Summary

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em> In vitro</em> Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

Published: August 31, 2014
doi:

Summary

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Abstract

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

Introduction

Déterminer à la fois l'hôte et des caractéristiques virales qui influent sur le VIH-1 pathogenèse et la progression de la maladie est primordiale pour la conception rationnelle de vaccins. La réponse immunitaire cellulaire est un élément clé de la réponse immunitaire humaine au VIH-1 infection. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont nécessaires pour le contrôle initial de la virémie aiguë, et permettent à l'hôte d'établir un état ​​stable (point de consigne) de la charge virale de 1,2. Épuisement expérimentale de ces cellules effectrices en résulte une perte de contrôle viral 3,4. Malgré cela, les mutations se produisent à l'intérieur de s'échapper du génome viral qui renverser CTL reconnaissance des cellules infectées par des virus 9.5.

Certains allèles HLA ont été associés à une charge virale plus faibles et plus lente progression de la maladie, y compris 57 * B, B * et B * 27 81 10 à 15. Une partie de l'effet protecteur des allèles HLA de classe I peut être attribué au fait qu'ils ciblent les régions fonctionnellement limitées du génome tels que Gaget pour sélectionner des mutations d'échappement qui diminuent la capacité du virus à se répliquer in vitro de 16 à 21. Bien évasion du système immunitaire cellulaire est bénéfique pour le virus dans le contexte de la classe de sélection de l'allèle HLA I, l'effet de ces mutations peut avoir des conséquences différentielles de l'hôte lors de la transmission d'un individu HLA-incompatibles 22,23. Par conséquent, la compréhension des effets des mutations transmises évacuation de HLA-associé sur la capacité de réplication virale sera important d'approfondir notre compréhension de début de la pathogenèse du VIH-1.

Bien que beaucoup de progrès ont été faits pour identifier et caractériser les défauts de remise en forme de mutations d'échappement individuelles associées à HLA de classe spécifique je allèles 24-29, naturellement isolats VIH-1 ont des empreintes uniques et complexes de polymorphismes HLA-associé, probable découlant de l'HLA pression immunitaire médiée par des milieux différents immunogénétiques 30. En apanalyse revious, Goepfert et al. a montré que l'accumulation de mutations HLA-associés dans les séquences Gag transmissibles provenant de 88 Zambiens infection aiguë a été associée à une réduction de la valeur de consigne de la charge virale 31. Ceci suggère que la transmission de mutations délétères d'échappement, en particulier dans Gag, à des destinataires HLA-incompatibles fournit un bénéfice clinique, et peut être dû à la réplication virale atténuée. Aller de l'avant, il est impératif d'étudier la complexité des combinaisons de polymorphismes Gag dans les isolats naturels travaillent de concert pour définir les caractéristiques du virus transmissibles telles que la capacité de réplication et de la réplication précoce pourrait à son tour affecter le VIH-1 paramètres cliniques et à un stade avancé pathogenèse.

Brockman et al. D'abord démontré un lien entre la capacité de réplication des séquences gag-pro isolé lors de l'infection de stade chronique et la charge virale dans les deux sous-type C et les infections B32-35. L'approche expérimentale présentée dans ces études, bien approprié pour l'examen de la capacité de réplication in vitro de séquences provenant d'individus infectés de manière chronique, présente plusieurs réserves techniques et des limitations qui rendent l'étude du VIH-1 sous-type à capacité réplicative C individus infectés aiguë difficile. Cette méthode repose sur la recombinaison de séquences amplifiées par PCR basée sur la population dans le sous-type B NL4-3 provirus, qui a été dérivé en partie de VBL, un laboratoire adapté stock de virus 36. génération du virus a été réalisée par co-transfection d'une lignée de cellules T CEM à base 37 avec des amplicons PCR et digéré delta NL4-3 ADN de gag-pro. Cette méthode nécessite l'excroissance du virus au cours d'une période de plusieurs semaines à plusieurs mois, ce qui pourrait fausser la nature du stock de virus récupérée par rapport à la quasi-espèce virale in vivo, et en modifiant par conséquent la mesure de la capacité de réplication in vitro. Cette méthode is plus approprié pour étudier les individus infectés de manière chronique, où il sélectionne de manière efficace contre le virus de la capacité réplicative plus élevé, et où le clonage de nombreux différents variants viraux à partir d'un grand nombre d'individus infectés de manière chronique est très laborieuse et donc non réalisable. Cependant, au sein d'une personne gravement infectée, il ya généralement de un à deux variantes présent, et éliminant ainsi le risque de biaiser la nature du stock de virus récupéré, grâce à des pressions de sélection in vitro, permet une évaluation plus précise de vitro la capacité à la réplication. Deuxièmement, cette méthode nécessite recombiner sous-type C séquences gag-pro dans un squelette dérivé sous-type B, et pourrait introduire squelette biais d'incompatibilité dans l'analyse. En raison de ces limitations, un grand nombre de séquences doivent être analysés afin de surmonter les biais potentiels introduits.

Nous décrivons ici une appro expérimental alternatifhaque approprié pour étudier des séquences dérivées de sous-type C personnes infectées de façon aiguë. Nous utilisons une stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour introduire le gène gag provenant de points de VIH-1 sous-type C individus infectés temps de l'infection aiguë dans le proviral épine dorsale sous-type C, MJ4. L'utilisation de MJ4 comme une épine dorsale qui en commun pour cloner les gènes gag est crucial pour l'analyse de sous-type C de séquences dérivées. MJ4 est issu d'un isolat primaire 38, et seraient donc moins susceptibles d'introduire un biais en raison de sous-type incompatibilité entre la colonne vertébrale et le gène gag. De plus, l'approche de clonage en utilisant l'enzyme de restriction sur la base permet la proviral construit pour être directement transfectées dans des cellules 293T, et pour la récupération d'un stock de virus clonal identique à la séquence gag clone.

Le procédé présenté ci-dessous est un procédé à haut débit pour évaluer la capacité de réplication de sous-type C provenant Gag-MJ4les virus chimériques. La transfection dans des cellules 293T est simple et la récupération de virus ne prend que trois jours. In vitro la capacité de réplication est analysée sur la même lignée de cellules T à base de CEM-CCR5 créé par Brockman et al. 37, mais en utilisant des modifications du protocole importants nécessaires à la replication réussie des sous-types des virus chimériques C MJ4. L'utilisation d'une lignée de cellules T approprié plutôt que de PBMC permet à un grand nombre de virus de sous-type chimérique MJ4-C à tester avec une grande reproductibilité test. Enfin, en utilisant un dosage radio-marqué de la transcriptase inverse pour la quantification du virus dans le surnageant est plus économique que l'utilisation des kits ELISA disponibles dans le commerce p24. Il donne également une gamme dynamique plus élevée, ce qui était important pour détecter les virus faiblement et hautement répliquant dans le même dosage et pour détecter des différences subtiles dans la réplication entre les isolats.

En conclusion, la méthode présentée ici a permis del'étude approfondie de la capacité de réplication des séquences gag dérivés du VIH-1 sous-type C infection aiguë individus de la Zambie, et comme il est écrit, pourrait aussi être élargie pour étudier d'autres sous-type C infecté populations. Un haut degré de variation dans les capacités de réplication entre les différents isolats Gag a été observée. En outre, nous avons pu montrer une association statistique entre la capacité de réplication du Gag transmis et la consigne de la charge virale ainsi que des CD4 + baisse sur une période de trois ans 39. Ces résultats soulignent l'importance d'étudier les caractéristiques virales faire transmis, tels que la capacité de réplication, interagissent avec le système immunitaire de l'hôte d'influencer la pathogenèse lors de l'infection précoce et feront partie intégrante de l'élaboration d'interventions efficaces de vaccination ainsi que le traitement.

Protocol

1 Amplification du VIH-1 gag Gene de Infected, le plasma congelé Extraire un ARN viral à partir de 140 ul décongelés VIH-1 plasmatique infecté en utilisant un kit d'extraction. Lorsque cela est possible, de procéder immédiatement à la synthèse d'ADNc, après extraction de l'ARN viral comme l'ARN non congelé, on obtient les meilleurs résultats d'amplification. Si possible, mettre en place PCR master mix pour la première ronde amplification de l'ADN et conse…

Representative Results

Pour exécuter correctement ce protocole, ce qui crée un plasmide proviral capable d'assembler entièrement fonctionnels, infectieuses chimères Gag-MJ4, un grand soin doit être pris pour générer des amplicons PCR appropriées. Déterminer si le PCR a généré l'amplicon gag de taille appropriée est cruciale. Les produits doivent être à moins de 100 paires de bases (pb) de l'amplicon d'environ 1700 pb représenté sur la figure 1A. La longueur exacte de ce fragment sera …

Discussion

En raison de la longueur et de la nature technique de ce protocole, il ya plusieurs étapes qui sont essentielles à la fois pour la construction réussie de chimères plasmides Gag-MJ4 ainsi que pour la quantification de la capacité de réplication virale. Bien que la stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour l'introduction de gènes gag étranger dans MJ4 décrite dans le présent protocole a de nombreux avantages par rapport aux méthodes basées sur la recombinaison utilisées pr?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The investigators thank all the volunteers in Zambia who participated in this study and all the staff at the Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka who made this study possible. The investigators would like to thank Jon Allen, Smita Chavan, and Mackenzie Hurlston for technical assistance and sample management. We would also like to thank Dr. Mark Brockman for his discussions and generous donation of the GXR25 cells.

This study was funded by R01 AI64060 and R37 AI51231 (EH) and the International AIDS Vaccine Initiative. This work was made possible in part by the generous support of the American people through the United States Agency for International Development (USAID). The contents are the responsibility of the study authors and do not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government. This work also was supported, in part, by the Virology Core at the Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC and JP were supported in part by Action Cycling Fellowships. This work was supported in part by the Yerkes National Primate Research Center base grant (2P51RR000165-51). This project was also funded in part by the National Center for Research Resources P51RR165 and is currently supported by the Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

Materials

Name of the Reagent Company Catalogue number Comments
PCR reagents
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
GagInnerF1:
5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'
IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
BclIDegRev2:
5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'
IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3' IDT DNA Custom Oligo 25nmol, standard desalt
CoolRack PCR 96 XT Biocision BCS-529
CoolRack M15 Biocision BCS-125
Nuclease free water Fisher SH30538FS Manufactured by Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap) Daigger EF3647BX
SuperScript III one-step RT-PCR system Life Technologies/Invitrogen 12574035
Phusion Hot-start II DNA polymerase Fisher F-549L 
PCR Nucleotide Mix Roche 4638956001
Agarose, high gel strength Fisher 50-213-128
TAE 10X Life Technologies/Invitrogen AM9869
Promega 1kb DNA ladder Fisher PRG5711 Manufactured by Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10000x Life Technologies/Invitrogen S33102
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Razor blades, single-edged Fisher 12-640 Manufactured by Surgical Design
Thermocycler, PTC-200 MJ Research
Microbiology & Cloning reagents
LB Agar, Miller Fisher BP1425-2
LB Broth, Lennox Fisher BP1427-2
Sterile 100mm x 15mm polystyrene petri dishes Fisher 08-757-12
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518-5G
Falcon 14ml Polypropylene round-bottom tubes BD Biosciences 352059
NgoMIV restriction endonuclease New England BioLabs R0564L
BclI restriction endonuclease New England BioLabs R0160L
HpaI restriction endonuclease New England BioLabs R0105L
T4 DNA Ligase, 5U/μL Roche 10799009001
JM109 competent cells, >10^8 cfu/μg  Promega L2001
PureYield plasmid miniprep system Promega  A1222
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600
Microfuge 18 centrifuge Beckman Coulter 367160
Cell culture reagents
Amphyl cleaner/disinfectant Fisher 22-030-394
Fugene HD, 1 mL VWR PAE2311 Manufactured by Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268-5G
Costar Plates, 6-well, flat Fisher 07-200-83 Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 24-well, flat Fisher 07-200-84 Manufactured by Corning Life
Costar Plates, 96-well, round Fisher 07-200-95 Manufactured by Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm^2 Fisher 10-126-37
Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm^2 Fisher 10-126-34 Manufactured by Corning Life
Conical Tubes, 50ml, blue cap Fisher 14-432-22 Manufactured by BD Biosciences
Conical Tubes, 15ml, blue cap Fisher 14-959-70C   Manufactured by BD Biosciences
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CI Manufactured by Mediatech
RPMI, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 11875-119
DMEM, 500 ml Life Technologies/Invitrogen 11965-118
Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100X Life Technologies/Invitrogen 10378-016
PBS with magnesium and calcium, 500ml Life Technologies/Invitrogen 14040-133
PBS without magnesium and calcium Life Technologies/Invitrogen 20012-050
Sarstedt tubes, assorted colors Sarstedt 72.694.996
Reservoir Trays for Multichannel, 55ml Fisher 13-681-501
DEAE-Dextran Fisher NC9691007
Corning 96 well clear V bottom tissue culture treated microplate Fisher 07-200-96 Manufactured by Corning Life
HEPES, 1M Buffer Solution Life Technologies/Invitrogen 15630-080
FBS, Defined, 500 ml Fisher SH30070 03
X-gal VWR PAV3941 Manufactured by Promega
Glutaraldehyde, Grade II, 25% in H2O Sigma-Aldrich G6257-100ML
1M Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich M1028-100ML
Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5% Sigma-Aldrich F8775-500ML
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich P9387-100G
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich P8131-100G
Allegra X15-R centrifuge Beckman Coulter 392932
TC10 automated cell counter Bio-Rad 1450001
VistaVision inverted microscope VWR
Reverse-Transcriptase Quantification Assay reagents
dTTP, [α-33P]- 3000Ci/mmol, 10mCi/ml, 1 mCi Perkin-Elmer NEG605H001MC
1M Tris-Cl, pH 8.0 Life Technologies/Invitrogen 15568025 Must be adjusted to pH 7.8 with KOH
2M potassium chloride (KCl) Life Technologies/Invitrogen AM9640G Adjust to 1M solution
0.5M EDTA Life Technologies/Invitrogen 15575-020
Nonidet P40 Roche 11333941103
Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt  Midland Reagent Co. P-3001
Oligo d(T) primer  Life Technologies/Invitrogen 18418-012
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815-1G
SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small Perkin-Elmer 7001485
Corning Costar Thermowell 96 well plate model (M) Polycarbonate Fisher 07-200-245 Manufactured by Corning Life
Corning 96 Well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile Fisher 07-200-684 Manufactured by Corning Life
DE-81 anion exchange paper Whatman 3658-915
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804-1KG
Sodium Chloride Fisher S671-3
Autoradiography cassette Fisher FB-CA-810
Cyclone storage phoshpor screen Packard

References

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Claiborne, D. T., Prince, J. L., Hunter, E. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (90), e51506, doi:10.3791/51506 (2014).

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