Summary
ブナ樹皮病は、樹皮における真菌のエントリポイントを作成ブナスケール昆虫の活動を供給することによって開始される。カイガラムシに耐性のある木々はまた、疾患抵抗性である。ここで我々はブナの規模耐性について、個々のブナの木をスクリーニングするために開発したプロトコルを提示する。
Abstract
大幅に弱体化して変形している遺族の木を残しブナ樹皮病（BBD）初期の死亡率の高レベルの結果、。この疾患は、真菌のNeonectria種のいずれによる感染のエントリポイントを作成侵襲ブナカイガラムシ、 クリプトコッカスfagisugaの活動を供給することによって開始される。スケールの侵入がなければ、真菌感染症のために少し機会がある。人工的に重くBBD影響スタンドで健全な木をはびこるようにスケールの卵を使用すると、これらの木は病気の複雑な1のスケール昆虫の部分に耐性であったことを明らかにした。ここでは、フィールド内の小さな鉢植えの苗と移植片におけるスケール耐性樹木をスクリーニングするために使用することができヒューストン2による人工侵入技術をベースに我々が開発したプロトコルを提示する。スケール耐性樹木の同定はツリーをBBDの管理の重要な要素である改善プログラムや育林操作。
Introduction
ブナ樹皮病（BBD）が1890年代後半3ノバスコシア州のカナダの州では、侵襲的なブナカイガラムシの導入以来、北米でクリプトコッカスfagisugaをアメリカのブナに有害な影響を与えました。ブナカイガラムシが真菌（NeonectriaのditissimaまたはNeonectriaのfaginata）のNeonectria種の 1による感染のために玄関を提供する小さな亀裂を作成樹皮にその送りスタイを挿入すると、この昆虫病錯体が開始されます。真菌菌糸が成長するにつれ、組織の大部分は、最終的には完全に木を環状剥皮、死ぬかもしれない。病気による被害は強風4でスナップにそれが発生しやすいこと、木を弱める。疾患の最初の波の死亡率レベルは50％5と高いことが報告されている。潰瘍は、木材製品としてツリーの値を小さく形成するように、生存している木はしばしばひどく変形される。0;このような木は、確立スタンド6の経済的、生態学的価値を減らすことから、他のより望ましい種を防ぐ「ブナの藪」の形成につながるルート発芽する傾向を持っている。ブナ樹皮病はアメリカのブナの絶滅につながる可能性はありませんが、それは野生生物の7,8のために食料や生息地の減少につながる物と健康をスタンド変える。
何年も前からBBDの影響を受け、スタンドでは、疾患の症状がないままの木が報告されている。人工接種試験は、これらの木がカイガラムシ2に耐性であることが示されている。スケールの侵入がないと、Neonectria感染の機会がほとんどないが、真菌の影響を最小限に抑えることがある。前のスケールの侵入がない場合のNeonectriaの感染によるアメリカのブナにおける大規模な死亡率は決してありません報告されたので、BBDへの抵抗におけるブナのスケール昆虫結果に対する抵抗されて。
BBDの管理に関する最近の研究では、識別、繁殖、飼育、およびブナカイガラムシに対する抵抗性とアメリカのブナの木の保持に焦点を当てている。遺伝学的研究は、カイガラムシに対する耐性が遺伝性であり、耐木の慎重な選択および繁殖は、単一世代9の有意な改善をもたらすことができることを示している。この知見は、復元作付け10,11のための遺伝的に多様なBBD耐性種子の供給源を提供するために、耐性のアメリカのブナの地域採種園を確立するために、米国の州および国家森林管理者の努力に燃料を供給しています。研究はまた影響を受けやすい樹木や耐性樹木の維持を除去することにより、スタンドの遺伝学の育林操作はスタンド改良9,12をもたらすことができることを示した。 </ pの>
木の改善活動を通して、または造林処方を行うを通じてBBDの管理はのために選択し、ブナのスケール性と感受性の木々の間を区別する能力を必要とします。ここで紹介する方法は、まず、人工的にブナのスケールの卵1を苗に接種するためにデイブヒューストンによって導入方法から適応されている。この方法は、耐性に関連する量的形質遺伝子座（QTL）を同定するために、または遺伝的研究に耐性と感受性の鉢植え苗木又はグラフト化ラミートを区別するためのスクリーニングツールとして使用することができる。あるいは、採種園の開発、またはフィールドでの保持のために耐性ツリーを識別するためにフィールド内の成木をスクリーニングするために使用することができる。感受性の樹木を同定し、疾患の影響を最小限にするために除去することができる。
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Protocol
1植物材料：熟フィールド木、鉢植え苗、または鉢植え移植片
- フィールドテストでは、可能な抵抗のためのテストのためのスケールの侵入や病気の兆候を示さない、成熟した健康的なアメリカのブナの木を選択します。目に見えて影響を受けやすい木はまた、対照（ 図1）として使用されるように識別される必要があろう。
- 鉢植えの苗や移植片をテストするための、収集·コッホ＆キャリー、2004またはキャリーら 、2013に記載されたグラフト穂に記載されているようにbeechnuts発芽。
- 47グラムの微量栄養素、477グラム徐放性肥料15N-3.9P-9.9K、700グラムの粗パーライトと2.8立方あたり75グラムの硫酸アルミニウムを改正ポッティング土壌ミックスの苗や移植片を育てる。フィートバッグ。生育期の後半で必要に応じて、200 ppmの窒素において、可溶性17N-1.3P-14.1K毎週植物を肥やす。
- 生育期間中は、日陰の家の中で植物を保つ。植物は前にそれらを移動する秋に休眠外に行くことを許可する制御された温度貯蔵施設（〜4℃）に11月から4月を通して。
ブナスケール卵の2。コレクション
- BBDが出没するスタンドでは、八月中旬まで月中旬から通常豊富な卵の存在を確認するために手虫眼鏡で（簡単に「白い」外観、 図1Aで識別される）に大きくはびこっ木を検査します。
- プラスチック密封可能な1ガロンの収集袋（ 図1B）に、ゆっくりと大人のカイガラムシ、卵やその他の破片の白いワックス状の塊を磨くために絵筆を使用しています。少なくとも12メートル離れて三つの異なる木の最小値から収集します。
- 必要に応じて、4℃で2週間まで密封された収集袋に卵を保管乾燥から卵を防ぐために、バッグの内側に湿らせたポリエチレンフォームのテープの小片（2.5cm角）。
- 大人（0.60ミリメートル）とdebriからスケールの卵（0.15×0.25ミリメートル）を分離するS、2 '塩ビ管の短い部分と250ミクロンのナイロンメッシュの正方形の一枚（ 図2）をサポートするカップリングを使用してふるいを構築する。
- ふるい上に収集袋から大人、ワックス、卵、破片の混合物を空にして静かに以下のガラスシャーレにメッシュを通過するように卵を奨励するために、小さなペイントブラシを使用しています。彼らはそれが困難に卵を移動すること、より多くの静電気を保持するため、プラスチック製ペトリ皿は避けるべきである。卵の前と後の篩い分けを図3に示す。
- 精製された卵は、少なくとも1週間、4℃でペトリ皿に格納することができる。乾燥から卵を防ぐために、蓋に泡の湿った部分をテープで固定し、パラフィルムで密封する。
3。卵生存率アッセイ
- 卵の生存率を評価するために、ガラスを60mmペトリ皿（ 図4Aの底部の周囲にワセリンの薄いリングを適用するために10ccのシリンジを使用し
- 、リングの中心に、約100の卵を移すシャーレにふたを置いて、パラフィルムで密封する。卵は事前のアッセイ開始まで4℃で保存した場合に密封されたペトリ皿で2週間、3週間、室温で邪魔されずに残ることができます。
- 孵化し幼虫は、石油ゼリー中のスタックになり、簡単にカウントすることができ、空の卵は簡単に自分の色や光沢（ 図4B）で孵化していない卵から区別されます。空の卵を加え、残りのフル卵の合計によって幼虫の数を割ることによって実行可能性を計算する。良好な生存率は75％〜90％の孵化した卵の範囲であるべきである。
分野における大規模な熟ぶなの4。スケール抵抗上映
- 定量試験のため、解剖顕微鏡を使用して、小さなへらを使って500の卵を数える優しくポリエチレンフォームのpredampened、オープンセル10×15×1.3センチメートルの長方形の中心を横断して振りかける。へ泡を減衰させる、できるだけ多くの水を絞り出す、それを濡らす。定性試験では、500卵カウントアウトすることができ、小さなガラスバイアルに、約500卵の追加のバッチを測定するために使用することができる描か「充填」の行に配置された。
- 樹皮に対向する卵の側にテストツリー上にフォームパッドを配置します。ロープ、ひも、より糸、プラスチックコーティングされたハードワイヤーで所定の位置にパッドを保持する。プラスチックや金属系材料ではなく、より容易に野生動物により除去された天然繊維材料よりも使用する必要があります。
- アセテート系シリコーン接着剤に沿って蒸気透過性防水ハウスラップの上部とプレカットの側面プリント23 x 30 cm片と泡試験パッド上に置きます。防水シールを作成するために木にハウスラップの端を押してください。しばらく接着剤セット（ 図5）所定の位置に保持するために、木とハウスラップの周りにナイロンひもやプラスチックコーティングされたハードワイヤーを配置します。
- 2の最小値を置き好ましくは木の幹の両側の各テストツリー上のテスト·パッド、。各サイトで、対照として（明白な自然のスケールの侵入で）少なくとも2の影響を受けやすい木にテストパッドを配置。対照木にテストパッドを配置する前に、会社を使用して、任意の天然に存在するカイガラムシや卵を取り除くには、ブラシを毛先。
注：卵フォームパッドが蔓延レベルが低い地域では特に役立ちますスケールの卵を、飼育する目的のために木にも配置することができます。
鉢植えの苗や移植片の5。スケール抵抗上映
- テストのために、それらの上に配置された少なくとも2つの別々のテストパッドを持っているのに十分な高、1センチメートル（5センチメートル土壌線の上キャリパー）の最小径と鉢植えの木を選択します。必要なときにテストパッド用のスペースを確保するために、小さな側枝を剪定。
- 150卵を数え、プレカットの上にそれらを散乱させる解剖顕微鏡を使用し、2.5×7.6 X 1.3センチメートル気泡ポリエチを湿らレンのフォームパッド。
- プラスチック被覆ワイヤーを使用して、樹皮に対する卵の側に苗ためにフォームパッドを貼付。ちょうど泡の上に苗の周りのハウスラップの小さな正方形をラップした（ 図6Aを参照）アセテート系シリコーンでそれを封印。
- コントロールとして苗家族や移植片の影響を受けやすい知ら含まれています。
6。データ収集
注：約52から57週の試験木にフォームパッドと卵を置いた後、データを収集することができる。なお、これは大人が再生する能力を決定することができるように、卵を産み始めた後まで行われないことが重要である。いくつかの耐性の木にそれは成人の数が少ないが、全く再生が発生していないとの確立を参照することも珍しくありません。
- 慎重にフォームパッドを取り外し、手レンズや拡大鏡（10倍）を使用して、樹皮上に確立大人のカイガラムシの数を数える。
- フォームパッドが除去されると、それはuのではないいくつかの大人と泡と木の外に引っ張られる最も卵のクラスタ用ncommonます（ 図7を参照）。解剖顕微鏡を使用して、フォームパッドに付着し残っている卵のクラスタと大人を数える。
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Representative Results
図6は、感受性の異なる程度を示す抵抗性苗（C）および2の影響を受けやすい苗（D、E）を示しています。人工侵入テストを設定した後の影響を受けやすく、成熟した木は57週間どのように見えるかの例を図5（b）に示します。発泡体が離れて木から剥離するときにツリーとフォームパッドの両方からデータを収集することが必須である理由である図7に示すように、カイガラムシとその卵のクラスタは発泡体に付着したままにするためには、珍しいことではない。
図8は、2つの異なるスタンド、ペンシルベニア州アレゲニー国有林（ANF）に1つ、ルディングトン州立公園（LSP）の他、ミシガン州で人工的に出没する木に100の卵あたり確立成虫の平均数を示している。両方のスタンドは、BBD、各スタンドでは、健康的な木のクラスタに寄生させたsが識別され（LSP耐性及び耐性ANF）およびクローンDNA分析（データは示さず）に基づいて決定された。 BBD感受性樹木のクローンクラスタも、LSP（LSP感受性）で同定されたが、ANFに5つの別個の影響を受けやすい木は（ANF感受性）を使用した。内との間で、クローンクラスタ、2.1〜12.8インチまでの範囲胸高直径によって変化サイズ。 図8は、感受性木に確立された大人数の変化がたくさんあるが、明らかな違いが感受性および抵抗性の木々の間で検出されることを示しています。影響を受けやすい樹木に比べて両方に耐性のクラスタの大人数の少ないばらつきがありました。 LSP耐性クラスタ内の一部のクローンは、大人の数が少ないがあったが、ANF耐性クラスタでは、試験された全12個のクローンは、全く大人がなかった。しかし、両方のサイトで耐性と感受性の木の平均からの標準偏差の重複はありませんでした。
ヴァリアーLSPでのクローン的に関連の木々の大人数（感受性LSP）内のTiONは、これらの木がクローンではなく、遺伝的に異なっているという事実にもかかわらず（ANF感受性）ANFの影響を受けやすい樹木で観察されるよりも大きい。生存率試験（データは示さず）は、この変動は、卵の生存率に大きな差に起因しないことを示す。変動は、遺伝的および環境的差異の両方の可能性があり、すべてのテストサイトでの参照用に感受性のコントロールを有することの重要性を示している。
図1。スケールが出没するアメリカのブナの木からスケールの卵のコレクション。 。重スケールが出没するアメリカのブナの木。B。絵筆を以下に密封可能な収納袋に大人のカイガラムシとその卵を磨くために使用されます。
図2成人および他の汚染物質からのスケールの卵を分離するふるいの構築 250ミクロンのナイロンメッシュ篩を形成するために直径2 "のPVCパイプと継手の4インチの片の間に配置される4×4インチプリカット正方形。
図3のスケールの卵（A）の前及び（B）篩い分けた。木から採取後解剖顕微鏡下で観察大人のカイガラムシ、卵、破片の混合物。B。精製された卵は、篩を通過した後に得られる。
図4。卵の生存能力テスト。トラップニンフにシャーレ内の石油の。指輪。Bは孵化後。私は、未孵化した卵の右側にニンフのフォーム。℃。孵化した卵は、孵化前に黄色がかった卵を不透明に色や半透明相対的に軽い。
図5。分野で成熟したアメリカのブナの人工侵入。卵の下に。Bでフォームパッド上に蓄積余分な水分を防ぐために、アセテート系シリコーンで固定された。ハウスラップ。ハウスラップは削除され、フォームパッドは、Sを明らかにするために52週間配置後に剥がしこの影響を受けやすいツリーの下にコロニー形成をケイル。
図6。鉢植えアメリカブナ苗の人工侵入。ステムに取り付けられた卵A.泡。B.ハウス泡をカバーラップ℃の泡がD.の影響を受けやすい苗、E.および影響を非常に受けやすい苗、耐性苗に56週間後に削除されます。 拡大バージョンを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
図8。2の別々のスタンドに人工的に出没する木を上に確立された成虫の平均数の比較。アレゲニー国有林、PA（ANF）およびルディングトン州立公園内の抵抗力がある木、ミシガン（LSP）は、感受性のある対照の木と比較されます。各グループでテスト木の数は、以下の括弧内に記載されており、適用される100の卵あたり大人のカウントは、グループ内のすべてのツリー全体で平均化した。バーは、m個から1標準偏差を表す。EAN。
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Discussion
このアッセイの成功のために必要な重要なステップは、卵と試験された各サイトで、鉢植えの材料との影響を受けやすいコントロールの使用上の実行可能性テストを実行することを含む。これは、木または実生ごとに複数のテスト用パッドを使用することも重要である。我々は、フィールド内の鉢植えの植物に、より制御された試験の両方において、頻繁なエラーの源は、パッド不良であることができることを見出した。例えば、フィールドにおいても、過剰な水分を防ぐために、ハウスラップと試験パッドをカバーする我々の修正を加えて、ステムを流れ落ちる水は、木の一方の側に有利に働くことができ、試験パッドの損失をもたらす。
正確な結果を得るためには、パッドの下のツリー面とフォームパッド自体の両方を獲得することが重要である。成虫および卵クラスターに加えて、フォームI幼虫と呼ばれるスケールのライフサイクルにおける唯一の移動相は、また観察することができる。最終的にはこれらのモバイルニンフフォームIIニンフになってきて、木の樹皮に彼らの摂食スタイを挿入します。大きな大人がより球状の形状を有するが、両方のタイプの幼虫が小さく、楕円形の卵サイズと外観が非常に類似している。それは赤い目を持ち、動いているので、私はニンフの形は卵から識別可能であるが、この動きは非常に困難に正確な数を取得することができます。 II型ニンフは簡単に手のレンズをフィールドにデータを記録するか、ガラスではなく、顕微鏡を拡大する場合は特に、卵と間違われることができます。これらの理由から、我々は大人だけをカウントすることをお勧めし、私たちが発見した卵のクラスタの数は、私たちに自立規模な侵入をサポートするためのテストツリーの能力に再現性のあるデータを提供します。以前の研究は、成人の数が非常に卵のクラスタ番号9と相関することが示されている。多くの場合、それだけで、成人をカウントするのに十分であり得る;しかし、我々は大人が可能ないくつかの事例を観察しているの木の特定の遺伝子型に確立するが、卵を生産しない。再現する能力がなければ、スケールの侵入は、これらの木に、持続可能ではないでしょう。
フィールドで行われるこのアッセイの予想外の没落は、クマにテストパッドの魅力です。プロトコルへの将来的な変更は、クマにはあまり魅力的かもしれ材料を使用して、異なる高さでテストパッドを配置することに焦点を当てるべきである。試験のこの方法の限界は、ブナ樹皮病の拡散リスクを回避するために、既に、少なくとも光ブナスケールの侵入を持たない領域で使用すべきではないということである。
この技術の有用性は、育種プログラムの一部として、親の性能を評価するために使用することができることである。このような後代検定のためのスケール耐性に関する厳格な基準は、通常、1成人とゼロなどを可能に従っている抵抗の基準としてGクラスタ。両親を選択するために、これらのガイドラインを使用して、抵抗性の子孫の割合は、放任受粉種子15比べてかなり改善されて約50％であるべきである。カイガラムシの低レベルをサポートする木は比較的健康なままであるので、土地管理の目的のためには、木を保持するためのより厳しくない基準を使用することが望ましい場合がある。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
作者は感謝して、米国森林局森林健康保護の評価の監視と発展を支えてきた特殊な技術開発プログラム、強く、ブナカイガラムシの影響を受けやすい木を識別するために、ここで説明されたプロトコルの変更やアプリケーションからの資金調達を認める。また、当社のアメリカブナ抵抗スクリーニングプログラムの彼らの継続的なパートナーシップとサポートのため、オハイオ州カートランド、ホールデン樹木園に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
- Houston, D. R. A technique to artificially infest beech bark with the scale, Cryptococcus fagisuga (Lindinger). U.S. Forest Service. , Northeastern Forest Experiment Station. Broomhall, PA. (1982).
- Houston, D. R. American beech resistance to Cryptococcus fagisuga. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 38-42 (1983).
- Ehrlich, J. The beech bark disease: a nectria disease of Fagus, following Cryptococcus fagi. 10, 593-692 (1934).
- Papaik, M. J., Canham, C. D., Latty, E. F., Woods, K. D. Effects of an introduced pathogen on resistance to natural disturbance: beech bark disease and withdrow. 35, 1832-1843 (2005).
- Miller-Weeks, M. Current status of beech bark disease in New England and New York. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 21-23 (1983).
- Houston, D. R. Beech bark disease: The aftermath forests are structured for a new outbreak. J. For. 73, 660-663 (1975).
- Twery, M. J., Patterson, W. A. Variations in beech bark disease and its effects on species composition and structure of northern hardwood stands in central New. 14, 565-574 (1984).
- Jakubus, W. J., McLaughlin, C. R., Jensen, P. G., McNulty, S. A., et al. Alternate year beechnut production and its influence on bear and marten populations. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 79-87 (2005).
- Koch, J. L., Carey, D. W., Mason, M. E., Nelson, C. D. Assessment of beech scale resistance in full- and half-sib families. Can. J. For. Res. 40, 265-272 (2010).
- Koch, J. L. Beech bark disease: The oldest “new” threat to American beech in the United States. Outlooks Pest Manag. 21, 64-68 (2010).
- Koch, J. L., Mason, M. E., Carey, D. W., et al. Screening for resistance to beech bark disease: improvements and results from seedlings and grafted field selections. Proceedings of the 4th International Workshop on Genetics of Host-Parasite Interactions in Forestry. Palmieri, K., et al. , U.S. Forest Service, Pacific Southwest Research Station. Albany, CA. (2012).
- Leak, W. B. Fifty year impacts of the beech bark disease in the Bartlett Experimental Forest, New Hampshire. Northern J. Appl. For. 23, 141-143 (2006).
- Koch, J. L., Carey, D. W., et al. Controlled cross-pollinations with American beech trees that are resistant to beech bark disease. Proceedings of the 14th Central Hardwood Forest Conference. Yaussy, D. A., et al. , U.S. Forest Service, Northeastern Research Station. 358-364 (2004).
- Carey, D. W., Mason, M. E., Bloese, P., Koch, J. L. Hot callusing for propagation of American beech by grafting. HortSci. 48, 620-624 (2013).
- Koch, J. L., Carey, W. W., et al. The genetics of resistance of American beech to beech bark disease: knowledge through 2004. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 98-105 (2005).
