Summary
Bok bark sjukdom initieras genom att mata verksamhet bok skala insekt som skapar svamp ingångar i barken. Träd som är resistenta mot skalan insekten är också sjukdomsresistenta. Här presenterar vi de protokoll som vi har utvecklat för att screena individuella bokträd för bok skala motstånd.
Abstract
Beech bark sjukdom (BBD) resulterar i hög initial dödlighet, lämnar efter överlevande träd som i hög grad är försvagade och deformerade. Sjukdomen initieras genom inmatning verksamhet invasiv beech skala insekt, Cryptococcus fagisuga, vilket skapar ingångspunkter för infektion genom att en av de Neonectria arter av svampen. Utan skal angrepp, det finns små möjligheter för svampinfektion. Använda skala ägg till artificiellt angripa friska träd i kraftigt BBD påverkade montrar visade att dessa träd var resistenta mot skalan insekt del av sjukdomskomplexet 1. Här presenterar vi ett protokoll som vi har utvecklat, baserad på den konstgjorda angrepp teknik av Houston 2, som kan användas för att screena för skala tåliga träd i området och i mindre krukväxter plantor och ympkvistar. Identifieringen av skala tåliga träd är en viktig del i förvaltningen av BBD genom trädförbättringsprogram och skogsvårds manipulation.
Introduction
Beech bark sjukdom (BBD) har haft en negativ inverkan på amerikansk bok i Nordamerika sedan introduktionen av den invasiva bok skala insekt, Cryptococcus fagisuga, i den kanadensiska provinsen Nova Scotia i slutet av 1890-talet 3. Denna insekt-sjukdomskomplexet initieras när den bok skalan insekten sätter sin matningstråden in i barken skapa små sprickor som ger farstun för infektion av en av Neonectria arter av svamp (Neonectria ditissima eller Neonectria faginata). Som svamp mycel växer, kan stora delar av vävnaden dör, så småningom helt girdling trädet. Skadan från sjukdomen försvagar trädet, vilket gör det en benägenhet att gå av i hård vind 4. Dödlighet i den första vågen av sjukdomen har rapporterats vara så hög som 50% 5. Överlevande träd är ofta svårt deformerade som cankers bildar minskar värdet av trädet som en träprodukt.0; Sådana träd har en benägenhet för root-groning som leder till bildandet av "bok snår" som hindrar andra mer önskvärda arter från att etablera, minska den ekonomiska och ekologiska värde stativet 6. Även bok bark sjukdom är inte sannolikt att leda till utrotning av den amerikanska bok, förändrar det stå sammansättning och hälsa som leder till en minskning av mat och livsmiljö för vilda djur 7,8.
I bestånd som påverkas av BBD under många år, har träd som förblir fria från symptom på sjukdomen rapporterats. Konstgjorda ympning studier har visat att dessa träd är resistenta mot skalan insekten 2. Utan skal angrepp, det finns små möjligheter till Neonectria infektion, minimera effekterna av svampen. Storskalig dödlighet i amerikansk bok på grund av Neonectria infektion i frånvaro av tidigare skal angrepp har aldrigrapporterats, så motståndet till bok skala insekts resultat i motstånd till BBD.
Ny forskning om hantering av BBD har fokuserat på att identifiera, förökning, uppfödning och bevarande av amerikanska bokträd med motstånd till bok skala insekt. Genetiska studier har visat att resistens mot skalan insekten är ärftlig och noggrant urval och avel av resistenta träd kan leda till betydande förbättringar i en enda generation 9. Detta fynd har underblåst insatser från statliga och nationella skogsförvaltare i USA att etablera regionala fröplantager av resistenta amerikansk bok för att ge en källa för genetiskt skiftande BBD resistent utsäde för restaurering planteringar 10,11. Forskning har också visat att skogsvårds manipulation av monter genetik genom att avlägsna känsliga träd och bibehållande av resistenta träd kan leda till monter förbättring 9,12. </ P>
Hantering av BBD genom trädförbättringsaktiviteter eller genom att utföra skogsvårds recept kräver förmåga att välja på och skilja mellan bok skala tåliga och mottagliga träd. De metoder som presenteras här har anpassats efter en metod som först introducerades av Dave Houston till artificiellt ympa plantor med bok skala ägg 1. Metoden kan användas som en screeningmetod för att identifiera kvantitativa drag loci (QTL) associerad med resistens eller att skilja mellan resistenta och känsliga krukväxter plantor eller ympade rameter i genetiska studier. Alternativt kan den användas för screening av mogna träd i området för att identifiera resistenta träd för fröplantage utveckling, eller kvarhållande i fält. Känsliga träd kan identifieras och tas bort för att minimera påverkan sjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Växt Material:. Mogna Field Träd, Krukväxter plantor, eller Inlagda Grafts
- För fälttester, väljer mogna friska amerikanska bokträd som inte visar några tecken på skal angrepp eller sjukdom för att testa för möjliga motstånd. Synligt känsliga träd måste också identifieras för att användas som en kontroll (Figur 1).
