हॉट जैविक कटैलिसीस: इज़ोटेर्माल अनुमापन Calorimetry एंजाइमी प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ

Summary

इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति उपायों गर्मी प्रवाह जारी या रासायनिक प्रतिक्रियाओं में लीन. इस विधि एंजाइम कटैलिसीस यों इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पत्र में, वाद्य स्थापना के लिए प्रोटोकॉल, प्रयोग चल रहे हैं, और डेटा विश्लेषण आम तौर पर वर्णित है, और जैक सेम urease द्वारा एंजाइमी यूरिया हाइड्रोलिसिस के लक्षण वर्णन करने के लिए आवेदन किया.

Abstract

इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (आईटीसी) गर्मी लगभग हर रासायनिक प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए एक आंतरिक जांच के रूप में उपयोग कर, एक रासायनिक प्रतिक्रिया के दौरान जारी या अवशोषित उपाय है कि एक अच्छी तरह से वर्णित तकनीक है. आजकल, इस तकनीक को बड़े पैमाने पर biomolecular बंधन संतुलनों के thermodynamic मानकों का निर्धारण करने के लिए लागू किया जाता है. इसके अलावा, आईटीसी सीधे इस आवेदन अभी underexploited है, भले ही एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स और thermodynamic मानकों (कश्मीर _{बिल्ली,} कश्मीर _{मीटर,} ΔH) को मापने के लिए सक्षम होना करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. गर्मी परिवर्तन अनायास एंजाइमी कटैलिसीस के दौरान होने के रूप में, आईटीसी विश्लेषण के तहत प्रणाली के किसी भी संशोधन या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है और समाधान में प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, विधि सामग्री की छोटी राशि की जरूरत है. इन गुणों आईटीसी जैसे कई अनुप्रयोग, उदाहरण के लिए, दवाओं की खोज में एंजाइम कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य शक्तिशाली और अद्वितीय उपकरण बनाते हैं.

<p cइस काम कैनेटीक्स और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की ऊष्मा यों के लिए एक प्रयोगात्मक आईटीसी आधारित विधि में लड़की = "jove_content"> अच्छी तरह से वर्णित है. इस विधि कश्मीर _{बिल्ली} का निर्धारण करने के लिए लागू किया जाता है Canavalia ensiformis (जैक सेम) urease द्वारा यूरिया के enzymatic hydrolysis की कश्मीर _{मीटर.} प्रतिक्रिया की आंतरिक दाढ़ तापीय धारिता (ΔH _INT) की गणना की जाती है. इस प्रकार प्राप्त मूल्यों कार्यप्रणाली की विश्वसनीयता का प्रदर्शन, साहित्य की रिपोर्ट में पिछले डेटा के साथ संगत कर रहे हैं.

Introduction

जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का मात्रात्मक निर्धारण के जीवन के आधार पर जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. उष्मामिति मात्रात्मक समाधान में लगभग हर रासायनिक प्रतिक्रिया चिह्नित करने के लिए एक लेबल से मुक्त कार्यप्रणाली प्रदान करता है. इस तकनीक को गर्मी जारी या समय के साथ अवशोषित उपाय है, और इसलिए एक सार्वभौमिक पहचान प्रणाली और प्रतिक्रिया अणुओं (यानी बाध्यकारी ऊष्मा), के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रिया की दर (यानी कैनेटीक्स) को मापने के लिए की राशि यों के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक पद्धति है. विशेष रूप से, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (आईटीसी) प्रोटीन ligand, प्रोटीन, प्रोटीन, प्रोटीन, धातु आयनों और प्रोटीन डीएनए बातचीत ^1-6 से जुड़े, biomolecular संतुलनों की ऊष्मा को चिह्नित करने के लिए पसंद की विधि के रूप में अपनाया गया है. इस आवेदन की क्षमता अब भी है, हालांकि इसके अलावा, गतिज जानकारी प्रदान करने के लिए आईटीसी की क्षमता, यह एंजाइम कटैलिसीस को मापने के लिए एक बहुत शक्तिशाली सिस्टम बनाता है^7-9 को कम करके आंका.

Michaelis निरंतर (कश्मीर _{मीटर)} और उत्प्रेरक दर लगातार (कश्मीर _{बिल्ली):} यह दो गतिज मापदंडों पर निर्भर करता है, प्रतिक्रिया की दर और सब्सट्रेट एकाग्रता के बीच एक संबंध प्रदान करता है के रूप में Michaelis-Menten समीकरण ^10, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का एक मात्रात्मक विवरण है . कश्मीर _{बिल्ली} / कश्मीर _मीटर अनुपात एक एंजाइम उत्प्रेरक दक्षता के रूप में जाना जाता है. अभ्यास में, एक विशेष प्रतिक्रिया के लिए कश्मीर _मीटर के दृढ़ संकल्प और कश्मीर _{बिल्ली} कटैलिसीस का पूरा विवरण प्रदान करता है.

एक ठेठ enzymatic प्रतिक्रिया (चित्रा 1) में, एक सब्सट्रेट (एस) बाद में संक्रमण राज्य में सक्रिय है जो एंजाइम सब्सट्रेट (ते) जटिल बनाने एंजाइम (ई), (ते *) के साथ सूचना का आदान प्रदान. बाद के अंत में विखंडित कि एंजाइम उत्पाद (ईपी) परिसर में बदल जाती है. ये कदमएस निम्नलिखित प्रतिक्रिया से वर्णित हैं.

(1)

कश्मीर ₁ ते जटिल, कश्मीर _-1 के गठन के लिए दर स्थिर है जहां कश्मीर _{बिल्ली} उत्प्रेरक दर लगातार या कारोबार संख्या है, जबकि ते परिसर की हदबंदी के लिए दर स्थिर है.

: Michaelis-Menten समीकरण ¹⁰ के अनुसार, प्रतिक्रिया की दर के रूप में गणना की जा सकती

(2)

जिसमें कश्मीर _मीटर = (कश्मीर _-1 + K _{बिल्ली)} / कश्मीर ₁ और कश्मीर _{बिल्ली} = वी _{मैक्स} / [ई], वी _{मैक्स} सभी एंजाइम सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य है जब तक पहुँच अधिक से अधिक वेग होने के साथ.

इज़ोटेर्माल अनुमापन कैलोरीमीटर यूरिया के enzymatic हाइड्रोलिसिस चिह्नित करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल साधन है. इस उपकरण दो गढ़ा के आकार की कोशिकाओं (चित्रा 1) से युक्त एक adiabatic ढाल से बना है. इन संकीर्ण पहुँच ट्यूबों के साथ बाहर से जुड़े हैं. संदर्भ सेल आम तौर पर पानी के साथ या विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विलायक से भर जाता है, जबकि नमूना सेल (सी ए 1.4 मिलीग्राम), एंजाइम समाधान के साथ भरी हुई है. आमतौर पर सब्सट्रेट समाधान के सीए. 0.3 मिलीलीटर युक्त एक लंबी सुई और संलग्न एक हलचल चप्पू के साथ एक घूर्णन सिरिंज, नमूना सेल पर मुहिम शुरू की है. एक शीतलक डिवाइस एक "सेल प्रतिक्रिया नेटवर्क" का उपयोग कर, नमूना और संदर्भ सेल और तापमान के बीच के अंतर की गणना करता है, यह गर्मी जोड़ने या घटाकर शून्य पर इस अंतर को बनाए रखता है. प्रयोग के दौरान, सब्सट्रेट एक निरंतर चुना तापमान पर एंजाइम समाधान में इंजेक्ट किया जाता है. जब एनzymatic प्रतिक्रिया जारी या अवशोषित गर्मी की राशि उत्पाद अणुओं में परिवर्तित कर रहे हैं कि सब्सट्रेट अणुओं की संख्या के अनुपात है, जगह लेता है. इसके अलावा, गर्मी प्रवाह की दर सीधे प्रतिक्रिया की दर से संबंधित है. मापा डेटा, प्रारंभिक आधारभूत से गर्मी का पता लगाने की एक विचलन (चित्रा 1) के रूप में प्रदर्शित होने, (μcal / सेक) नमूना सेल में होने वाली गर्मी प्रवाह के लिए आनुपातिक है जो नमूना सेल, करने के लिए साधन के द्वारा आपूर्ति की ताप विद्युत का प्रतिनिधित्व समय के साथ.

चित्रा 1. एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के इज़ोटेर्माल अनुमापन कैलोरीमीटर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (नमूना सेल में) वहाँ का एक परिवर्तन में परिणाम एंजाइम समाधान में (इंजेक्शन सिरिंज में) सब्सट्रेट का अनुमापन पर होने वाली एक enzymatic प्रतिक्रियानमूना सेल और संदर्भ सेल लगातार तापमान के बीच का अंतर रखने की जरूरत कैलोरीमीटर, द्वारा जारी मॉल शक्ति. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

कुल मिलाकर, गर्मी परिवर्तन (क्यू) प्रतिक्रिया (ΔH) और बदले में कुल मात्रा टाइम्स द्वारा एकाग्रता दिया जाता है जो (एन), उत्पन्न उत्पाद के moles की संख्या की दाढ़ तापीय धारिता के लिए आनुपातिक है:

(3)

उत्पाद गठन समय के साथ प्रतिक्रिया की दर से मेल खाती है (डी पी / डीटी),, इस तरह के संबंध के माध्यम से एक ही समय (डीक्यू / डीटी) से अधिक उत्पन्न गर्मी की राशि से संबंधित हो सकते हैं:

(4)

इस समीकरण के अनुसार, एक Michaelis-Menten प्राप्त करने के क्रम में यह) कुल दाढ़ तापीय धारिता ΔH मैं मापने के लिए आवश्यक है साजिश, और विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता में द्वितीय) गर्मी प्रवाह dQ / डीटी. आमतौर पर, यह दो अलग अलग प्रयोगों में किया जाता है: पहला प्रयोग (विधि 1, एम 1) में, सब्सट्रेट एंजाइम समाधान में इंजेक्ट किया जाता है और पूरा सब्सट्रेट रूपांतरण के लिए गर्मी मापा जाता है; दूसरे प्रयोग (विधि 2, एम 2) में, सब्सट्रेट के एकाधिक इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं और गर्मी उत्पादन की दर अलग सब्सट्रेट सांद्रता में मापा जाता है. डेटा के इन दो सेट गतिज मापदंडों कश्मीर _मीटर और कश्मीर _{बिल्ली} प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं.

वर्तमान अनुच्छेद में, आईटीसी का उपयोग कर प्रदर्शन एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के लिए गतिज मापदंडों का निर्धारण करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल में वर्णित है. हम Canavalia ensiformis यूरिया द्वारा यूरिया hydrolysis के लिए विधि लागूएसई, एक संदर्भ प्रणाली के रूप में. इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त परिणामों और साहित्य में डेटा की रिपोर्ट के बीच अच्छे समझौते के इस दृष्टिकोण की विश्वसनीयता को दर्शाता है.

Protocol

1. तैयारी नमूने एंजाइम समाधान के 2 मिलीलीटर और प्रत्येक प्रयोगात्मक चलाने के लिए सब्सट्रेट समाधान के 0.5 मिलीलीटर तैयार करें. सब्सट्रेट अलावा दौरान कमजोर पड़ने और मिश्रण की गर्मी को कम करने के लिए स…

Representative Results

Urease (ईसी 3.5.1.5, यूरिया amidohydrolase) archea, बैक्टीरिया, कोशिकीय eukaryotes और पौधों में पाया जाने वाला एक multisubunit निकल युक्त एंजाइम है. अनायास अमोनिया और बाइकार्बोनेट (समीकरण 6) 12 के एक दूसरे अणु देने के लिए मिटता जो अमो?…

Discussion

मौजूदा तरीकों के संबंध में enzymatic गतिविधि का अध्ययन करने के लिए आईटीसी का महत्व

बंधन संतुलनों अध्ययन करने के लिए अपने शास्त्रीय अनुप्रयोगों के अलावा, इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति व्?…

Materials

HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument