Summary
Doença casca Beech é iniciada através da alimentação atividades do inseto escala de faia que criar pontos de entrada de fungos na casca. Árvores que são resistentes ao inseto escala também são resistentes às doenças. Aqui apresentamos o protocolo que temos desenvolvido para a tela faias individuais de resistência à escala de faia.
Abstract
Beech doença casca (BBD) resulta em altos níveis de mortalidade inicial, deixando para trás árvores sobreviventes que estão muito enfraquecidos e deformados. A doença é iniciada pela alimentação de actividades da cochonilha faia invasiva, Cryptococcus fagisuga, o que gera os pontos de entrada para a infecção por uma das espécies Neonectria de fungo. Sem infestação escala, há pouca oportunidade para a infecção fúngica. Usando ovos escala para infestar artificialmente árvores saudáveis em povoamentos fortemente impactadas BBD demonstrado que essas árvores eram resistentes à parcela inseto escala do complexo de doenças 1. Aqui apresenta-se um protocolo que temos desenvolvido, com base na técnica de infestação artificial de Houston 2, o qual pode ser utilizado para rastrear para árvores de escala-resistente no campo e em pequenas plântulas envasadas e enxertos. A identificação de árvores de escala-resistente é uma componente importante da gestão da BBD através da árvoreprogramas de melhoria e manipulação silvicultural.
Introduction
Doença casca Beech (BBD) teve um impacto negativo sobre a faia americana na América do Norte desde a introdução do inseto escala faia invasivo, Cryptococcus fagisuga, na província canadense de Nova Escócia, no final de 1890 3. Este complexo de insetos-doença é iniciada quando o inseto escala faia insere seu estilete alimentação na casca criando pequenas fissuras que fornecem entrada para a infecção por uma das espécies de fungos Neonectria (Neonectria ditissima ou Neonectria faginata). Tal como os micélios fúngicos crescer, grandes áreas de tecido podem morrer, eventualmente anelamento completamente a árvore. Os danos da doença enfraquece a árvore, tornando-se propenso à rotura no 4 ventos fortes. Os níveis de mortalidade na primeira onda da doença foram relatados para ser tão alta quanto 50% 5. Árvores sobreviventes são muitas vezes deformado severamente como cancros formar reduzindo o valor da árvore como um produto de madeira.0; Essas árvores têm uma propensão para o root-brotação que leva à formação de "moitas faia" que impedem outras espécies mais desejáveis de estabelecer, reduzindo o valor econômico e ecológico do stand 6. Embora a doença de casca de faia não é susceptível de conduzir à extinção da faia americana, altera ficar composição e saúde levando a uma diminuição nos alimentos e habitat para a vida selvagem 7,8.
Em povoamentos afectados por BBD há muitos anos, as árvores que permanecem livres de quaisquer sintomas da doença têm sido relatados. Ensaios inoculação artificial têm demonstrado que estas árvores são resistentes ao inseto escala 2. Sem infestação escala, há poucas oportunidades para infecção Neonectria, minimizando o impacto do fungo. Mortalidade em grande escala em faia americano devido à infecção Neonectria na ausência de infestação de escala antes nunca temforam relatados, por isso os resultados de resistência a insectos escala faia em resistência à BBD.
Pesquisas recentes sobre a gestão de BBD centrou-se na identificação, propagação, reprodução e retenção de faias americanas com resistência ao inseto escala de faia. Estudos genéticos mostraram que a resistência ao inseto escala é hereditária e cuidadosa seleção e melhoramento de árvores resistentes podem resultar em melhorias significativas em uma única geração 9. Este achado tem alimentado os esforços de gestores estaduais e floresta nacional nos Estados Unidos para estabelecer pomares regionais de sementes de faia americano resistente para fornecer uma fonte de diversidade genética de sementes resistentes BBD para plantios de restauração 10,11. A pesquisa também indicou que a manipulação genética silvicultural de suporte através da remoção de árvores susceptíveis e retenção de árvores resistentes podem resultar em stand melhoria 9,12. </ P>
Gestão de BBD através de atividades de melhoria de árvores ou através da realização de prescrições silviculturais requer a capacidade de selecionar para e distinguir entre árvores escala resistentes e suscetíveis de faia. Os métodos aqui apresentados foram adaptados a partir de um método introduzido pela primeira vez por Dave Houston para inocular artificialmente mudas com ovos escala faia 1. O método pode ser utilizado como uma ferramenta de rastreio para identificar loci característica quantitativa (QTL) associado com a resistência ou para distinguir entre mudas vasos resistentes e sensíveis ou rametes enxertados em estudos genéticos. Alternativamente, ele pode ser usado para o rastreio de árvores adultas no campo para identificar plantas resistentes para o desenvolvimento de um pomar de sementes, ou a retenção no campo. Árvores sensíveis, podem ser identificados e removidos para minimizar os impactos das doenças.
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Protocol
Um material vegetal:. Mature Campo árvores, vasos de mudas, ou vasos de Enxertos
- Para os testes de campo, selecione árvores americanos saudáveis maduros faia que não apresentem sinais de infestação de escala ou de doença para os testes de resistência possível. Visivelmente também terão de ser identificado para ser utilizado como um controlo (Figura 1) árvores susceptíveis.
- Para testar mudas ou enxertos de vasos, recolher e germinar frutos da faia, conforme descrito no Koch & Carey, 2004 ou descendente enxerto, conforme descrito no Carey et al, 2013.
- Crescer mudas ou enxertos em envasamento mix solo com 47 g de micronutrientes, 477 g fertilizante de liberação lenta 15N-3.9P-9.9K, 700 g grosseiro perlita e 75 g de sulfato de alumínio por 2,8 cu. saco de pé. Se necessário mais tarde na estação de crescimento, fertilizar plantas semanais com solúvel 17N-1.3P-14.1K a 200 ppm de nitrogênio.
- Durante a estação de crescimento, manter as plantas em uma casa de sombra. Permitem que as plantas vão dormentes fora no outono antes de movê-lospara uma instalação de armazenamento com temperatura controlada (~ 4 ° C) a partir de novembro a abril.
2. Recolha de Beech Escala Ovos
- Em um estande BBD-infestado, inspecionar árvores altamente infestados (facilmente identificados pela sua "caiada" aparência, Figura 1A), com uma lupa de mão para confirmar a presença de ovos, normalmente abundantes a partir de meados de julho a meados de agosto.
- Use um pincel para escovar suavemente os pedaços de cera branca de cochonilhas de adultos, ovos e outros detritos, em um saco lacrado coleção um galão de plástico (Figura 1B). Colete de um mínimo de três árvores diferentes de pelo menos 12 m de distância.
- Se necessário, armazenar os ovos no saco de recolha selado durante até duas semanas a 4 ° C. Um pequeno pedaço de fita (2,5 cm quadrados) de espuma de polietileno com amortecimento para dentro do saco, para impedir que os ovos de secar.
- Para separar os ovos escala (0,15 x 0,25 mm) do que os adultos (0,60 mm) e debris, a construção de um peneiro utilizando uma peça curta de 2 'de tubo de PVC e de um acoplamento para suportar uma peça quadrada de 250 micra de malha de nylon (Figura 2).
- Esvaziar a mistura de adultos, cera, ovos e detritos a partir do saco de recolha para o crivo e utilizar um pequeno pincel de pintura para estimular suavemente os ovos para passar através da malha para uma placa de Petri de vidro abaixo. Pratos de plástico de Petri devem ser evitados porque eles detêm eletricidade mais estática, tornando-se difícil de mover os ovos. Ovos antes e após crivagem são mostrados na Figura 3.
- Ovos purificada pode ser armazenada na caixa de Petri, a 4 ° C durante pelo menos uma semana. Para evitar que os ovos de secar, cole um pedaço úmido de espuma para a tampa e lacre com Parafilm.
3. Ovo Viabilidade Ensaios
- Para avaliar a viabilidade do ovo, com uma seringa de 10 cc para aplicar um anel fino de geleia de petróleo em torno da circunferência da parte inferior de uma placa de Petri de 60 milímetros de vidro (Figura 4A
- Transferir cerca de 100 ovos para o centro do anel, coloque a tampa sobre a placa de Petri e selar com Parafilm. Permitir que a placa de Petri selado a permanecer sem perturbação à temperatura ambiente durante 2 semanas, ou 3 semanas, se os ovos foram armazenados a 4 ° C antes de se iniciar o ensaio.
- Eclosão das ninfas vai ficar preso no vaselina e pode ser facilmente contado, e ovos vazias são facilmente distinguidos dos ovos não eclodidos por sua cor e brilho (Figura 4B). Calcular a viabilidade através da divisão do número de ninfas por a soma dos ovos vazios mais os restantes ovos completos. Boa viabilidade deve ser em 75% a 90% de ovos eclodidos gama.
4. Screening Resistência Escala de Grande Mature Faias no Campo
- Para um teste quantitativo, conte a 500 ovos usando um microscópio de dissecação e usando uma pequena espátula polvilhe-os suavemente em todo o centro de um pré-umedecido, de células abertas de 10 x 15 x 1.3 cm rectângulo de espuma de polietileno. Paraamortecer espuma, molhá-lo, em seguida, espremer o máximo de água possível. Para um teste qualitativo, 500 ovos pode ser contado para fora e colocados em um pequeno frasco de vidro e uma linha de "enchimento" desenhado que pode ser usado para medir lotes adicionais de cerca de 500 ovos.
- Coloque a almofada de espuma para a árvore de teste com o lado do ovo virado contra a casca. Segure o disco no lugar com uma corda, corda, barbante ou fio de hardware plástico revestido. De plástico ou de material à base de metal que deve ser usado ao invés de materiais de fibras naturais, que são mais facilmente eliminado por animais selvagens.
- Linha de cima e dos lados de um cm pedaço de vapor permeável envoltório casa à prova de água com adesivo de silicone de acetato com base pré-cortado 23 x 30 e coloque-a sobre a almofada de teste de espuma. Pressionar as bordas do envoltório casa da árvore para criar um selo à prova de água. Coloque fio de nylon ou arame revestido de plástico hardware ao redor da árvore e da casa envoltório, para segurá-la no lugar, enquanto os conjuntos adesivas (Figura 5).
- Coloque um mínimo de doiscompressas de teste em cada árvore de ensaio, de preferência, em lados opostos do fuste. Em cada local, coloque almofadas de teste em pelo menos duas árvores suscetíveis (com infestação de escala natural, óbvio) como controle. Antes de colocar as almofadas de teste em árvores de controle, remova quaisquer insetos ou ovos escala que ocorrem naturalmente usando uma escova de cerdas firmes.
Nota: as almofadas de espuma com ovos também pode ser colocado em árvores com o objectivo de ovos escala criação, o que pode ser particularmente útil em zonas onde o nível de infestação é baixo.
5. Screening Resistência Escala de vasos de mudas ou enxertos
- Para o teste, selecione árvores em vasos com diâmetro mínimo de 1 cm (pinça 5 cm acima linha do solo), que são altos o suficiente para ter pelo menos 2 almofadas de teste separados colocadas sobre eles. Podar pequenos ramos laterais quando necessário para dar espaço para as almofadas de teste.
- Use um microscópio de dissecação para contar a 150 ovos e espalhá-los ao longo de um pré-cortados e umedecido 2,5 x 7,6 x 1,3 centímetros polyethy de células abertasalmofada de espuma lene.
- Cole a almofada de espuma de mudas com o lado do ovo contra a casca, usando o fio revestido de plástico. Enrole um pequeno quadrado de casa envoltório ao redor da muda logo acima da espuma e selá-lo com silicone à base de acetato (Figura 6A).
- Incluir conhecido famílias suscetíveis de mudas ou enxertos como controles.
6. Coleta de Dados
Nota: Cerca de 52-57 semanas após a colocação dos blocos de espuma e ovos nas árvores de teste, os dados podem ser coletados. É importante que este não é feito até adultos após ter começado a pôr ovos de modo a que a sua capacidade para reproduzir pode ser determinada. Em algumas árvores resistentes, não é incomum ver um pequeno número de adultos, mas sem estabelecer reprodução ocorrendo.
- Remova cuidadosamente a almofada de espuma e contar o número de cochonilhas adulto estabelecidos na casca usando uma lente mão ou lupa (10X).
- Quando a almofada de espuma é removido, ele não é uncommon para alguns adultos ea maioria dos aglomerados de ovos para ser puxado para fora da árvore com a espuma (ver Figura 7). Usando um microscópio de dissecação, a contagem dos aglomerados de ovos e adultos que tenham permanecido ligado à almofada de espuma.
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Representative Results
A Figura 6 mostra uma plântulas resistentes (C) e duas mudas susceptíveis (D, E) exibem diferentes graus de susceptibilidade. Um exemplo do que uma árvore madura susceptível parece 57 semanas após o teste de infestação artificial foi configurado é mostrado na Figura 5B. Quando a espuma é retirado da árvore, não é incomum para cochonilhas e seus cachos de ovos para permanecer preso para a espuma, como mostrado na Figura 7, que é por isso que é essencial para coletar dados, tanto da árvore ea almofada de espuma .
A Figura 8 ilustra o número médio de insetos adultos estabelecidos por cada 100 ovos em árvores infestadas artificialmente em dois stands diferentes, uma na Floresta Nacional de Allegheny (ANF), na Pensilvânia e outro em Ludington State Park (LSP), Michigan. Ambas as arquibancadas estavam infestadas de BBD e em cada estande, um conjunto de árvore saudávels foi identificado (LSP resistente e resistente ANF) e determinado para ser clonal com base na análise do ADN (dados não apresentados). Um cluster clonal de árvores BBD susceptíveis também foi identificada em LSP (LSP Suscetível), mas no ANF cinco árvores suscetíveis distintas foram utilizadas (ANF suscetível). Dentro e entre grupos clonais, tamanho variado, com DAP variando 2,1-12,8 polegadas. Figura 8 mostra que, embora haja uma grande variação no número de adultos estabelecidos nas árvores suscetíveis, são detectadas diferenças claras entre as árvores suscetíveis e resistentes. Houve pouca variação no número de adultos em ambas as aglomerados resistentes em relação às árvores susceptíveis. No aglomerado resistente ANF, todos os 12 clones que foram testados não adultos, ao passo que no painel resistente LSP alguns clones tinham um pequeno número de adultos. No entanto, não houve sobreposição do desvio padrão da média das árvores resistentes e sensíveis em ambos os locais.
A variaçãoção no número de adultos em árvores relação clonal em LSP (LSP Suscetível) é maior do que o observado nas árvores suscetíveis ANF (ANF) Suscetíveis apesar do fato de que essas árvores não são clonal e são geneticamente diferentes. Testes de viabilidade (dados não mostrados) indicam esta variação não é devido às grandes diferenças na viabilidade dos ovos. A variação é provavelmente devido a diferenças genéticas e ambientais e ilustra a importância de se ter controles suscetíveis de referência em cada local de teste.
Figura 1. Recolha de ovos de escala de árvore americano infestado de escala de faia. Uma árvore americano altamente infestados escala de faia. B.. Um pincel é usado para escovar cochonilhas adultas e seus ovos em um saco de armazenamento selado abaixo.
Figura 2. Construção de crivo para separar os ovos de escala a partir de adultos e de outros contaminantes. Um 4 x 4 polegadas de pré-corte quadrado de 250 micra de malha de nylon é colocado entre um pedaço de 4 cm de tubo de PVC de 2 "de diâmetro e um acoplamento para formar o peneiro .
Figura 3. Ovos escala antes (A) e depois (B) de crivagem. Uma. Mistura de cochonilhas adultos, ovos e detritos visto sob microscópio de dissecação após a coleta de árvore. B. Ovos purificadas obtidas após a passagem através do crivo.
Teste de viabilidade Egg Figura 4.. Uma. Anel de petróleo em placa de Petri para ninfas armadilha após a eclosão. B. Formulário I ninfa sobre o direito de um não-eclodidos de ovos. C. Ovos eclodidos são de cor mais clara e translúcida em relação a ovos amareladas opacas antes de chocar.
Figura 5. Infestação artificial de faia americana madura no campo. A Casa envoltório. Afixada com silicone à base de acetato para evitar o excesso de umidade se acumular na almofada de espuma com ovos por baixo. B. Casa envoltório foi removido e almofada de espuma desmascarado 52 semanas após a colocação para revelar scale colonização abaixo nesta árvore suscetível.
Figura 6. Infestação artificial de vasos de mudas de faia americanos. A. Espuma com ovos ligados ao tronco B. Casa envoltório cobertura de espuma.. C. Foam removido após 56 semanas de uma muda resistente, D. uma muda suscetíveis, E. e uma muda altamente suscetíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Comparação entre o número médio de insetos adultos estabelecidos em árvores infestadas artificialmente em dois suportes separados. Árvores resistentes na Floresta Nacional de Allegheny, PA (ANF) e em Ludington State Park, MI (LSP) são comparadas com árvores de controle suscetíveis. O número de árvores testados em cada grupo está listado em parênteses a seguir, e as contagens de adultos por 100 ovos foram aplicados na média de todas as árvores dentro do grupo. A barra representa um desvio padrão a partir do mean.
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Discussion
Os passos críticos necessários para o sucesso deste ensaio incluem a execução de um teste de viabilidade sobre os ovos e a utilização de controlos sensíveis em cada local de ensaio, e com materiais de vasos. Também é importante o uso de mais de um bloco de teste por árvore ou mudas. Descobrimos que, tanto no campo e em testes mais controlados sobre vasos de plantas, uma fonte freqüente de erro pode ser falha pad. Por exemplo, no campo, mesmo com a modificação de que cobre a almofada de ensaio com o envoltório da casa para impedir a humidade em excesso, a água que flui para baixo a haste pode favorecer um lado de uma árvore e resultar na perda de um bloco de teste.
A fim de obter resultados precisos, é importante tanto para marcar a superfície de árvore sob a almofada e a própria almofada de espuma. Em adição aos adultos e aglomerados de ovos, a única fase móvel no ciclo de vida escala chamada forma I ninfas, também podem ser observados. Estas ninfas móveis, eventualmente,inserir o estilete alimentação na casca da árvore, tornando-se uma ninfa forma II. Ambos os tipos de ninfas são muito semelhantes em tamanho e aspecto das pequenas, de forma oval ovos, ao passo que os adultos maiores têm uma forma mais esférica. O formulário I ninfa é distinguível de ovos, porque tem os olhos vermelhos e está se movendo, mas este movimento faz começar uma contagem precisa muito difícil. A ninfa forma II pode ser facilmente confundido com um ovo, especialmente durante a gravação de dados no campo com uma lente de mão ou lupa e não um microscópio. Por essas razões, recomendamos contando apenas os adultos e do número de clusters de ovos, o que temos encontrado nos dá dados reprodutíveis sobre a capacidade de uma árvore de teste para apoiar a auto-sustentação infestação escala. Trabalhos anteriores mostraram que a contagem dos adultos está altamente correlacionada com o número do grupo de ovos 9. Em muitos casos, pode ser suficiente apenas contar adultos; no entanto, temos observado alguns casos onde os adultos são capazesde estabelecer em certos genótipos de árvores, mas não produzem ovos. Sem a capacidade de se reproduzir, a infestação escala não seria sustentável nessas árvores.
Uma queda inesperada deste ensaio quando realizado no campo é a atratividade das almofadas de teste para ursos. As eventuais modificações no protocolo deve se concentrar na utilização de materiais que podem ser menos atraente para os ursos ou colocar as almofadas de teste em diferentes alturas. Uma limitação para este método de teste é que ele não deve ser usado em áreas que ainda não têm, pelo menos, uma infestação de escala faia luz, para evitar o risco de propagação da doença casca de faia.
A utilidade desta técnica é que ele pode ser utilizado para avaliar o desempenho dos pais, como parte de um programa de reprodução. Para tal descendência testa critérios rigorosos para a escala de resistência são normalmente seguidas, permitindo que apenas um adulto e zero, por exemplo,agrupamentos de g como critérios para a resistência. Usando estas diretrizes para selecionar os pais, a proporção de descendentes resistentes deve ser de aproximadamente 50%, o que é uma melhoria considerável em relação as sementes de polinização aberta 15. No entanto, para fins de manejo da terra pode ser desejável usar critérios menos rigorosos para manter árvores desde árvores que suportam um nível baixo de cochonilhas podem permanecer relativamente saudável.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem o financiamento do Monitoramento do Serviço Florestal de Avaliação de Proteção à Saúde EUA Florestal e programas de desenvolvimento tecnológico especiais que apoiaram o desenvolvimento, modificação e aplicação do protocolo descrito aqui para identificar árvores que são resistentes e suscetíveis ao inseto escala de faia. Também somos gratos ao Holden Arboretum, Kirtland, OH, por sua contínua parceria e apoio do nosso programa de triagem resistência faia americano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
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