Summary
Enfermedad de la corteza de la haya es iniciada por la alimentación de las actividades de la cochinilla de haya que crear puntos de entrada de hongos en la corteza. Los árboles que son resistentes a la cochinilla son también resistentes a las enfermedades. Aquí presentamos el protocolo que hemos desarrollado para detectar árboles individuales de haya para la resistencia a escala de haya.
Abstract
Enfermedad de la corteza de la haya (BBD) se traduce en altos niveles de mortalidad inicial, dejando detrás de los árboles sobrevivientes que se debilitan en gran medida y deformadas. La enfermedad se inicia por la alimentación de las actividades de la insecto de la escala de haya invasiva, Cryptococcus fagisuga, que crea puntos de entrada para la infección por una de las especies Neonectria de hongo. Sin infestación de escala, hay pocas oportunidades para la infección por hongos. El uso de huevos de escala para infestar artificialmente árboles sanos en rodales muy BBD impactadas demostró que estos árboles fueron resistentes a la porción de insectos escala del complejo de la enfermedad 1. Aquí se presenta un protocolo que hemos desarrollado, basado en la técnica de la infestación artificial por Houston 2, que se puede utilizar para la detección de árboles escala resistentes en el campo y en las plantas de semillero y los injertos en macetas pequeñas. La identificación de los árboles escala resistente es un componente importante de la gestión de BBD través del árbolprogramas de mejora y manipulación silvicultural.
Introduction
Enfermedad de la corteza de la haya (BBD) ha tenido un impacto negativo en haya americana en América del Norte desde la introducción de la cochinilla de haya invasivo, Cryptococcus fagisuga, en la provincia canadiense de Nueva Escocia a finales del decenio de 1890 3. Este complejo de insectos de la enfermedad se inicia cuando el insecto de la escala de haya inserta su estilete de alimentación en la corteza de la creación de pequeñas fisuras que proporcionan entrada para la infección por una de las especies Neonectria de hongo (ditissima Neonectria o Neonectria faginata). A medida que crecen los micelios de hongos, grandes áreas de tejido puede morir, con el tiempo que rodea completamente el árbol. El daño causado por la enfermedad debilita el árbol, por lo que es propenso a romperse con vientos fuertes 4. Los niveles de mortalidad en la primera ola de la enfermedad se han notificado a ser tan alta como 50% 5. Los árboles supervivientes a menudo son severamente deformados como chancros forman la reducción de valor del árbol como un producto de madera.0; Estos árboles tienen una propensión a la raíz-brote que conduce a la formación de "matorrales de haya" que impiden a otras especies más deseables desde el establecimiento, lo que reduce el valor económico y ecológico de la posición 6. Aunque la enfermedad de la corteza del haya, no es probable que conduzca a la extinción de la haya americana, que altera la composición de pie y la salud que lleva a una disminución de alimento y hábitat para la vida silvestre 7,8.
En las masas afectadas por BBD en muchos años, se ha informado de árboles que permanecen libres de cualquier síntoma de la enfermedad. Ensayos de inoculación artificial han demostrado que estos árboles son resistentes al insecto escala 2. Sin infestación de escala, hay pocas oportunidades para la infección Neonectria, minimizando el impacto del hongo. La mortalidad a gran escala en madera de haya americana debido a la infección Neonectria en ausencia de infestación escala antes nunca tieneha informado, por lo que la resistencia a los resultados de insectos escala de haya en la resistencia a la BBD.
Las investigaciones recientes sobre la gestión de BBD se ha centrado en la identificación, la propagación, la cría y la conservación de los árboles de haya americana con resistencia al insecto escala de haya. Los estudios genéticos han demostrado que la resistencia al insecto escala es heredable y cuidadosa selección y mejora genética de los árboles resistentes puede resultar en una mejora significativa en una sola generación 9. Este hallazgo ha impulsado los esfuerzos de los administradores estatales y nacionales forestales en los Estados Unidos para establecer huertos semilleros regionales de haya americana resistente para proporcionar una fuente de semilla BBD resistentes genéticamente diversas para las plantaciones de restauración 10,11. La investigación también ha indicado que la manipulación genética silvícola de soporte por la remoción de los árboles susceptibles y retención de árboles resistentes puede resultar en soporte 9,12 mejorar. </ P>
Gestión de BBD a través de actividades de mejoramiento de árboles o por medio de la realización de prescripciones silvícolas requiere la capacidad de seleccionar y distinguir entre árboles de hayas escala resistentes y susceptibles. Los métodos que aquí se presentan han sido adaptados de un método introducido por primera vez por Dave Houston para inocular artificialmente plántulas con huevos escala de haya 1. El método se puede utilizar como una herramienta de detección para identificar los loci de rasgos cuantitativos (QTL) asociados con la resistencia o para distinguir entre las plantas de semillero en macetas resistentes y susceptibles o rametos injertados en los estudios genéticos. Alternativamente, puede ser utilizado para el cribado de árboles maduros en el campo para identificar árboles resistentes para el desarrollo huerto de semillas, o la retención en el campo. Árboles susceptibles pueden ser identificados y eliminados para minimizar el impacto de la enfermedad.
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Protocol
1 Planta Material:. Campo árboles maduros, en maceta plántulas o maceta Injertos
- Para las pruebas de campo, seleccione hayas maduros sanos estadounidenses que no muestran signos de infestación escala o enfermedad para la prueba de resistencia posible. Visiblemente también tendrán que ser identificados para ser utilizado como un control (Figura 1) árboles susceptibles.
- Para la prueba de plántulas en maceta o injertos, recoger y germinar hayucos como se describe en Koch y Carey, 2004 o descendiente del injerto como se describe en Carey et al, 2013.
- Crezca las plantas de semillero o injertos en macetas mezcla suelo enmendado con 47 g de micronutrientes, 477 g fertilizante de liberación lenta 15N-3.9P-9.9K, 700 g de perlita gruesa y 75 g de sulfato de aluminio por 2.8 cu. bolsa de pies. Si es necesario más adelante en la temporada de cultivo, fertilizar las plantas semanalmente con solubles 17N-1.3P-14.1K en 200 ppm de nitrógeno.
- Durante la temporada de crecimiento, mantener las plantas en una casa de sombra. Permita que las plantas en estado latente fuera en el otoño antes de que se muevana una instalación de almacenamiento de temperatura controlada (~ 4 ° C), de noviembre a abril.
2. Colección de Beech Escala Huevos
- En un stand infestado de BBD, inspeccione los árboles muy infestados (fácilmente identificados por su "blanqueado" la apariencia, la Figura 1A) con una lupa de mano para confirmar la presencia de huevos, normalmente abundantes desde mediados de julio hasta mediados de agosto.
- Utilice una brocha para cepillar suavemente los grumos de cera blanca de cochinillas adultas, huevos y otros restos, en una bolsa sellable colección un galón de plástico (fig. 1B). Reunir a partir de un mínimo de tres árboles diferentes, al menos, 12 m de distancia.
- Si es necesario, guarde los huevos en la bolsa de recolección sellado por hasta dos semanas a 4 ° C. Pegue un pedazo pequeño (2,5 cm cuadrados) de espuma de polietileno húmedo en el interior de la bolsa para evitar que los huevos se sequen.
- Para separar los huevos de escala (0,15 x 0,25 mm) de los adultos (0,60 mm) y debris, la construcción de un tamiz utilizando una pieza corta de 2 "cañería de PVC y un acoplamiento para soportar una pieza cuadrada de 250 micras de malla de nylon (Figura 2).
- Vaciar la mezcla de los adultos, cera, huevos, y los residuos de la bolsa de recogida en el tamiz y utilizar un pequeño pincel para fomentar suavemente los huevos para pasar a través de la malla en una placa de Petri de vidrio a continuación. Platos de plástico Petri deben evitarse porque tienen más electricidad estática, por lo que es difícil de mover los huevos. Los huevos antes y después de tamizado se muestran en la Figura 3.
- Huevos purificadas se pueden almacenar en la placa de Petri a 4 ° C durante al menos una semana. Para evitar que los huevos se seque, pegue un pedazo húmedo de espuma para la tapa y el sello con Parafilm.
3. Huevo de viabilidad Ensayos
- Para evaluar la viabilidad del huevo, usar una jeringa de 10 cc a aplicar un delgado anillo de vaselina alrededor de la circunferencia de la parte inferior de una placa de Petri de 60 mm de vidrio (Figura 4A
- Transferir unos 100 huevos al centro del ring, coloque la tapa en la caja de Petri y selle con Parafilm. Dejar que la cápsula Petri sellada a permanecer en reposo a temperatura ambiente durante 2 semanas, 3 semanas o si los huevos se almacenaron a 4 ° C antes de comenzar el ensayo.
- Ninfas eclosionadas se atascarse en la vaselina y pueden ser contados fácilmente, y los huevos vacíos se distinguen fácilmente de los huevos sin eclosionar por su color y brillo (Figura 4B). Calcular la viabilidad dividiendo el número de ninfas por la suma de los huevos vacíos más los huevos completos restantes. Buena viabilidad debe estar en el rango de los huevos 75% a 90% eclosionado.
4. Resistencia Escala Proyección de grande maduro Hayas en el campo
- Para una prueba cuantitativa, contar en 500 huevos utilizando un microscopio de disección y el uso de una pequeña espátula espolvorear suavemente a través del centro de un predampened, de celda abierta de 10 x 15 x 1,3 cm rectángulo de espuma de polietileno. Aamortiguar espuma, mojarlo y luego exprima el agua tanto como sea posible. Para una prueba cualitativa, 500 huevos se pueden contar y se coloca en un pequeño frasco de vidrio y una línea de "relleno" dibujado que se puede utilizar para medir los lotes adicionales de aproximadamente 500 huevos.
- Coloque la almohadilla de espuma en el árbol de prueba con el lado del huevo frente contra la corteza. Sostenga la almohadilla en su lugar con una cuerda, cuerda, bramante o plástico recubierto de alambre del hardware. Plástico o material metálico a base deben utilizarse en lugar de los materiales de fibra naturales que son más fácilmente barridos por la fauna silvestre.
- Línea de la parte superior y los lados de un cm pedazo de vapor permeable casa de abrigo impermeable con acetato adhesivo a base de silicona precortadas 23 x 30 y colocarlo sobre la almohadilla de espuma del ensayo. Presione los bordes de la envoltura de la casa en el árbol para crear un sello impermeable. Coloque la guita de nylon o alambre recubierto de plástico de hardware alrededor del árbol y la casa de abrigo, para mantenerlo en su lugar mientras que el adhesivo fragüe (Figura 5).
- Coloque un mínimo de dosalmohadillas de análisis de cada árbol de prueba, preferiblemente en lados opuestos de la fuste. En cada sitio, coloque almohadillas de prueba en al menos 2 árboles susceptibles (con obvia infestación escala natural), como control. Antes de colocar los bloques de ensayo en los árboles de control, retire los insectos o huevos de escala que tienen lugar de forma natural con un cepillo de cerdas firmes.
Nota: Las almohadillas de espuma con los huevos también se pueden colocar en los árboles con el propósito de huevos escala de cría, que puede ser especialmente útil en áreas donde el nivel de infestación es baja.
5. Resistencia escala de cribado de plántulas en maceta o injertos
- Para las pruebas, seleccionar árboles en macetas con un diámetro mínimo de 1 cm (pinza 5 cm por encima de la línea del suelo) que son lo suficientemente alto como para tener por lo menos 2 almohadillas de análisis separadas puestas en ellos. Pode las ramas pequeñas laterales cuando sea necesario para dar cabida a las almohadillas de análisis.
- Utilice un microscopio de disección para contar 150 huevos y derrama sobre un precorte y humedecido 2,5 x 7,6 x 1,3 cm bolsas d de células abiertasalmohadilla de espuma lene.
- Coloque la almohadilla de espuma de plántulas con el lado del huevo contra la corteza, con alambre recubierto de plástico. Envuelva un pequeño cuadrado de envoltura de la casa alrededor de la plántula justo por encima de la espuma y sellarla con silicona a base de acetato (ver Figura 6 A).
- Incluir conocido familias plántulas susceptibles o injertos como controles.
6. Recogida de datos
Nota: Aproximadamente 52 a 57 semanas después de la colocación de las almohadillas de espuma y huevos en los árboles de las pruebas, los datos pueden ser recolectados. Es importante que esto no se realiza hasta después de adultos han empezado a poner huevos, para que su capacidad de reproducción se puede determinar. En algunos árboles resistentes, no es raro ver a un pequeño número de adultos a establecer, pero sin la reproducción se produzca.
- Retire con cuidado la almohadilla de espuma y contar el número de cochinillas adultas establecidos en la corteza usando una lupa o lente de aumento (10X).
- Cuando se retira la almohadilla de espuma, no es uncommon para algunos adultos y la mayoría de las masas de huevos para ser tirados fuera del árbol con la espuma (ver Figura 7). Usando un microscopio de disección, contar los grupos de huevo y adultos que han permanecido unido a la almohadilla de espuma.
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Representative Results
La figura 6 muestra una planta de semillero resistentes (C) y dos plantas de semillero susceptibles (D, E) que exhibe diferentes grados de susceptibilidad. Un ejemplo de lo que un árbol maduro susceptible parece a 57 semanas después de la prueba de infestación artificial fue creado se muestra en la Figura 5B. Cuando la espuma se desprendió del árbol, no es raro que las cochinillas y sus racimos de huevos para permanecer pegado a la espuma como se muestra en la Figura 7, por lo que es esencial para recopilar datos, tanto del árbol y la almohadilla de espuma .
La figura 8 ilustra el número medio de insectos adultos establecidos por cada 100 huevos en los árboles infestados artificialmente en dos stands diferentes, uno en el Bosque Nacional de Allegheny (ANF) en Pensilvania y la otra en el Parque Estatal de Ludington (LSP), Michigan. Ambos puestos estaban infestadas de BBD y en cada stand, un grupo de árboles sanoss se identificó (LSP Resistente Resistente y ANF) y se determinó que basado en el análisis clonal de ADN (datos no mostrados). Un grupo clonal de árboles BBD-susceptibles también fue identificado en LSP (LSP Susceptible) pero en el ANF se utilizaron cinco árboles susceptibles distintos (ANF Susceptible). Dentro y entre grupos clonales, tamaño variado, con DBH van 02.01 a 12.08 pulgadas. Figura 8 muestra que, aunque hay una gran cantidad de variación en el número de adultos establecidos en los árboles susceptibles, se detectan diferencias claras entre los árboles susceptibles y resistentes. Hubo menos variación en el número de adultos en ambos grupos resistentes relativos a los árboles susceptibles. En el clúster Resistente ANF, todos los 12 clones que se probaron no tenía los adultos, mientras que en el grupo Resistente LSP algunos clones tenían un pequeño número de adultos. Sin embargo, no hubo superposición en la desviación estándar de la media de los árboles resistentes y susceptibles en ambos sitios.
La variaciónción en el número de adultos en los árboles clonal relacionados en LSP (LSP Susceptible) es mayor que la observada en los árboles susceptibles ANF (ANF) Susceptibles a pesar de que estos árboles no son clonal y son genéticamente diferentes. Las pruebas de viabilidad (datos no mostrados) indican que esta variación no es debido a las grandes diferencias en la viabilidad de los huevos. La variación se debe probablemente a diferencias tanto genéticos y ambientales e ilustra la importancia de tener controles susceptibles para referencia en cada sitio de prueba.
Figura 1. Recolección de huevos de escala de árbol de haya americana escala infestadas. A. Árbol de haya americana pesadamente escala infestadas. B. Un pincel se utiliza para cepillar cochinillas adultas y sus huevos dentro de una bolsa de almacenamiento se puede sellar a continuación.
Figura 2. Construcción de tamiz para separar los huevos escala de los adultos y otros contaminantes. Un cuadrado precortado 4 x 4 pulgadas de 250 micras de malla de nylon se coloca entre una pieza de 4 pulgadas de tubería de PVC de 2 "de diámetro y un acoplamiento para formar el tamiz .
Figura 3. Huevos de escala antes (A) y después (B) de tamizado. A. Mezcla de cochinillas adultas, huevos y escombros se observa bajo un microscopio de disección después de la recogida del árbol. B. Huevos purificadas obtenidas después de pasar a través del tamiz.
Figura 4. Prueba de viabilidad de los huevos. A. Anillo del petróleo en placa de Petri para atrapar ninfas después de la eclosión. B. Formulario I ninfa a la derecha de una ONU eclosionadas del huevo. C. Huevos eclosionados son de color más claro y translúcido con relación a los huevos de color amarillento opacas antes de la eclosión.
Figura 5. Infestación artificial de haya americana madura en el campo. A. Casa envoltura fijada con silicona a base de etilo para prevenir el exceso de acumulación de humedad en el cojín de espuma con los huevos debajo. B. Envoltura House ha sido retirado y la almohadilla de espuma pelado detrás 52 semanas después de la colocación para revelar scale colonización por debajo de este árbol susceptible.
Figura 6. Infestación artificial de plantas de semillero en macetas de hayas americanas. A. Foam con huevos adheridos al tallo. Envoltura que cubre de espuma B. House. C. Espuma eliminado después de 56 semanas en una planta de semillero resistentes, D. una plántula susceptible, E. y una semilla altamente susceptibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 8. Comparación de la media de los insectos adultos establecidos en los árboles infestados artificialmente en dos soportes separados. Árboles resistentes en el Bosque Nacional de Allegheny, PA (ANF) y en el Parque Estatal de Ludington, MI (LSP) se comparan con los árboles sanos susceptibles. El número de árboles evaluados en cada grupo se indica entre paréntesis a continuación, y los recuentos de adultos por cada 100 huevos aplicados fueron en promedio en todos los árboles dentro del grupo. La barra representa una desviación estándar de la mean.
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Discussion
Los pasos críticos necesarios para el éxito de este ensayo incluyen la realización de una prueba de viabilidad sobre los huevos y el uso de los controles susceptibles en cada sitio de prueba, y con materiales de macetas. También es importante la utilización de más de una almohadilla de análisis por árbol o planta de semillero. Hemos encontrado que, tanto en el campo como en las pruebas más controladas en macetas con plantas, una fuente frecuente de error puede ser el fracaso de la almohadilla. Por ejemplo, en el campo, incluso con nuestra modificación de la cobertura de la almohadilla de ensayo con envoltura de la casa para evitar el exceso de humedad, el agua que fluye hacia abajo el vástago puede favorecer a un lado de un árbol y resultar en la pérdida de una almohadilla de análisis.
Con el fin de obtener resultados precisos, es importante anotar tanto la superficie del árbol debajo de la almohadilla y la almohadilla de espuma en sí. Además de los adultos y los grupos de huevo, la única fase móvil en el ciclo de vida escala llamada forma I ninfas, también se puede observar. Estas ninfas móviles eventualmenteinsertar su estilete de alimentación en la corteza del árbol, convirtiéndose en una ninfa de la forma II. Ambos tipos de ninfas son muy similares en tamaño y apariencia a los huevos pequeños, de forma ovalada, mientras que los adultos mayores tienen una forma más esférica. El formulario I ninfa es distinguible de los huevos, ya que tiene los ojos rojos y se mueve, pero este movimiento hace que conseguir una cuenta exacta muy difícil. La ninfa forma II puede ser fácilmente confundido con un huevo, sobre todo cuando se graban datos en el campo con una lupa o lupa y no un microscopio. Por estas razones, se recomienda contar sólo los adultos y el número de grupos de huevos, lo que hemos encontrado nos da datos reproducibles sobre la capacidad de un árbol de pruebas para apoyar la infestación escala de auto-sostenible. Trabajos anteriores han demostrado que el número de adultos está altamente correlacionado con el número de clúster de huevo 9. En muchos casos puede ser suficiente para contar sólo los adultos; Sin embargo, hemos observado algunos casos en que los adultos son capacesde establecer en ciertos genotipos de los árboles, pero no producen huevos. Sin la capacidad de reproducirse, la infestación escala no sería sostenible en estos árboles.
Una caída inesperada de este ensayo cuando se realiza en el campo es el atractivo de las almohadillas de ensayo a los osos. Las eventuales modificaciones al protocolo deberán centrarse en el uso de materiales que pueden ser menos atractivo para los osos o la colocación de los bloques de ensayo a diferentes alturas. Una limitación de este método de prueba es que no se debe utilizar en áreas que no dispongan de, al menos, una plaga de escala haya luz, para evitar el riesgo de propagación de enfermedad de la corteza de haya.
La utilidad de esta técnica es que puede ser utilizado para evaluar el rendimiento de los padres como parte de un programa de cría. Para tal progenie prueba criterios estrictos para la escala de resistencia son seguidos generalmente, permitiendo que sólo un adulto y cero por ejemploracimos g como criterios para la resistencia. Al seguir estas instrucciones para seleccionar a los padres, la proporción de la progenie resistente debe ser de aproximadamente 50%, lo que supone una mejora considerable con respecto a las semillas de polinización abierta de los 15. Sin embargo, para fines de manejo de la tierra puede ser deseable utilizar criterios menos estrictos para la retención de árboles ya que los árboles que soportan un nivel bajo de cochinillas pueden permanecer relativamente saludable.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen la financiación del Bosque EE.UU. Monitoreo Evaluación de Protección de la Salud del Servicio Forestal y programas especiales de desarrollo tecnológico que han apoyado el desarrollo, modificación y aplicación del protocolo descrito aquí para identificar los árboles que sean resistentes y susceptibles a la cochinilla de haya. También damos las gracias a la Holden Arboretum, Kirtland, Ohio, por su constante colaboración y apoyo de nuestro programa de detección de resistencia haya americana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
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