، والحرارة المختلفة التي تنتجها ردود فعل مختلفة، والتي لا يمكن قياسها كميا بداهة، تحديد شروط تشغيل الأمثل (أي انزيم وتركيزات الركيزة، عدد وحجم الحقن، وتباعد الوقت، الخ) ل نظام محدد ص أحيانا equire القليلة المعايرة استكشافية.

خلال التحليل، ويجب أن تطبق الحرص على اختيار الظروف التجريبية وفقا لنظام قيد التحليل. على سبيل المثال، يمنع الفوسفات اليوريا التحلل بواسطة اليورياز، وبالتالي، وأداء التجربة في العازلة الفوسفات يقلل من المعدل الإجمالي للتفاعل الأنزيمي 24، 25.

تطبيقات

مرة واحدة وقد تم تحديد حركية التفاعل الأنزيمي، فإن رد الفعل يمكن أن يتكرر في وجود أنواع وتركيزات من مثبطات الإنزيم في الخلية عينة مختلفة، من أجل قياس، وذلك باستخدام المعادلة العامة تثبيط 8 26، تنافسية (K جيم) و غير قادرة على المنافسة (K UIC) تثبيط الثوابت، مما يسمح لنا أن نميز، من بين أنواع مختلفة من كبت.

iles/ftp_upload/51487/51487eq8.jpg "العرض =" 284 "/> (8)

في الختام، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم كوسيلة سريعة واقتصادية لاختبار عدد كبير من مثبطات الإنزيم للتطبيقات الصيدلانية والصناعية، مثل فحص المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

واعترفت شركة الأسمدة منتجات متميزة (SFP) لتوفير الأموال اللازمة لهذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma H3375 dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base Sigma T1503 dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate Riedel-de-Haen 4270 dissolving in water
Sodium phosphate dibasic Riedel-de-Haen 30427 dissolving in water
Urea Sigma U4128 dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3) Sigma U0251 dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) SYS13901 instrument 
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 MicroCal (GE Healthcare) data acquisition software supplied with the instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
  2. Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
  3. Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. 3649-3651 (2007).
  4. Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
  5. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. (2011).
  6. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  7. Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
  8. Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
  9. Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
  10. Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
  11. Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. Cambridge University Press. 312-356 (2000).
  12. Ciurli, S. Nickel and its surprising impact in nature. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).
  13. Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
  14. Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
  15. Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
  16. Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
  17. Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
  18. Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
  19. Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
  20. Hausinger, R. P., Karplus, P. A. Handbook of Metalloproteins. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. John Wiley & Sons. 867-879 (2001).
  21. Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
  22. Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
  23. Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
  24. Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
  25. Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
  26. Segel, I. H. Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. Wiley, NY. (1993).
الساخنة البيولوجية الحفز: متساوي الكالوري المعايرة لوصف التفاعلات الإنزيمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions. J. Vis. Exp. (86), e51487, doi:10.3791/51487 (2014).More

Mazzei, L., Ciurli, S., Zambelli, B. Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions. J. Vis. Exp. (86), e51487, doi:10.3791/51487 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter