Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche
Summary
Isotermico misure titolazione calorimetria flusso di calore rilasciato o assorbito nelle reazioni chimiche. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare enzima-catalisi. In questo documento, il protocollo per la configurazione strumentale, esperimento esecuzione e analisi dei dati è generalmente descritto, e applicato alla caratterizzazione di idrolisi enzimatica dell'urea da jack bean ureasi.
Abstract
Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica ben descritto che misura il calore rilasciato o assorbito durante una reazione chimica, usandolo come una sonda intrinseca per caratterizzare praticamente ogni processo chimico. Oggi, questa tecnica è ampiamente applicata per determinare i parametri termodinamici di equilibri vincolanti biomolecolari. Inoltre, ITC ha dimostrato di essere in grado di misurare direttamente cinetiche e termodinamiche (cat k, K M, AH) di reazioni enzimatiche, anche se questa applicazione è ancora poco sfruttato. Come sbalzi termici avvengono spontaneamente durante la catalisi enzimatica, ITC non richiede alcuna modifica o etichettatura del sistema sotto analisi e può essere eseguita in soluzione. Inoltre, il metodo deve piccola quantità di materiale. Queste caratteristiche rendono ITC uno strumento prezioso, potente e unica di studiare cinetica enzimatica in diverse applicazioni, come, ad esempio, la scoperta della droga.
<p class = "jove_content"> In questo lavoro un metodo basato su ITC sperimentale per quantificare la cinetica e termodinamica delle reazioni enzimatiche è accuratamente descritta. Questo metodo viene applicato per determinare k gatto e K M del idrolisi enzimatica dell'urea da Canavalia ensiformis (fagiolo jack) ureasi. Viene eseguito il calcolo di entalpia molare intrinseca (AH int) della reazione. I valori così ottenuti sono coerenti con i dati precedenti riportati in letteratura, dimostrando l'affidabilità del metodo.Introduction
Determinazione quantitativa di reazioni biochimiche fornisce approfondimenti sui processi biologici alla base della vita. Calorimetria offre una metodologia libero-label per caratterizzare quantitativamente praticamente ogni reazione chimica in soluzione. Questa tecnica misura il calore rilasciato o assorbito nel tempo, ed è quindi un sistema di rilevamento universale e una metodologia molto comodo per quantificare la quantità di molecole reagenti (cioè termodinamica vincolanti), nonché per misurare la velocità di reazione (cioè cinetica). In particolare, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stato adottato come metodo di scelta per caratterizzare la termodinamica di equilibri biomolecolari, coinvolgendo proteina-ligando, proteina-proteina, proteina-ioni metallici e le interazioni proteina-DNA 1-6. Inoltre, la capacità di ITC di fornire informazioni cinetiche rende un sistema molto potente per misurare catalisi enzimatica, anche se il potenziale di questa applicazione è ancorasottovalutato 7-9.
L'equazione di Michaelis-Menten 10 è una descrizione quantitativa di reazioni enzimatiche, in quanto fornisce una relazione tra la velocità di reazione e la concentrazione del substrato, a seconda di due parametri cinetici: la costante di Michaelis (K M) e la costante di velocità catalitica (k cat) . Il gatto k / rapporto K M viene definito come l'efficienza catalitica di un enzima. In pratica, la determinazione di K M e K gatto per una reazione specifica fornisce una descrizione completa della catalisi.
In una tipica reazione enzimatica (Figura 1), un substrato (S) interagisce con l'enzima (E) che formano il complesso enzima-substrato (ES), che viene successivamente attivato nello stato di transizione (ES *). Quest'ultimo viene convertito nel complesso enzima-prodotto (EP) che alla fine si dissocia. Questi steps sono descritti dalla seguente reazione.
(1)
dove k 1 è la costante di velocità per la formazione del complesso ES, k -1 è la costante di velocità per la dissociazione del complesso ES, mentre k gatto è la costante di velocità catalitica o numero di turnover.
Secondo l'equazione di Michaelis-Menten 10, la velocità di reazione può essere calcolato come:
(2)
in cui M = K (k -1 + k cat) / k 1 ek cat = v max / [E], con v max essendo la velocità massima raggiunta quando tutti enzima è legato al substrato.
La titolazione calorimetro isotermico è lo strumento utilizzato in questo studio per caratterizzare l'idrolisi enzimatica dell'urea. Questo strumento è costituito da uno scudo adiabatico contenente due cellule a forma coniati (Figura 1). Questi sono collegati all'esterno con tubi accesso strette. La cella campione (ca. 1,4 ml) viene caricato con soluzione enzimatica, mentre la cella di riferimento è generalmente riempito con acqua o con il solvente utilizzato per l'analisi. Una siringa rotante con un lungo ago e una pagaia stir divisoria, generalmente comprendente ca. 0,3 ml di soluzione di substrato, è montato sulla cella campione. Un dispositivo termoelettrico misura la differenza di temperatura tra il campione e la cella di riferimento e, utilizzando una "rete di retroazione cella", mantiene questa differenza a zero aggiungendo o sottraendo calore. Durante l'esperimento, il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica a temperatura costante scelta. Quando l'enzymatic reazione ha luogo, la quantità di calore ceduto o assorbito è proporzionale al numero di molecole di substrato che vengono convertiti in molecole dei prodotti. Inoltre, il tasso di flusso di calore è direttamente correlata alla velocità di reazione. I dati misurati, che appare come una deviazione del tracciato calore dalla linea di base iniziale (Figura 1), rappresentano la potenza termica (μcal / sec) fornite dallo strumento alla cella campione, che è proporzionale al flusso di calore che si verificano nella cella campione nel tempo.
Figura 1. Rappresentazione schematica di titolazione isotermico calorimetro per studiare reazioni enzimatiche. Una reazione enzimatica si produce in conseguenza titolazione del substrato (prodotto nella siringa) nella soluzione enzimatica (nella cella campione) determina una variazione del therpotere mal rilasciato dal calorimetro, necessario per mantenere la differenza di temperatura tra la cella campione e la costante di cella di riferimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Nel complesso, la variazione di calore (Q) è proporzionale alla entalpia molare della reazione (AH) e il numero di moli di prodotto generato (n), che a sua volta è dato dai tempi totali di volume la concentrazione:
(3)
La formazione del prodotto nel tempo (dP / dt), che corrisponde alla velocità di reazione, può quindi essere correlato alla quantità di calore generato nello stesso tempo (dQ / dt) attraverso la relazione:
(4)
Secondo questa equazione, al fine di ottenere un Michaelis-Menten trama è necessario misurare i) il totale entalpia molare AH, e ii) il flusso di calore dQ / dt a differenti concentrazioni di substrato. Solitamente, questa viene eseguita in due diversi esperimenti: nel primo esperimento (metodo 1, M1), il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica e il calore per la conversione completa del substrato viene misurata; Nel secondo esperimento (metodo 2, M2), iniezioni multiple di substrato vengono eseguite e il tasso di produzione di calore viene misurato a differenti concentrazioni di substrato. Questi due insiemi di dati sono sufficienti per ricavare i parametri cinetici K M e K cat.
Nel presente articolo, un protocollo generale per determinare i parametri cinetici per le reazioni enzimatiche eseguite utilizzando ITC è descritto. Abbiamo applicato il metodo di urea all'idrolisi da Canavalia ensiformis urease, come un sistema di riferimento. Il buon accordo tra i risultati ottenuti con questo metodo e dei dati riportati in letteratura dimostra l'affidabilità di questo approccio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Significato della ITC per studiare l'attività enzimatica rispetto ai metodi esistenti
Oltre alle sue applicazioni classiche per studiare equilibri vincolanti, Calorimetria isotermica di titolazione fornisce un metodo affidabile e veloce per caratterizzare reazioni enzimatiche in soluzione utilizzando il calore di reazione come sonda, senza richiedere modifiche o etichettatura sistema. I parametri cinetici k gatto e K M sono solita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il Specialità fertilizzante Products Company (SFP) è riconosciuto per fornire i fondi necessari per questo studio.
Materials
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
References
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques. 37, 885-887 (2004).
- Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR. Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).
- Zambelli, B., et al. High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter. J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).
- Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research–survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
- Todd, M. J., Gomez, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity. Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).
- Bianconi, M. L. Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions. Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).
- Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).
- Michaelis, L., Menten, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).
- Walker, J., Wilson, K., Walker, J. . Principle and techniques of practical biochemistry. , 312-356 (2000).
- Ciurli, S., Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. . Nickel and its surprising impact in nature. 2, 241-278 (2007).
- Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis. Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).
- Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds. Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).
- Follmer, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).
- Sumner, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).
- Krajewska, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).
- Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. The burden borne by urease. J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).
- Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).
- Hausinger, R. P., Karplus, P. A., Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. . Handbook of Metalloproteins. , 867-879 (2001).
- Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).
- Baumann, M. J., et al. Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays. Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).
- Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).
- Harmon, K. M., Niemann, C. The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate. J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).
- Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).
- Segel, I. H. . Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. , (1993).