- För att testa krukväxter plantor eller transplantat, samla och gro bokollon som beskrivs i Koch & Carey, 2004 eller transplantat ättling som beskrivs i Carey et al, 2013.
- Odla plantor eller transplantat i krukväxtjord mix ändras med 47 g mikronäringsämnen, 477 g långsam frisättning gödnings 15N-3.9P-9.9K, 700 g grov perlit och 75 g aluminiumsulfat per 2.8 cu. ft väska. Vid senare behövs i växtsäsongen, gödsla växter varje vecka med lösligt 17N-1.3P-14.1K vid 200 ppm kväve.
- Under växtsäsongen, hålla växter i en skugga hus. Låt växterna att gå vilande ute i höst innan du flyttar demtill en kontrollerad lagringstemperatur anläggning (~ 4 ° C) från november till april.
2. Insamling av Beech Scale Ägg
- I ett BBD-angripna monter, inspektera kraftigt angripna träd (lätt identifieras av deras "vitkalkade" utseende, figur 1 A) med en hand förstoringsglas för att bekräfta förekomsten av ägg, oftast rikligt från mitten av juli till mitten av augusti.
- Använd en pensel för att försiktigt borsta de vita vaxliknande klumpar av vuxen skala insekter, ägg och annat skräp, i en plast förslutningsbar en gallon uppsamlingspåse (Figur 1B). Samla från minst tre olika träd på minst 12 m från varandra.
- Om det behövs, lagra ägg i påsen den förseglade samling i upp till två veckor vid 4 ° C. Tejpa en liten bit (2,5 cm i fyrkant) av fuktad polyetenskum på insidan av väskan för att förhindra äggen från att torka ut.
- För att separera skal ägg (0,15 x 0,25 mm) från vuxna (0,60 mm) och debris, konstruera en sikt med användning av en kort bit av 2 "PVC-rör och en koppling för att stödja en fyrkantig bit 250 micron nylon mesh (Figur 2).
- Töm blandning av vuxna, vax, ägg och skräp från uppsamlingspåsen på sållet och använda en liten pensel för att försiktigt stimulera äggen att passera igenom maskorna till en glaspetriskål nedan. Petriskålar av plast bör undvikas eftersom de har mer statisk elektricitet, vilket gör det svårt att flytta äggen. Ägg före och efter siktning visas i Figur 3.
- Renade ägg kan lagras i petriskålen vid 4 ° C under minst en vecka. För att förhindra äggen från att torka ut, tejpa en fuktig bit skum till locket och försegla med Parafilm.
3. Egg Lönsamhetsanalyser
- För att bedöma ägg viabilitet, använda en 10 cm ^ spruta att applicera en tunn ring av vaselin runt omkretsen på botten av en 60 mm glaspetriskål (Figur 4A
- Överför ca 100 ägg till mitten av ringen, placera locket på petriskål och försegla med Parafilm. Låt den förseglade petriskål att förbli ostörd vid rumstemperatur i 2 veckor, eller 3 veckor om ägg vid 4 ° C lagrades innan analysen påbörjas.
- Kläckta nymfer kommer att fastna i vaselin och kan lätt räknas, och tomma ägg är lätt skiljas från okläckta ägg genom sin färg och glans (Figur 4B). Beräkna lönsamheten genom att dividera antalet nymfer med summan av de tomma ägg plus de återstående hela ägg. Bra viabilitet bör ligga inom 75% till 90% kläckta ägg intervall.
4. Skala Resistance Screening av stora mogna Beech träd i fält
- För ett kvantitativt test, räkna ut 500 ägg med användning av ett dissekeringsmikroskop och användning av en liten spatel försiktigt strö dem över mitten av en predampened, öppna celler 10 x 15 x 1,3 cm rektangel av polyetylenskum. Tilldämpa skum, blöt det sedan pressa ut så mycket vatten som möjligt. För ett kvalitativt test, kan 500 ägg räknas ut och placeras i en liten glasflaska och en "fyllning" linje som kan användas för att mäta ytterligare partier av cirka 500 ägg.
- Placera skumdynan på testträd med ägget sidan vänd mot barken. Håll plattan på plats med rep, snöre, snöre, eller plastbelagd hårdvara tråd. Plast-eller metallbaserade material ska användas i stället för naturliga fibermaterial som är lättare scavenged av vilda djur.
- Linje toppen och sidorna av en färdigskurna 23 x 30 cm bit av ånggenomsläppligt vattentätt hus wrap med acetat baserad silikon lim och placera den över skumprovdynan. Tryck kanterna av vindskydds till trädet för att skapa en vattentät försegling. Placera nylon garn eller plastbelagd hårdvara tråd runt trädet och huset wrap, för att hålla den på plats medan limmet uppsättningar (Figur 5).
- Placera minst tvåtestdynorna på varje testträd, företrädesvis på motsatta sidor av den bole. Vid varje plats, placera provdynor på minst 2 känsliga träd (med uppenbar naturlig skala angrepp) som en kontroll. Före att förlägga testdynor på kontroll träd, ta bort alla naturligt förekommande skala insekter eller ägg med hjälp av en fast borste.
OBS: Skumkuddar med ägg kan också placeras på träden för att uppfödnings skala ägg, vilket kan vara särskilt användbart i områden där angrepp nivån är låg.
5. Scale Resistance Screening av Inlagda Plantor eller Grafts
- För att testa, väljer krukväxter träd med en diameter på minst 1 cm (tjocklek 5 cm ovanför marklinjen) som är lång nog att ha minst två separata provdynor som ställs på dem. Beskära små sidogrenar vid behov för att göra plats för de testdynorna.
- Använd en dissekera mikroskop för att räkna ut 150 ägg och strö dem över en färdigskurna och dämpade 2,5 x 7,6 x 1,3 cm med öppna celler polyetenlene skum pad.
- Fäst skumdynan till planta med ägget sidan mot barken, med hjälp av plastbelagd tråd. Linda en liten fyrkant av huset lindas runt plantan strax ovanför skummet och försegla den med acetat-baserade silikon (se figur 6A).
- Inkludera kända känsliga plantor familjer eller transplantat som kontroller.
6. Datainsamling
OBS: Cirka 52-57 veckor efter att placera kuddar och ägg på provträd kan data samlas in. Det är viktigt att detta inte sker förrän efter vuxna har börjat att lägga ägg, så att deras förmåga att reproducera kan bestämmas. På vissa resistenta träd är det inte ovanligt att se ett litet antal vuxna etablera men utan reproduktion inträffar.
- Ta försiktigt bort skumdynan och räkna antalet vuxna skala insekter som är etablerade på barken med hjälp av en hand lins eller förstoringsglas (10X).
- När skumdynan avlägsnas, är det inte uncommon för vissa vuxna och de flesta ägg kluster som ska dras bort från trädet med skum (se Figur 7). Med hjälp av en dissekera mikroskop, räkna ägg kluster och vuxna som förblivit fäst skumdynan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 visar en resistent planta (C) och två känsliga plantor (D, E) uppvisar olika grad av mottaglighet. Ett exempel på vad en mottaglig mogna träd ser ut som 57 veckor efter den konstgjorda angrepp testet bildades visas i figur 5B. När skummet skalas bort från trädet, är det inte ovanligt att skala insekter och deras ägg kluster att förbli fastnat på skummet som visas i figur 7, vilket är varför det är viktigt att samla in data från både trädet och skumdynan .
Figur 8 illustrerar det genomsnittliga antalet vuxna insekter som fastställts per 100 ägg på artificiellt angripna träd i två olika bestånd, en i Allegheny National Forest (ANF) i Pennsylvania och den andra i Ludington State Park (LSP), Michigan. Båda bestånd var angripna med BBD och i varje monter, ett kluster av friskt träds identifierades (LSP Resistent och ANF Resistant) och bestämt sig för att vara klon baserad på DNA-analys (data visas ej). En klonal kluster av BBD-känsliga träd identifierades också vid LSP (LSP Känslig) men i ANF fem olika känsliga träd användes (ANF Känslig). Inom och mellan klonala kluster, storlek varierade med DBH varierar från 2,1 till 12,8 inches. Figur 8 visar att även om det finns en hel del variation i antal vuxna som är etablerade på de känsliga träden, finns tydliga skillnader upptäcks mellan känsliga och resistenta träd. Det var mindre variation i antalet vuxna i båda resistenta kluster i förhållande till de känsliga träden. I ANF Resistent klustret alla 12 kloner som testades hade inga vuxna, medan i LSP Resistent klustret vissa kloner hade ett litet antal vuxna. Men det fanns ingen överlappning i standardavvikelsen från medelvärdet av de resistenta och mottagliga träd på båda platserna.
Den varianing av antalet vuxna på kloner relaterade träd i LSP (LSP Känslig) är större än den som observerats i ANF känsliga träd (ANF Mottagliga) trots att dessa träd inte klonal och är genetiskt olika. Viabilitet tester (data visas ej) indikerar denna variation är inte på grund av stora skillnader i lönsamheten för äggen. Variationen beror sannolikt på både genetiska och miljömässiga skillnader och belyser vikten av att ha känsliga kontroller som referens vid varje provplats.
Figur 1. Insamling av ägg skala från skal-angripna amerikansk bok träd. B A. Kraftigt skala-angripna amerikansk bok träd.. En pensel används för att borsta vuxna skala insekter och deras ägg i en förslutningsbar förvaringspåse nedan.
Figur 2. Konstruktion av såll för att separera skal ägg från vuxna och andra kontaminanter. En 4 x 4 tum förskurna kvadraten på 250 micron nylon mesh placeras mellan en 4 tums bit 2 "diameter PVC-rör och en koppling för att bilda den sikt .
Figur 3. Skala ägg före (A) och efter (B) siktning. En. Blandning av vuxen skala insekter, ägg och skräp ses under dissekera mikroskop efter insamling från träd. B. Renade ägg som erhållits efter att ha passerat genom sikt.
Figur 4. Egg lönsamhetskrav. En. Ring av olja i petriskål att fånga nymfer efter kläckningen. B. Form Jag nymf till höger om en FN-kläckt ägg. C. Kläckta ägg är ljusare i färgen och genomskinligt relativt ogenomskinliga gulaktiga ägg före kläckning.
Figur 5. Artificiell angrepp av mogna amerikansk bok inom området. En. Hus wrap fästs med acetat-baserade silikon för att förhindra att fukt samlas på skumdyna med ägg under. B. Hus wrap har tagits bort och skumdyna skalade tillbaka 52 veckor efter placering för att avslöja scale kolonisering under på detta känsliga träd.
Figur 6. Artificiell angrepp av krukväxter amerikansk bok plantor. A. Skum med ägg knutna till stammen. B. House sjal som täcker skum. C. Skum bort efter 56 veckor på en resistent planta, D. en känslig planta, E. och en mycket känslig planta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8. Jämförelse av det genomsnittliga antalet vuxna insekter som är etablerade på konstgjord väg angripna träd i två separata montrar. Resistenta träd i Allegheny National Forest, PA (ANF) och i Ludington State Park, MI (LSP) jämförs med känsliga kontrollträd. Antalet undersökta i varje grupp träd listas inom parentes nedan, och vuxna räknas per 100 ägg tillämpade var i genomsnitt över alla träd inom gruppen. Baren representerar en standardavvikelse från mean.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska steg som krävs för att lyckas i denna analys inkluderar att utföra en lönsamhetstest på äggen och användning av känsliga kontroller vid varje testad plats, och med krukväxter material. Det är också viktigt att använda mer än en provdyna per träd eller plantor. Vi har funnit att både i fält och i mer kontrollerade tester på krukväxter, kan en vanlig felkälla vara pad misslyckande. Till exempel, i fältet, även med vår modifikation av täcker testdynan med hus wrap för att förhindra fukt, vatten som rinner ned på stjälken kan gynna en sida av ett träd och resultera i förlust av en testdyna.
För att få korrekta resultat, är det viktigt att göra mål både trädytan under kudden och själv skumdynan. Förutom vuxna och ägg kluster, det enda mobila fasen i skalan livscykel kallas formen jag nymfer, kan också observeras. Dessa mobila nymfer småningomsätter deras utfodring stilett i barken på trädet, blir en form II nymf. Båda typerna av nymfer är mycket lika i storlek och utseende för att de små, ovalformade ägg, medan de större vuxna har en mer sfärisk form. Formuläret jag nymf kan särskiljas från ägg eftersom det har röda ögon och är i rörelse, men denna rörelse gör att få en exakt räkning mycket svårt. Formuläret II nymf kan lätt misstas för ett ägg, speciellt när du spelar in data i fältet med en hand lins eller förstoringsglas och inte ett mikroskop. Av dessa skäl rekommenderar vi räknar bara de vuxna och antalet ägg kluster, som vi har funnit ger reproducerbara data om möjligheten för ett provträd för att stödja självbärande skal angrepp. Tidigare arbete har visat att den vuxna räkna är starkt korrelerad med ägget kluster nummer 9. I många fall kan det räcka med att bara räkna vuxna; Men, har vi observerat några fall där vuxna är kapablafastställa om vissa genotyper av träd, men inte producerar ägg. Utan förmågan att reproducera, skulle vågen angrepp inte vara hållbar på dessa träd.
En oväntad gången för denna analys när de utförs i fält är attraktionstestdynorna till björnar. Framtida ändringar i protokollet bör fokusera på att använda material som kan vara mindre attraktivt för björnar eller placera testdynorna på olika höjder. En begränsning med denna metod för att testa är att den inte bör användas i områden som inte redan har åtminstone en lätt bok skala angrepp, för att undvika risken för spridning av bok bark sjukdom.
Nyttan av denna teknik är att den kan användas för att bedöma föräldra prestanda som en del av ett avelsprogram. För tester sådan avkomma stränga kriterier för skala-motstånd brukar följas, vilket gör att endast en vuxen och noll t.ex.g kluster som kriterier för motstånd. Med hjälp av dessa riktlinjer för att välja föräldrar, bör andelen resistenta avkomma bli ca 50%, vilket är en avsevärd förbättring jämfört med populations frö 15. Men för markförvaltningsändamål kan det vara önskvärt att använda mindre stränga kriterier för att behålla träd eftersom träden som stöder en låg skala insekter kan förbli relativt friska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt stöd från US Forest Service Forest hälsoskydd utvärdering Övervakning och Special Technology Development Program som har stött utvecklingen, modifiering och tillämpning av det protokoll som beskrivs här för att hitta träd som är resistenta och mottagliga för bok skala insekt. Vi är också tacksamma för Holden Arboretum, Kirtland, OH, för deras fortsatta samarbete och stöd av vår amerikanska bok motstånds screeningprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
- Houston, D. R. A technique to artificially infest beech bark with the scale, Cryptococcus fagisuga (Lindinger). U.S. Forest Service. , Northeastern Forest Experiment Station. Broomhall, PA. (1982).
- Houston, D. R. American beech resistance to Cryptococcus fagisuga. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 38-42 (1983).
- Ehrlich, J. The beech bark disease: a nectria disease of Fagus, following Cryptococcus fagi. 10, 593-692 (1934).
- Papaik, M. J., Canham, C. D., Latty, E. F., Woods, K. D. Effects of an introduced pathogen on resistance to natural disturbance: beech bark disease and withdrow. 35, 1832-1843 (2005).
- Miller-Weeks, M. Current status of beech bark disease in New England and New York. Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 21-23 (1983).
- Houston, D. R. Beech bark disease: The aftermath forests are structured for a new outbreak. J. For. 73, 660-663 (1975).
- Twery, M. J., Patterson, W. A. Variations in beech bark disease and its effects on species composition and structure of northern hardwood stands in central New. 14, 565-574 (1984).
- Jakubus, W. J., McLaughlin, C. R., Jensen, P. G., McNulty, S. A., et al. Alternate year beechnut production and its influence on bear and marten populations. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 79-87 (2005).
- Koch, J. L., Carey, D. W., Mason, M. E., Nelson, C. D. Assessment of beech scale resistance in full- and half-sib families. Can. J. For. Res. 40, 265-272 (2010).
- Koch, J. L. Beech bark disease: The oldest “new” threat to American beech in the United States. Outlooks Pest Manag. 21, 64-68 (2010).
- Koch, J. L., Mason, M. E., Carey, D. W., et al. Screening for resistance to beech bark disease: improvements and results from seedlings and grafted field selections. Proceedings of the 4th International Workshop on Genetics of Host-Parasite Interactions in Forestry. Palmieri, K., et al. , U.S. Forest Service, Pacific Southwest Research Station. Albany, CA. (2012).
- Leak, W. B. Fifty year impacts of the beech bark disease in the Bartlett Experimental Forest, New Hampshire. Northern J. Appl. For. 23, 141-143 (2006).
- Koch, J. L., Carey, D. W., et al. Controlled cross-pollinations with American beech trees that are resistant to beech bark disease. Proceedings of the 14th Central Hardwood Forest Conference. Yaussy, D. A., et al. , U.S. Forest Service, Northeastern Research Station. 358-364 (2004).
- Carey, D. W., Mason, M. E., Bloese, P., Koch, J. L. Hot callusing for propagation of American beech by grafting. HortSci. 48, 620-624 (2013).
- Koch, J. L., Carey, W. W., et al. The genetics of resistance of American beech to beech bark disease: knowledge through 2004. Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 98-105 (2005).
