Abstract
चूहों में चमड़े के नीचे Matrigel प्लग परख समर्थक और विरोधी वाहिकाजनक कारकों के vivo मूल्यांकन के लिए पसंद का एक तरीका है। इस विधि में, वांछित कारकों, चमड़े के नीचे इंजेक्शन के बाद, कैंसर परिवेश नकल उतार एक वातावरण के लिए फार्म solidifies जो ठंड में तरल ईसीएम-नकल जेल में पेश कर रहे हैं। इस मैट्रिक्स ऐसे endothelial कोशिकाओं, और vasculature की इसलिए, गठन के रूप में मेजबान कोशिकाओं, के प्रवेश परमिट।
इस के साथ साथ हम एक विशिष्ट कारक (जैसे, bFGF और वीईजीएफ़) या एजेंट के लिए विरोध के रूप में, कैंसर कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारकों में से एक पूल के वाहिकाजनक संभावित वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक नए संशोधित Matrigel प्लग परख, प्रस्ताव। ईसीएम-नकल जेल युक्त प्लग तेजी से बढ़ ट्यूमर पैदा ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के मुख्यमंत्री को स्रावित कारकों में से एक पूल के साथ मेजबान (यानी, माउस) लागू करने के लिए उपयोग किया जाता है। हम पहले की वाहिकाजनक क्षमता का एक व्यापक तुलना वर्णन किया हैयू-87 एमजी पैतृक कोशिकाओं में प्रेरित एंजियोजिनेसिस दिखा यू-87 एमजी मानव ग्लियोब्लास्टोमा और इस प्रणाली के मॉडल में अपने निष्क्रिय व्युत्पन्न क्लोन,। मुख्यमंत्री 48 घंटा ऊष्मायन के बाद सेल लाइन या तो मिला हुआ टिशू कल्चर प्लेटों से एकत्र मीडिया छान कर तैयार किया जाता है। इसलिए, यह कोशिकाओं को खुद के बिना कोशिकाओं द्वारा स्रावित केवल कारकों में शामिल है। दो इमेजिंग तौर तरीकों के संयोजन यहाँ है वर्णित, प्लग के भीतर नवगठित रक्त वाहिकाओं के एक सटीक, वास्तविक समय सीमा तक, आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन और कार्यक्षमता के लिए, इसके विपरीत-बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और intravital fibered-confocal endomicroscopy microbubbles।
Introduction
Matrigel प्लग एंजियोजिनेसिस परख पहले Kibbey एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। यह पेप्टाइड SIKVAV (SER-इले-लिस-वैल-अला-वैल) 1 से एंजियोजिनेसिस उत्तेजना का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जहां 1992 में। अन्य vivo में angiogenesis के assays के लिए इसके विपरीत, माउस कॉर्निया एंजियोजिनेसिस या लड़की chorioallantoic झिल्ली assays के तरह, इस परख 2 प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। इंजेक्शन के ईसीएम-नकल जेल कोशिकाओं, समर्थक वाहिकाजनक या एक विरोधी वाहिकाजनक यौगिकों और / या कारकों को शामिल कर सकते हैं। एक विरोधी वाहिकाजनक यौगिक की गतिविधि का मूल्यांकन, प्लग सामान्य रूप से संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) और fibroblast वृद्धि कारक (FGF) का मिश्रण होता है, और विरोधी वाहिकाजनक पदार्थ सीधे प्लग या प्रणालीबद्ध 3 में प्रशासित किया जा सकता है, 4।
यह मिनट के भीतर solidifies जहां ईसीएम-नकल जेल subcutaneously इंजेक्शन है। जिसके परिणामस्वरूप प्लग में रक्त वाहिनियों की भर्ती का आकलन typicall हैY fluorescein आइसोथियोसाइनेट के इंजेक्शन (FITC) निम्नलिखित प्रतिदीप्ति संकेत माप करके, प्लग के भीतर हीमोग्लोबिन का स्तर मापने के द्वारा प्रदर्शन किया, endothelial विशिष्ट मार्करों के लिए ऊतक विज्ञान वर्गों के immunostaining द्वारा या छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) 2,5 द्वारा, dextran -labeled 6। हालांकि, इस आकलन केवल अंत बिंदु विश्लेषण की अनुमति देता है और रक्त वाहिकाओं की कार्यक्षमता और आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी का अभाव है। रक्त सामग्री रक्त वाहिकाओं के आकार और खून की स्थिर पूल की हद से प्रभावित होता है क्योंकि इसके अलावा, प्लाज्मा मात्रा का माप, या तो हीमोग्लोबिन के स्तर से या एक संकेतक के रूप dextran-FITC का उपयोग करके, गुमराह किया जा सकता है। भर्ती वाहिका संरचना बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव 7 के द्वारा होती है जब यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
हम इस के साथ साथ दो पूरक इमेजिंग तौर तरीकों के संयोजन द्वारा भर्ती रक्त वाहिकाओं के दृश्य के लिए एक नया, अधिक सटीक, विधि का प्रस्ताव। Higरक्त वाहिका घनत्व के बारे में, लेकिन यह भी उनकी आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता पर न केवल जानकारी प्रदान कर सकते हैं intravital रेशे-confocal endomicroscopy के साथ संयुक्त एच संकल्प microbubbles विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड (अमेरिका)। इसके अलावा, इस विश्लेषण जिससे एंजियोजिनेसिस कैनेटीक्स की निगरानी सक्रिय करने के कई समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है। अमेरिका संवहनी डिब्बे 8-11 में विशेष रूप से रहते हैं कि microbubbles का अंतःशिरा (चतुर्थ) इंजेक्शन के बाद रक्त वाहिकाओं इमेजिंग के लिए उच्च स्थानिक संकल्प के पास है, जो एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया इमेजिंग साधन है। microbubbles एक अमेरिकी नाड़ी के साथ उत्साहित है और इस तरह एक अच्छा विपरीत एजेंट के रूप में काम जब एक मजबूत प्रतिध्वनिजनक संकेत है कि उत्पादन गैस से भरे microbubbles हैं। प्लग की 3 डी छवियों microbubbles विनाश निम्नलिखित अमेरिका इमेजिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप छवियों microbubbles के पूर्व और बाद के विनाश की छवि फ्रेम से बना है और रंग में वीडियो तीव्रता में अंतर को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। ये overlayedछवियों को स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रदर्शित कर रहे हैं। नतीजतन, प्लग के भीतर कार्यात्मक जहाजों की प्रतिशत मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। Confocal endomicroscopy fibered उच्च संकल्प रक्त वाहिकाओं आकृति विज्ञान पर रिपोर्टिंग से एक पूरक इमेजिंग साधन के रूप में कार्य करता है। इस न्यूनतम इनवेसिव विधि में, छवियों FITC संयुग्मित dextran 12 के चतुर्थ प्रशासन के बाद हासिल किया है। फ्लोरोसेंट बहुलक खून रंगों और इस प्रकार रक्त वाहिकाओं आकृति विज्ञान और रक्त प्रवाह के लिए एक 'विपरीत एजेंट' के रूप में कार्य करता है। इंजेक्ट बहुलक 70 केडीए के आकार में है, क्योंकि ट्यूमर वाहिका संरचना के रूप में पाया इसके अलावा, यह केवल टपकाया वाहिकाओं को पार कर सकते हैं। यह रक्त वाहिकाओं के बाहर FITC लेबल dextran से उच्च पृष्ठभूमि में परिणाम होगा। नतीजतन, fibered confocal endomicroscopy कुंद साथ समाप्त होता है, ट्यूमर में neovasculature- बढ़े, टपका हुआ, अत्यधिक पेचीदा जहाजों EPR प्रभाव के विशिष्ट विशेषताओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रणाली के मॉडल descri किया गया थायू-87 एमजी मानव ग्लियोब्लास्टोमा और इसकी निष्क्रिय क्लोन 13 की वाहिकाजनक क्षमता की तुलना में बिस्तर। प्लग के भीतर vascularization तीन सप्ताह ईसीएम-नकल जेल टीका पोस्ट मूल्यांकन किया गया था। यह दिखाया गया था कि से मुख्यमंत्री युक्त प्लग के भीतर vascularization यू-87 एमजी निष्क्रिय ट्यूमर पैदा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री युक्त प्लग के भीतर vascularization के साथ तुलना में जब ट्यूमर पैदा कोशिकाओं में काफी संख्या, घनत्व और कार्यक्षमता, के संदर्भ में वृद्धि की गई थी तेजी से बढ़ रहा है। इसलिए, लेखकों मुख्यमंत्री से अलग निष्कर्ष है कि करने में सक्षम थे यू-87 एमजी तेजी से बढ़ रही ट्यूमर पैदा कोशिकाओं निष्क्रिय ट्यूमर पैदा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री के साथ तुलना समर्थक वाहिकाजनक कारकों का उच्च स्तर, शामिल हैं। इन कारकों (अंत में endothelial कोशिकाओं की ट्यूबलर संरचनाओं के गठन यानी, प्रसार, अंकुरण, प्रवास और) सकारात्मक वाहिकाजनक झरना के सभी चरणों को प्रभावित करने से कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं के गठन को प्रोत्साहित।
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Protocol
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के तेल अवीव विश्वविद्यालय Sackler स्कूल (IACUC) के मानकों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया।
1. वातानुकूलित मीडिया तैयारी
- की मात्रा में एक 10 सेमी संस्कृति की थाली में बीज 2 एक्स 10 6 यू-87 एमजी कोशिकाओं 8 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% pencillin / स्ट्रेप्टोमाइसिन / Nystatin समाधान के साथ पूरक (DMEM)।
- 37 में कोशिकाओं को सेते सी °; 48 घंटा में पूरा confluency प्राप्त करने तक 5% सीओ 2।
- एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक .45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से थाली से सभी मध्यम वापस लेने और फिल्टर।
- कोशिकाओं प्लेट धोने के बिना, 1 मिलीलीटर trypsin समाधान (0.25%) जोड़ने और सेते हैं।
- सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, 10% FBS के साथ पूरक कम से कम 5 मिलीलीटर DMEM का उपयोग कर ट्रिप्सिन निष्क्रिय और एक सेल गिनती पहिले।
- एक गिलास दौर नीचे कुप्पी को मुख्यमंत्री स्थानांतरण और उच्च वैक्यूम रोटरी बाष्पीकरण के तहत ध्यान केंद्रित। अगर वांछित प्रक्रिया में तेजी लाने के क्रम में, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए स्नान के तापमान में वृद्धि। मुख्यमंत्री एक पेस्ट की तरह बनावट को प्राप्त होता है जब तक जारी रखें।
- 400 μl खारा में प्रत्येक संस्कृति की थाली से मुख्यमंत्री Resuspend। एक से अधिक प्लेट का उपयोग करते समय, बराबर मात्रा का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, दो संस्कृति प्लेटों के लिए, 800 μl का उपयोग करें। चार चूहों के लिए प्रत्येक प्लेट का प्रयोग करें।
- विभिन्न सेल लाइनों या उपचार की तुलना करने के लिए, कदम 1.6 में प्राप्त सेल अनुपात के अनुसार मात्रा समायोजित करें। एक थाली 1.5x अधिक सेल शामिल हैं अगर उदाहरण के लिए, पूर्व मौजूदा 400 μl खारा के 200 μl जोड़ें। इस समायोजित मुख्यमंत्री होगा
नोट: यह मुख्यमंत्री एकाग्रता को सामान्य करने के क्रम में बाद में इस्तेमाल किया जाएगा।
- चूहों में ईसीएम-नकल जेल inoculating से पहले, निम्न सामग्री तैयार:
- विकास कारकों (बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर, प्रयोग से पहले एक दिन, रात भर पिघलना) फिनोल मुक्त ईसीएम-नकल जेल कम कर दिया।
- इलेक्ट्रिक शेवर।
- चूहों anesthetize के क्रम में ketamine और xylazine।
- ठंडा 1000 μl बाँझ सुझाव।
- ठंडा 1 मिलीलीटर सिरिंज और 27 जी सुइयों।
- प्रत्येक माउस के लिए मुख्यमंत्री समायोजित 80 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब को तैयार है और बर्फ पर रहते हैं।
- प्रत्येक ट्यूब, 600 μl बर्फ ठंड वृद्धि कारकों बर्फ पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात thawed किया गया था कि कम फिनोल मुक्त ईसीएम-नकल जेल में जोड़ें। ईसीएम-नकल जेल 4 डिग्री सेल्सियस में तरल होता है और शरीर के तापमान पर solidifies; solidifying से ईसीएम-नकल जेल को रोकने के क्रम में, बहुत ठंडा 1000 μl सुझावों का उपयोग करें। ध्यान से बुलबुले बनाने के बिना ट्यूब मिश्रण और बर्फ पर रहते हैं।
- छह सप्ताह पुराने बी चतनाशून्यKetamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (12 मिलीग्राम / किग्रा) का उपयोग ALB / सी चूहों। पूर्व प्रयोग शुरू करने के लिए संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, यानी के अनुसार उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। वे अब एक फर्म पैर के अंगूठे चुटकी का जवाब जब पशु संज्ञाहरण के उनके उचित विमान पर पहुँच गए हैं।
- चूहों के पेट क्षेत्र दाढ़ी और एक शल्य साफ़ / शराब का उपयोग कर कीटाणुरहित।
- Eppendorf ट्यूब subcutaneously की सामग्री डालने के लिए एक ठंडा 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 27 जी सुई का प्रयोग करें। बुलबुला बनने से रोकने के लिए बहुत धीरे धीरे इंजेक्शन प्रदर्शन। सभी मात्रा प्रशासित किया जाता है एक बार दृढ़ीभवन तब होता है, जब तक, कई मिनट के लिए सुई बेदखल नहीं है।
अल्ट्रासाउंड का उपयोग 3. मूल्यांकन ईसीएम-नकल जेल प्लग vascularization
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा एक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली, या एक अधिकृत तकनीशियन की सहायता के संचालन के पिछले ज्ञान की आवश्यकता है।
- शुरू करने से पहले, चसामग्री और उपकरणों के लिए तैयार ollowing:
- इलेक्ट्रिक शेवर।
- लोमनाशक क्रीम।
- चूहों anesthetize के क्रम में ketamine और xylazine।
- Microbubbles गैर लक्षित।
- सक्रियण डिवाइस।
- एक 55 मेगाहर्ट्ज 708 जांच और एक 3 डी अधिग्रहण micromanipulator सहित अमेरिका इमेजिंग प्रणाली।
- प्लग टीका पद तीन सप्ताह के भीतर vascularization उपाय:
नोट: यू-87 एमजी आधारित पशु मॉडल में, 3 सप्ताह इमेजिंग के लिए आदर्श समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करते पाया गया। विभिन्न सेटिंग्स के तहत, प्लग का टीका निम्नलिखित कुछ दिनों से शुरू vascularization कैनेटीक्स जांचना।- Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (किग्रा / 12 मिलीग्राम) का उपयोग चूहों anesthetize। पूर्व प्रयोग शुरू करने के लिए संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, यानी के अनुसार उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। वे अब एक फर्म पैर के अंगूठे चुटकी का जवाब जब पशु संज्ञाहरण के उनके उचित विमान पर पहुँच गए हैं।
- हजामतचूहों के पेट क्षेत्र और लोमनाशक क्रीम के साथ व्यवहार करते हैं।
- सूक्ष्म जोड़तोड़ के मंच पर supinely चूहों को ठीक करें।
- 1 मिलीलीटर सिरिंज युक्त खारा और एक 30 जी सुई का प्रयोग, पूंछ नस के अंदर सुई जगह मजबूती से सुई को ठीक करने और सिरिंज ढीला।
- कंट्रास्ट 3 डी मोड छवि अधिग्रहण सत्र के लिए स्थापित:
- प्रेस "3 डी" 3 डी मोटर चरण को प्रारंभ और इच्छित स्कैनिंग क्षेत्र के बीच में ट्रांसड्यूसर जगह है।
- प्रेस "3 डी" और इनपुट स्कैन दूरी और कदम आकार, तो "स्कैन" दबाएँ।
- पूरे प्लग प्रदर्शित 3 डी छवि डेटा में स्कैन किया गया है कि सुनिश्चित करें। यदि नहीं, तो पूरे प्लग स्कैन और दोहराने कदम 3.5.2 में दिख रहा है, इसलिए है कि ट्रांसड्यूसर समायोजित करें।
- प्रेस "विपरीत" और समय लाभ मुआवजा धक्का (टी जी सी) छवि अंधा करने के लिए छोड़ दिया करने के लिए नियंत्रित करता है।
- देसी है कि एक शीशी मिक्सर का उपयोग कर microbubbles सक्रिय45 सेकंड के लिए microbubbles के क्रियान्वयन के लिए gnated।
- 1 मिलीलीटर 50 μl खारा साथ microbubbles के 50 μl सिरिंज में मिलाएं।
- सक्रिय microbubbles युक्त एक सिरिंज के साथ खारा युक्त ढीला सिरिंज बदलें। 3 डी अधिग्रहण मोटर का उपयोग कर, एक स्थिर स्थिति तक पहुँचने, और फिर प्लग के 3 डी विपरीत बढ़ाया सिने पाश प्राप्त करने के लिए बुलबुले के लिए कुछ ही सेकंड प्रतीक्षा करें, चूहों की पूंछ नस में पतला microbubbles इंजेक्षन:
- प्रेस "3 डी" और 3 डी विपरीत बढ़ाया छवियों के अधिग्रहण और फिर छवि डेटा को बचाने के लिए 'सिने स्टोर "प्रेस करने के लिए" स्कैन "का चयन करें।
- प्रेस "3 डी" और क्लिक करें microbubbles संहार करने के लिए "3 डी को नष्ट"।
- प्रेस "3 डी" फिर से और फिर एक के बाद विनाश सिने पाश अधिग्रहण "सिने स्टोर" प्रेस करने के लिए "स्कैन" का चयन करें।
- छवि फ्रेम पूर्व ओवरले और microbubbles के बाद के विनाश उत्पन्न:
- इन एंड# 8220; संदर्भ सेटिंग "संदर्भ बनाएँ" स्क्रीन के बाईं ओर पर क्लिक करें "।
- प्रेस "अध्ययन प्रबंधन" का अधिग्रहण पूर्व विनाश सिने पाश खोलने के लिए।
- फिर "3 डी में लोड" पर क्लिक करें, हरी विपरीत ओवरले उत्पन्न करने के लिए "प्रक्रिया सिने" पर क्लिक करें।
- प्लग के भीतर रक्त की मात्रा के लिए जिसके परिणामस्वरूप 3 डी छवि quantitate के क्रम में अमेरिका इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें:
- प्रेस "स्कैन / रुक" और फिर "मोड सेटिंग्स" दबाएँ।
- "वॉल्यूम" पर क्लिक करें और "समांतर" का चयन करें।
- आकृति की एक श्रृंखला segmenting द्वारा लक्ष्य ऊतक के एक 3 डी मात्रा बनाएँ।
- विभाजन को पूरा करने के लिए "समाप्त" पर क्लिक करें।
नोट: इसके विपरीत एजेंट की मात्रा स्क्रीन के निचले बाएँ पक्ष पर प्रदर्शित किया जाएगा।
- प्रक्रिया के अंत में, दूर से एक गर्म, साफ, सूखे, शांत वातावरण में चूहों जगहअन्य जानवरों। कृंतक से 12-14 इंच की दूरी पर रखा एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शल्य हीटिंग पैड या एक गरमागरम दीपक (50-75 वाट), का उपयोग कर गर्मी प्रदान करते हैं। ईमानदार मुद्रा बनाए रखने और सामान्य रूप से चलने तक लगातार चूहों मॉनिटर।
Fibered Confocal Endomicroscopy का प्रयोग 4. का मूल्यांकन ईसीएम-नकल जेल प्लग vasculature आकृति विज्ञान
नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग के तुरंत बाद अमेरिका इमेजिंग प्रदर्शन किया है और यह fibered confocal endomicroscopy इमेजिंग प्रणाली, या एक अधिकृत तकनीशियन की सहायता के संचालन के पिछले ज्ञान की आवश्यकता है।
- शुरू करने से पहले, निम्न सामग्री और उपकरणों के लिए तैयार हैं:
- संदंश, कैंची और absorbable सिलाई धागे की तरह शल्य चिकित्सा उपकरण।
- FITC संयुग्मित dextran (70 केडीए)।
- अंशांकन समाधान (तीन ट्यूबों प्रत्येक युक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड, पानी या फ्लोरोसेंट समाधान)।
- इमेजिंग प्रणाली और एकनिर्माता के अनुसार रक्त वाहिकाओं की इमेजिंग के लिए उपयुक्त जांच।
- Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (किग्रा / 12 मिलीग्राम) का उपयोग चूहों anesthetize।
- पूंछ नस के माध्यम से, 10 मिलीग्राम / एमएल FITC लेबल dextran के 200 μl चतुर्थ प्रशासन।
- एक शल्य साफ़ / शराब का उपयोग कर पेट क्षेत्र कीटाणुरहित और प्लग से लगभग 1 सेमी एक छोटा सा चीरा लागू होते हैं।
- बरकरार प्लग रखते हुए धीरे प्लग के शीर्ष पर endomicroscopy जांच रखें।
- अधिग्रहण:
- जांच प्लग पर सेट किया जाता है एक बार, प्रेस पैर पेडल का उपयोग करते हुए "लेजर शुरू करें"। प्रतिदीप्ति स्क्रीन पर दिखाया जाना चाहिए।
- स्क्रीन पर 'रिकॉर्ड' दबाने या पैर पेडल का उपयोग करते हुए 'चुनें' द्वारा (30 सेकंड तक) लघु फिल्में मोल।
- फिल्मों के बीच, एक ट्यूब युक्त पानी में टिप रखकर जांच धो लें।
- जब समाप्त हो, जांच को हटाने और एक कपास टिप के साथ टिप साफ।
- मतलब ve का विश्लेषण करने के लिएSSEL व्यास:
- पोत का पता लगाने मॉड्यूल विंडो खोलने के लिए ऊपरी कक्ष में "microvessels का पता लगाने" आइकन पर क्लिक करें।
- "प्राथमिकताएं" पर क्लिक करें और "ब्याज की आँकड़ा" और "प्रदर्शन मोड" में "प्रदर्शन हिस्टोग्राम सलाखों" में "पोत व्यास मीन" मार्क।
- क्लिक करें चयनित माप प्रदर्शित करने के लिए "का पता लगाएँ"।
- रक्त वाहिकाओं से सटे क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए:
- बाएं पैनल में "सर्कल आरओआई बनाएँ" पर क्लिक करें और रुचि के क्षेत्र में एक वृत्त बनाएँ।
- इस क्षेत्र से संबंधित मूल्यों की गणना करने के लिए "आरओआई भीतर कंप्यूट हिस्टोग्राम" पर क्लिक करें।
चूहे की 5. पोस्ट-प्रक्रियात्मक उपचार
- प्रत्येक इमेजिंग प्रक्रिया के अंत में, दूर अन्य जानवरों से एक गर्म, साफ, सूखे, शांत वातावरण में चूहों जगह है। एक वाणिज्यिक रूप से एक का उपयोग कर गर्मी प्रदानvailable शल्य हीटिंग पैड या एक गरमागरम दीपक (50-75 डब्ल्यू), कृंतक से दूर में 12-14 रखा। ईमानदार मुद्रा बनाए रखने और सामान्य रूप से चलने तक लगातार चूहों मॉनिटर।
- अतिरिक्त समय बिंदुओं पर प्लग 'vascularization के आगे के विश्लेषण के लिए, निम्न वसूली शर्तें लागू होती हैं:
- Absorbable sutures का उपयोग छोटा सा चीरा सीवन।
- Subcutaneously ऐसे buprenorphine (1 मिलीग्राम / किग्रा) के रूप में चूहों एनलजेसिया दे दो, और अलग-अलग पिंजरों में लौटने।
- आगे एनाल्जेसिक उपचार आवश्यक है और अगर निर्धारित करने के लिए सभी जानवरों का निरीक्षण निगरानी के लिए और संकट के लिए आकलन करने के लिए दैनिक फिर से मूल्यांकन।
- प्रयोग के अंत बिंदु पर, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद पहली बार लागू करने isoflurane के द्वारा चूहों, euthanize।
- अतिरिक्त इमेजिंग प्रारंभिक इमेजिंग चरणों का पालन सप्ताह में प्रदर्शन किया जाएगा, तो सभी प्रक्रियाओं के रूप में संभव के रूप में बाँझ रखा जाना चाहिए। एक सर्जिकल त्वचा साफ़ किया जाना चाहिए, बाँझ वाआतंकवाद और बाँझ कपास सुझावों endomicroscopy जांच साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और जांच बाँझ पानी का उपयोग कर प्रत्येक जानवर के बीच कीटाणुरहित किया जाना चाहिए।
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Representative Results
तेजी से बढ़ रही वाहिकाजनक ट्यूमर पैदा सेल लाइन यू-87 एमजी, व्यापक एन्जियोजिनेसिस में परिणामों से मुख्यमंत्री के साथ ईसीएम-नकल जेल प्लग दाखिल। इस वाहिका संरचना को बड़े पैमाने पर दो पूरक इमेजिंग तरीकों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है।
Microbubbles विपरीत बढ़ाया अमेरिका इमेजिंग यू-87 एमजी मुख्यमंत्री भरी हुई प्लग, निष्क्रिय ट्यूमर पैदा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री युक्त प्लग के भीतर से undetectable रक्त का प्रवाह करने के लिए विरोध के रूप में (चित्रा 1) के भीतर व्यापक रक्त प्रवाह illustrating द्वारा प्लग में कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं की व्यापक भर्ती का पता चलता है ।
इन नवगठित रक्त वाहिकाओं की आकृति विज्ञान fibered confocal endomicroscopy (चित्रा 2) द्वारा पर बल दिया जाता है। यू-87 एमजी मुख्यमंत्री के साथ भरी हुई प्लग के भीतर रक्त वाहिकाओं यहां इस्तेमाल 70 केडीए आकार में इस तरह के Dextran-FITC के रूप में अणुओं के लिए बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव को विशिष्ट आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया। रक्त वाहिकाओं बढ़े और अत्यधिक टा गया गैर-निरंतर और सुस्त प्रवाह के साथ ngled, (2A चित्रा, सी)। रक्त वाहिकाओं (चित्रा 2 बी) के बाहर उच्च फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा दिखाया के रूप में इसके अलावा, खून का रिसाव, आसपास के वातावरण को मनाया गया।
चित्रा 1:। Microbubbles अमेरिका इमेजिंग विपरीत बढ़ाया नसों में microbubbles के प्रशासन और उनके विनाश के बाद, प्लग प्रदर्शनी युक्त यू-87 एमजी मुख्यमंत्री (हरे रंग में) vascularization वृद्धि हुई है। यू-87 एमजी व्युत्पन्न निष्क्रिय ट्यूमर पैदा कोशिकाओं से मुख्यमंत्री युक्त प्लग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2: फाइबर confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग। (ए) 70 केडीए Dextran-FITC की नसों में प्रशासन, रक्त प्रवाह और रक्त वाहिकाओं आकृति विज्ञान के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। प्लग वाहिका संरचना युक्त Blunts साथ टपकाया, बढ़े हुए जहाजों के होते मुख्यमंत्री यू-87 एमजी समाप्त होता है। रक्त वाहिकाओं रिसाव vasculature के बाहर फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। माउस पेट में सामान्य वाहिका। नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया रक्त वाहिकाओं से सटे क्षेत्रों में (बी) फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता गया था। फ्लोरोसेंट संकेत लाल से सफेद करने के लिए एक स्पेक्ट्रम द्वारा उदाहरण है। सफेद उच्च फ्लोरोसेंट संकेत का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि अंधेरे लाल, कम संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। कोई संकेत सामान्य जहाजों बाहर दिखाया गया है, जबकि प्लग, जहाजों के बाहर एक स्पष्ट फ्लोरोसेंट संकेत दिखा युक्त यू-87 एमजी सेमी। (सी) मतलब पोत व्यास (MVD) रक्त वाहिकाओं की अंडर-87 एमजी मुख्यमंत्री युक्त प्लग के भीतर (22.4 माइक्रोन) है significantly अधिक से अधिक सामान्य वाहिकाओं (6.7 माइक्रोन) की MVD की तुलना में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
पूरक इमेजिंग विधियों के संयोजन अलग एंजियोजिनेसिस 'घटकों microvessel घनत्व, कार्यक्षमता और आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी की प्राप्ति की अनुमति देता है। ईसीएम-नकल जेल प्लग पर लोड हो रहा है मुख्यमंत्री प्लग में भर्ती और extravasate रहे हैं कि endothelial कोशिकाओं, जैसे अन्य सेल आबादी से अलग है, जो एक ट्यूमर microenvironment, उत्पन्न करता है।
समानांतर में, प्रदर्शन करके, इसके विपरीत-बढ़ाया अमेरिका इमेजिंग और fibered confocal endomicroscopy इमेजिंग microbubbles, हम कैंसर की कोशिकाओं को खुद को बिना कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए तेजी से बढ़ रही है वाहिकाजनक ट्यूमर द्वारा स्रावित कारकों में से एक पूल, केवल रक्त वाहिकाओं को भर्ती नहीं किया जा सकता है कि निष्कर्ष निकाल सकते हैं, लेकिन यह भी EPR विशिष्ट विशेषताओं के साथ कार्यात्मक वाहिका संरचना के रूप में। इसके अलावा, इस विधि ट्यूमर microenvironment में स्रावित कारकों के प्रभाव और सेल के लिए सेल बातचीत के बीच अलगाव की अनुमति देता है।
सूचना अमेरिका से प्राप्त और confocal fiberedendomicroscopy हालांकि इमेजिंग तकनीक की सीमा के अधीन है। Fibered confocal endomicroscopy इमेजिंग का उपयोग करते समय उदाहरण के लिए, यह छवि के लिए प्लग में समय पर एक भी विशिष्ट रक्त वाहिका, या यहां तक कि एक ही क्षेत्र असंभव है।
ईसीएम-नकल जेल प्लग परख प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और ईसीएम-नकल जेल के साथ मुख्यमंत्री लोड हो रहा है जब इस निरंतर है। हालांकि, विचाराधीन लिया जाना चाहिए कि एक महत्वपूर्ण मुद्दा ईसीएम-नकल जेल अनुपात को सेमी है। मुख्यमंत्री की उच्च मात्रा solidifying से ईसीएम-नकल जेल को रोकने सकता है। इसलिए, मुख्यमंत्री राशि ईसीएम-नकल जेल के लगभग 13% से अधिक नहीं होना चाहिए।
इस विधि अलग प्रयोगात्मक सिस्टम और अनुप्रयोगों के लिए समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह पूर्व और बाद में इलाज कोशिकाओं से लोड हो रहा है मुख्यमंत्री द्वारा विरोधी वाहिकाजनक दवाओं का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, अन्य सेल लाइनों इन प्रयोग सेटिंग के तहत इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, अंशांकन एक के क्रम में आवश्यक हैइष्टतम मुख्यमंत्री एकाग्रता pply। इसके अलावा, इमेजिंग के लिए आदर्श समय बिंदु प्रत्येक मॉडल प्रणाली के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
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