Une méthode est décrite avec accompagnement visuel pour mener évolutives, des sélections à haut débit à partir de banques d'anticorps combinatoires synthétiques de phages contre des centaines d'antigènes simultanément. En utilisant cette approche parallèle, nous avons isolé des fragments d'anticorps qui présentent une affinité et une spécificité pour divers antigènes qui sont fonctionnelles dans des dosages immunologiques standard.
La demande pour les anticorps qui répondent aux besoins des deux applications de la recherche fondamentale et clinique est élevé et va augmenter considérablement dans l'avenir. Cependant, il est évident que les techniques traditionnelles monoclonaux ne sont pas seuls à cette entrée. Cela a conduit au développement de méthodes alternatives pour satisfaire la demande de haute qualité et de réactifs d'affinité renouvelables accessibles à tous les éléments du protéome. À cette fin, méthodes à haut débit pour la conduite des sélections de bibliothèques d'anticorps synthétiques phages ont été conçus pour des applications impliquant divers antigènes et optimisé pour un débit rapide et le succès. Ici, un protocole est décrit en détail qui illustre avec la sélection vidéo manifestation parallèle clones de Fab-phage à partir de bibliothèques de grande diversité contre des centaines de cibles à l'aide soit d'un gestionnaire de liquide 96 manuel de canal automatique ou système robotique. En utilisant ce protocole, un seul utilisateur peut générer des centaines d'antigènes,sélectionner des anticorps à eux en parallèle et valider contraignant dans les six à huit semaines anticorps. Surbrillance sont: i) un format de l'antigène viable, ii) l'antigène pré-sélection caractérisation, iii) les étapes critiques qui influencent la sélection de clones spécifiques et de haute affinité, et iv) les moyens de l'efficacité de la sélection de la surveillance et stade précoce anticorps clone caractérisation. Avec cette approche, nous avons obtenu des fragments d'anticorps synthétiques (FABS) à de nombreuses catégories de cibles, y compris les récepteurs à passage unique membranaires, hormones protéiques sécrétées et les protéines intracellulaires multi-domaines. Ces fragments sont facilement convertis à des anticorps pleine longueur et ont été validés à présenter une grande affinité et spécificité. En outre, il a été démontré pour être fonctionnels dans une variété de dosages immunologiques standard, y compris Western blot, ELISA, l'immunofluorescence cellulaire, des dosages d'immunoprécipitation et connexes. Cette méthodologie permettra d'accélérer la découverte d'anticorps et, finalement, de nous rapprocher de la réalisation de l'objectif of générer renouvelables, des anticorps de haute qualité à la protéome.
Avec le début de l'ère post-génomique, la disponibilité des réactifs de liaison de haute qualité pour caractériser et de moduler les protéines est essentiel pour ouvrir de nouvelles recherches et avenues thérapeutiques. Anticorps continuent d'être critique à la fois aux chercheurs universitaires et industriels que la recherche fondamentale et outils de diagnostic et thérapeutiques potentiels. Sans surprise, il ya eu une croissance impressionnante des entreprises de développement d'anticorps du contrat, dont la plupart se appuient sur des technologies classiques d'hybridomes pour générer des anticorps personnalisés. Néanmoins, la sélection in vitro en utilisant des bibliothèques d'anticorps phages devient une technologie alternative puissante qui peut offrir des avantages et des succès uniques où les technologies conventionnelles peuvent rencontrer des limitations 1, 2.
À la lumière de la demande considérable pour les anticorps de haute qualité comme outils de recherche, deux principaux défis pour générer des anticorps renouvelables sont 1) le débit de sélection et 2) l'antigène availability. Un certain nombre de groupes ont maintenant décrit dans les pipelines de sélection in vitro visant à augmenter le débit et le taux de l'identification d'anticorps. Ces descriptions en détail une variété d'approches viables qui incluent le choix soit sur toute la longueur cible 3,4, 5,6,7 ou des domaines structurellement liée, en utilisant soit 6,8 ou une plaque à base de 3,4 régimes antigène d'immobilisation sur la base de perles. En outre, l'adoption croissante des technologies de synthèse de gènes neuf a fait la production de l'antigène systématique, en particulier des domaines isolés, raisonnablement rentable et peut potentiellement atténuer la difficulté d'obtenir des quantités suffisantes de l'antigène purifié, pleine longueur. En utilisant les deux technologies en tandem, un pipeline autonome et la production de l'antigène évolutive et la sélection d'anticorps a été conçu qui permettrait l'isolement d'anticorps parallèle pour les grands ensembles de domaines antigène exprimé et faciliter le développement de réactifs pour characterizing classes entières de protéines structurellement ou fonctionnellement liés.
Vers cet objectif, un pipeline intégré que les couples dans l'identification in silico de domaines d'antigène exprimables, synthèse de gènes, expression bactérienne à haut débit des antigènes et des sélections d'anticorps de phages évolutives a été développé. Ce pipeline ne nécessite que l'infrastructure de base disponible pour la plupart des laboratoires de sciences de la vie (y compris les bibliothèques d'anticorps qui sont de plus en plus disponible via une licence ou un accord de transfert de matériel), mais est également prête à l'automatisation pour une utilisation à l'échelle industrielle. En utilisant ce protocole, il est possible de générer des centaines de domaines d'antigène étiqueté par affinité, et d'isoler des fragments d'anticorps habituellement hautement spécifiques à un grand nombre de ces antigènes.
La technologie de présentation de phage a montré la compatibilité démontrée avec une grande variété de formats de réactifs d'affinité recombinants, y compris les fragments Fab, scFv, Fv et des domaines autonomes et unnombre croissant de petites «cadres alternatifs» (protéines de répétition ankyrine conçus (DARPINS), fibronectine (Fn), domaines de LIPOCALINE et plus 10). Discussion est limité dans cet exemple à l'isolement de fragments d'anticorps Fab, même si on suppose ces procédés peuvent être adaptés à d'autres types de bibliothèques. En utilisant cette technologie, Fab ayant un faible nanomolaire affinité à petit, tagged domaines de protéines y compris des domaines de facteurs de transcription, des domaines SH2, de l'ARN des protéines de liaison et d'autres ont été sélectionnés avec succès, dont plusieurs se lient protéine de pleine longueur et sont fonctionnels dans des analyses immunologiques telles que l'immunofluorescence , immunoprécipitation et immunohistochimie. Fait important, les clones de liaison recombinantes sont entièrement renouvelables et peuvent être re-générés à partir de constructions d'expression via bactérienne offre de production accrue cohérence, la reproductibilité et la rentabilité, justifiant ainsi la charge de la validation de clone rigoureuse.
Dans cette protocol et vidéo qui l'accompagne, les méthodes de base pour la sélection d'anticorps à partir de banques de phages en utilisant les domaines d'antigènes immobilisés sont démontrés. Cette méthode particulière emploie domaines protéiques étiquetée GST immobilisées par adsorption passive dans des plaques de microtitration, bien que d'autres mots-clés 11,12,13 et les formats de sélection 13,14,2 ont également été utilisés avec succès. Considérations critiques pour la configuration et la conduite des sélections avec contrôle parallèle de paramètres de sélection visant à identifier et isoler anticorps monoclonaux spécifiquement enrichis pour la validation sont détaillées.
Lors de la conduite dans les sélections d'anticorps in vitro, les deux principaux déterminants de la réussite de sélection sont: 1) l'isolement des cibles antigéniques bien pliés de sélection sur et 2) la disponibilité d'une bibliothèque d'anticorps de la diversité fonctionnelle élevée. Dans de nombreux cas, la disponibilité de quantités suffisantes de bien plié, protéine de pleine longueur peut être un facteur limitant. Une approche pour surmonter cette limitation est …
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier le Fonds commun NIH – Protein Programme des réactifs de capture pour le financement du développement de la sélection d'anticorps et la caractérisation pipeline anticorps recombinants Réseau et la Fondation canadienne pour l'innovation pour l'achat de financement de la plate-forme de sélection robotique.
MATERIALS | |||
Name | Company | Catalog Number | |
New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
REAGENTS | |||
Name | Company | Catalog Number | |
polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
N-Z amine | Sigma | C7290 | |
glucose | Sigma | G8270-1KG | |
lactose | Bioshop | LAC234 | |
glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
agar | Bioshop | AGR001.500 | |
SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
benzonase | Novagen | 71205 | |
Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |