Summary

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Published: July 24, 2014
doi:

Summary

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Introduction

הקיבולת של hPSCs לבדל לכיוון רקמות בוגרות multilineage פתחה אפיקים חדשים לטיפול בחולים הסובלים ממחלות קשות הכרוכים בלב וכלי דם, כבד, לבלב, ומערכות נוירולוגיות 1-4. סוגי תאים שונים הנגזרים מhPSCs היינו גם מספקים פלטפורמות סלולריות חזקות לדוגמנות מחלה, הנדסה גנטית, הקרנת סמים, ו1,4 בדיקה טוקסיקולוגית. הנושא המרכזי המבטיח יישומים הקליניים ותרופתיים עתידם הוא הדור של מספרים גדולים של hPSCs קליני כיתה באמצעות תרבית תאים במבחנה. עם זאת, מערכות התרבות הנוכחיות הם או לא מספיק או מטבעו משתנה, הכוללים תרבויות ומזין ללא מזין שונות של hPSCs כמושבות 5,6.

צמיחת מושבה מסוג מניות hPSCs הרבה תכונות מבניות של מסת התאים הפנימית (ICM) של עוברי יונקים מוקדמים. ICM הוא נוטה להתמיין לשלוש ניבט שכבותבסביבה תאית, בשל קיומה של הדרגתיים איתות הטרוגנית. לכן, הרכישה של ההטרוגניות בהתפתחות עוברית מוקדמת נחשבת כתהליך הנדרש לבידול, אבל תכונה לא רצויה של תרבות hPSC. ההטרוגניות בתרבות hPSC מושרה לעתים קרובות על ידי אותות אפופטוטיים מוגזמים והתמיינות ספונטנית בשל תנאי גידול אופטימליים. כך, בתרבות של מושבה מסוג התאים הטרוגנית הם נצפו לעתים קרובות בפריפריה של המושבות 7,8. זה כבר גם הראה כי התאים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מושבות תגובות ההפרש תערוכה למולקולות איתות כגון BMP-4 9. יתר על כן, שיטות תרבות המושבה לייצר תשואות תא נמוכות, כמו גם שיעורי החלמה תא נמוך מאוד מהקפאה בשל שיעורי צמיחה בלתי נשלטים ואיתות אפופטוטיים מסלולי 6,9. בשנים האחרונות, תרבויות השעיה שונות פותחו עבור hPSCs culturing, particulקארלי להרחבה של כמויות גדולות של hPSCs ובמזין תנאים 6,10-13 ללא מטריצה. ברור שיש להם מערכות תרבות שונות יתרונות משלהם וחסרונות. באופן כללי, הטבע הטרוגנית של hPSCs מייצג את אחד החסרונות העיקריים בשיטות מושבה מסוג והתרבות מצטברת, שהם הכי מוצלח להעברת חומרי DNA ו-RNA לhPSCs להנדסה גנטית 6.

ברור, יש צורך הכרחי כדי לפתח מערכות חדשות הלעקוף כמה חסרונות של שיטות תרבות הנוכחיות. התגליות של מעכבי מולקולה קטנים (כגון מעכב ROCK Y-27632 וJAK מעכב 1) המשפרות את הישרדות תא בודד לסלול את הדרך לתרבות ניתק-hPSC 14,15. עם השימוש במולקולות קטנות אלה, יש לנו לאחרונה פיתחו שיטת תרבות המבוססת על סוג הלא מושבה צמיחה (מלח"י) של ניתק-hPSCs 9. שיטת התרבות החדשנית זו משלבת גם passaging תא בודד וצפיפות גבוההציפוי שיטות, מאפשר לנו לייצר כמויות גדולות של hPSCs הומוגנית תחת מחזורי צמיחה עקביים ללא פגמים בכרומוזומים עיקריים 9. לחלופין, תרבות לח"י עלולה להיות מיושמת עם מולקולות קטנות שונות ומטריצות מוגדרות (כגון laminins) על מנת לייעל את שיטת התרבות עבור יישומים רחבים. כאן, אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על תרבות לח"י ולהתוות נהלים מפורטים להנדסה גנטית. כדי להדגים את הרבגוניות של פרוטוקולים מלח"י, אנחנו גם נבדקו תרבות לח"י עם מעכבי ROCK מגוונים ועם איזופורם laminin אחת 521 (כלומר, LN-521).

Protocol

תרבות monolayer סוג הלא מושבה תא בודד מבוסס (מלח"י) של hPSCs. 1. הכנות הפוך 500 מיליליטר של מדיום לתרבות של fibroblasts העכבר העוברי (MEFs): מדיום DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו0.1 חומצות מ"מ שא…

Representative Results

סכימה כללית של תרבות לח"י איור 1 מייצג סכימת תרבות לח"י טיפוסית מראה את השינויים הדינמיים של hPSCs לאחר ציפוי תא בודד בצפיפות גבוהה בנוכחות מעכב ROCK Y-27632. שינויים מורפולוגיים אלה כוללים קשרים אינטר לאחר ציפוי, ?…

Discussion

ישנן שתי דרכים עיקריות לhPSCs התרבות במבחנה: תרבות קונבנציונלית מושבה מהסוג (של תאים במתקני האכלה או מטריצות תאיים) ותרבות השעיה של hPSCs כמו אגרגטים ללא ניזונים 6. המגבלות של שיטות תרבות הן המושבה מסוג וההשעיה כוללות הטרוגניות שנצברה ושינויים אפיגנטיים בירושה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

Materials

Countess automated cell counter   Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL  Model RX-650 X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL six-well plates  Becton Dickinson Labware 353046 Polystyrene plates 
DMEM Invitrogen Inc. 11965–092 For MEF medium
mitomycin C Roche  107 409 Mitotic inhibitor
Trypsin Invitrogen Inc. 25300-054 For MEF dissociation
DMEM/F12  Invitrogen Inc. 11330–032 For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium  Invitrogen Inc. 31985-062 For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS Invitrogen Inc. 16000–044 Component of MEF medium
Knockout Serum Replacer  Invitrogen Inc. 10828–028 KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids  Invitrogen  11140–050 NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine  Invitrogen  25030–081 Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements StemCell Technologies 5850 Animal protein-free
medium
TeSR2 & Supplements StemCell Technologies 5860 Xeno-free medium
β-mercaptoethanol  Sigma  7522 Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC
American Type Culture Collection (ATCC)  SCRC-1040 For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel BD Bioscience 354277 For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521 BioLamina LN521-02 Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic) R&D Systems, MN 223-FB Growth factor in hPSC medium
CryoStor CA10  StemCell Technologies 7930
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I EMD4 Biosciences 420099 An inhibitor of Janus kinase
Y-27632 EMD4 Biosciences 688000 ROCK inhibitor
Y-27632 Stemgent 04-0012 ROCK inhibitor
Y-39983 Stemgent 04-0029 ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane  Stemgent 04-0030 ROCK II inhibitor
Thiazovivin Stemgent 04-0017 A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer  BD Bioscience 352340 40-µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1°C Thermo Scientific  C6516F-1 “Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000  Invitrogen Inc. 11668-027 Transfection reagents
DharmaFECT Duo  Thermo Scientific T-2010-02 Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control Thermo Scientific IP-004500-01-05 Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNA Thermo Scientific  To be determined Lentiviral vector
pmaxGFP amaxa Inc (Lonza) Included in every transfection kit Expression plasmid for transfection control
4-Oct Santa Cruz Biotechnology sc-5279 Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1 Santa Cruz Biotechnology sc-21702 Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4 Santa Cruz Biotechnology sc-21704 Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60 Santa Cruz Biotechnology sc-21705  Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81 Santa Cruz Biotechnology sc-21706 Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51) Santa Cruz Biotechnology sc-8020 Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein Santa Cruz Biotechnology sc-8399 AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19) Santa Cruz Biotechnology sc-9187 FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1) Thermo Scientific MS-295-P0 Mouse IgG1
Desmin  Thermo Scientific RB-9014-P1 Rabbit IgG
Anti-NANOG ReproCELL Inc, Japan RCAB0004P-F Polyclonal antibody 
Rat anti-GFAP Zymed 13-0300 Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3) Cedarlane Laboratories Ltd. ( CL2513A Mouse IgG1,
Smooth muscle actin (clone 1A4) DakoCytomation Inc IR611/IS611 Mouse IgG2a
Nestin Chemicon International MAB5326 Rabbit polyclonal antibody
TUBB3 Convance Inc MMS-435P Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12) Cell Signaling Technologies 3113 Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution) Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in D-PBS

References

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Play Video

Cite This Article
Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, P. G., Mallon, B. S. Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51519, doi:10.3791/51519 (2014).

View Video