Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.
Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.
multilineage वयस्क ऊतकों की ओर अंतर करने hPSCs की क्षमता हृदय, यकृत, अग्नाशय, और मस्तिष्क संबंधी प्रणालियों 1-4 शामिल है कि गंभीर बीमारियों से पीड़ित मरीजों के इलाज के लिए नए रास्ते खोल दिया है. HPSCs से निकाली गई विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भी रोग मॉडलिंग, जेनेटिक इंजीनियरिंग, दवा स्क्रीनिंग, और विषाक्तता परीक्षण 1,4 के लिए मजबूत सेलुलर प्लेटफार्मों प्रदान करेगा. उनके भविष्य के नैदानिक और औषधीय अनुप्रयोगों सुनिश्चित करता है कि प्रमुख मुद्दा इन विट्रो सेल संस्कृति के माध्यम से नैदानिक ग्रेड hPSCs की बड़ी संख्या की पीढ़ी है. हालांकि, मौजूदा संस्कृति प्रणालियों कालोनियों 5,6 के रूप में hPSCs के विभिन्न फीडर और फीडर से मुक्त संस्कृतियों से जुड़े, अपर्याप्त या स्वाभाविक चर या तो कर रहे हैं.
HPSCs के शेयर शुरुआती स्तनधारी भ्रूण की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) की कई ढांचागत सुविधाओं की कालोनी प्रकार विकास. आईसीएम तीन रोगाणु परतों में अंतर होने का खतरा हैक्योंकि विषम संकेतन ढ़ाल के अस्तित्व की एक बहुकोशिकीय वातावरण में. इस प्रकार, जल्दी भ्रूण के विकास में विविधता के अधिग्रहण के भेदभाव के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया के रूप में माना जाता है, लेकिन HPSC संस्कृति की एक अवांछित सुविधा है. HPSC संस्कृति में विविधता के कारण अक्सर suboptimal विकास की स्थिति को अत्यधिक apoptotic संकेतों और सहज भेदभाव से प्रेरित है. इस प्रकार, कॉलोनी प्रकार संस्कृति में, विषम कोशिकाओं अक्सर कालोनियों 7,8 की परिधि में मनाया जाता है. यह भी मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) में कोशिकाओं बीएमपी 4 9 के रूप में संकेतन अणुओं को प्रदर्शनी अंतर प्रतिक्रियाओं कालोनियों कि दिखाया गया है. इसके अलावा, कॉलोनी संस्कृति तरीकों के कारण बेकाबू विकास दर और apoptotic संकेतन 6,9 रास्ते के लिए कम सेल पैदावार के साथ ही cryopreservation से बहुत कम सेल वसूली की दरों का उत्पादन. हाल के वर्षों में, विभिन्न निलंबन संस्कृतियों, संवर्धन hPSCs के लिए particul विकसित किया गया हैफीडर और मैट्रिक्स मुक्त परिस्थितियों 6,10-13 में hPSCs की बड़ी मात्रा के विस्तार के लिए Arly. जाहिर है, अलग संस्कृति प्रणालियों के अपने फायदे और नुकसान हैं. सामान्य में, hPSCs की विषम प्रकृति जेनेटिक इंजीनियरिंग 6 hPSCs में डीएनए और आरएनए सामग्री पहुंचाने के लिए suboptimal हैं जो कॉलोनी के प्रकार और एकत्रित संस्कृति तरीकों में प्रमुख कमियां, में से एक का प्रतिनिधित्व करता है.
जाहिर है, वर्तमान संस्कृति तरीकों में से कुछ कमियों को नाकाम कि नई प्रणाली विकसित करने के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है. एकल कोशिका अस्तित्व में सुधार (जैसे रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 और जे ए अवरोध करनेवाला 1) के रूप में छोटे अणु inhibitors की खोजों अलग-HPSC संस्कृति 14,15 के लिए मार्ग प्रशस्त हुआ. इन छोटे अणुओं का उपयोग के साथ, हम हाल ही में गैर कॉलोनी प्रकार अलग-hPSCs 9 की (एनसीएम) के विकास पर आधारित एक संस्कृति विधि विकसित की है. इस उपन्यास संस्कृति विधि एकल कक्ष passaging और उच्च घनत्व दोनों को जोड़ती है, तरीकों चढ़ाना हमें प्रमुख गुणसूत्र असामान्यताओं 9 के बिना लगातार विकास चक्र के तहत सजातीय hPSCs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की इजाजत दी. वैकल्पिक रूप से, एनसीएम संस्कृति व्यापक अनुप्रयोगों के लिए संस्कृति विधि का अनुकूलन करने के क्रम में विभिन्न छोटे अणुओं और (जैसे laminins के रूप में) परिभाषित matrices के साथ लागू किया जा सकता है. यहाँ, हम एनसीएम संस्कृति पर आधारित कई विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान और जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को चित्रित. एनसीएम प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करने के लिए, हम भी विविध रॉक inhibitors के साथ और एकल laminin isoform 521 (यानी, एल एन-521) के साथ एनसीएम संस्कृति का परीक्षण किया.
पारंपरिक (भक्षण या बाह्य matrices पर कोशिकाओं की) कॉलोनी प्रकार संस्कृति और भक्षण 6 बिना समुच्चय रूप hPSCs के निलंबन संस्कृति: इन विट्रो में संस्कृति hPSCs के लिए दो प्रमुख तरीके हैं. कॉलोनी के प्रकार और निल?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.
Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
MULTIWELL six-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
mitomycin C | Roche | 107 409 | Mitotic inhibitor |
Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
Knockout Serum Replacer | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
medium | |||
TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
β-mercaptoethanol | Sigma | 7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
CryoStor CA10 | StemCell Technologies | 7930 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40-µm cell strainer |
Nalgene 5100-0001 Cryo 1°C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
4-Oct | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. ( | CL2513A | Mouse IgG1, |
Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |