Abstract
Den subkutane Matrigel plug assay i mus er en metode til valg til in vivo evaluering af pro- og anti-angiogene faktorer. Ved denne fremgangsmåde er de ønskede faktorer indføres i kold væske ECM-mimic gel, som efter subkutan injektion, størkner til dannelse af et miljø, der efterligner kræft miljø. Denne matrix tillader gennemtrængning af værtsceller, såsom endotelceller, og dermed dannelsen af kar.
Heri foreslår vi en ny modificeret Matrigel plug assay, som kan udnyttes til at illustrere den angiogene potentiale af en pulje af faktorer, der udskilles af cancerceller, i modsætning til en bestemt faktor (fx bFGF og VEGF) eller agent. Stikket indeholder ECM-efterligner gel anvendes til at introducere værten (dvs. mus) med en pulje af faktorer, der udskilles til CM hurtigtvoksende tumor-generering glioblastomceller. Vi har tidligere beskrevet en omfattende sammenligning af det angiogene potentialeU-87 MG humane glioblastom og hvilende afledt klon, i dette system model, der viser induceret angiogenese i U-87 MG parentale celler. CM fremstilles ved filtrering opsamlede medier fra sammenflydende vævskulturplader enten cellelinje efter 48 timers inkubation. Derfor indeholder det eneste faktorer secerneret af celler, uden at cellerne selv. Beskrevet her er en kombination af to billeddannende modaliteter, mikrobobler kontrast-forstærket ultralydsscanning og intravital fibered-konfokal endomicroscopy, for en nøjagtig, realtid karakterisering af omfanget, morfologi og funktionalitet nydannede blodkar inden propperne.
Introduction
Matrigel plug angiogenesis assay blev først beskrevet af Kibbey et al. I 1992, hvor det blev anvendt til at vurdere angiogenese stimulering med peptidet SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. I modsætning til andre in vivo angiogenese assays, ligesom muse hornhindeangiogenese eller kyllingechorioallantoinmembranen assays dette assay er relativt let at udføre 2. Den injicerede ECM-mimic gel kan indeholde celler, pro-angiogen eller et anti-angiogene forbindelser og / eller faktorer. Ved evaluering af aktiviteten af en antiangiogen forbindelse, proppen indeholder normalt en blanding af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og fibroblast vækstfaktor (FGF), og den antiangiogene stof kan indgives direkte i proppen eller systemisk 3, 4.
ECM-mimic gel injiceres subkutant, hvor den størkner inden for få minutter. Vurdering af blodkar rekruttering i den resulterende stikket er typically udføres ved at måle hæmoglobinindholdet i proppen ved signal måling fluorescens efter injektion af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket dextran, ved immunfarvning af histologiske sektioner for endotel-specifikke markører eller ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 2,5 6. Men denne vurdering kun tillader endepunkt analyse og mangler information om funktionalitet og morfologi af blodkar. Desuden målinger af plasmavolumen, enten ved hæmoglobinniveauer eller ved hjælp af dextran-FITC som en indikator, kan være misvisende, da indholdet blod påvirkes af størrelsen af blodkar og omfanget af stillestående puljer af blod. Dette er især vigtigt, når rekrutteret vaskulatur er kendetegnet ved forøget permeabilitet og tilbageholdelse (EPR) virkning 7.
Vi heri foreslå en ny og mere præcis metode til visualisering af de rekrutterede blodkar ved at kombinere to komplementære billeddannende modaliteter. High-opløsning mikrobobler kontrast-forstærket ultralyd (US) kombineret med intravital fibred-konfokal endomicroscopy kan give oplysninger ikke kun om blodkar tæthed, men også af deres morfologi og funktionalitet. Desuden kan denne analyse udføres på flere tidspunkter derved muliggør overvågning af angiogenese kinetik. USA er et udbredt afbildningsmodalitet som besidder høj rumlig opløsning for blodkar billeddannelse efter intravenøs (iv) injektion af mikrobobler, der forbliver udelukkende i det vaskulære rum 8-11. De mikrobobler er gasfyldte mikrobobler, der producerer et stærkt ekkogen signal, når exciteres med en amerikansk impuls og derved tjene som en god kontrastmiddel. 3D-billeder af proppen er erhvervet ved hjælp af amerikanske imaging systemsoftware efter mikrobobler ødelæggelse. De resulterende billeder er sammensat af billedrammer af før og efter ødelæggelse af mikrobobler og afspejler forskellen i video intensitet i farven. Disse overlejretbilleder vises automatisk af softwaren. Derfor kan procent af funktionelle fartøjer i stikket kvantificeres. Høj opløsning fibered konfokal endomicroscopy fungerer som en supplerende afbildningsmodalitet ved at rapportere om blodkar morfologi. I denne minimalt invasiv metode, billederne erhverves efter iv administration af FITC-konjugeret dextran 12. Den fluorescerende polymer farvestoffer i blodbanen og dermed fungerer som en "kontraststof" for blodkar morfologi og blodgennemstrømningen. Da den injicerede polymer er en størrelse på 70 kDa, kan det kun krydse utætte fartøjer, som findes i tumorvaskulatur. Dette vil resultere i høj baggrund fra FITC-mærket dextran uden blodkar. Derfor kan fibered konfokal endomicroscopy bruges til at visualisere typiske karakteristika ved EPR effekt i tumor neovasculature- forstørrede, utætte, højt sammenfiltrede fartøjer, med stumpe ender.
Dette system model blev descriseng i sammenligning af angiogene potentiale U-87 MG humane glioblastom og hvilende klon 13. Kardannelse inden propperne blev evalueres tre uger efter ECM-mimic gel inokulering. Det blev vist, at vaskularisering inden propper indeholdende CM fra U-87 MG hurtigtvoksende tumor-generering celler var signifikant forøget i antal, tæthed og funktionalitet, sammenlignet med vaskularisering inden propper indeholdende cm fra hvilende tumor-generering celler. Derfor forfatterne kunne konkludere, at CM isoleret fra U-87 MG hurtigtvoksende tumor-generering celler indeholder højere niveauer af pro-angiogene faktorer, sammenlignet med CM fra hvilende tumor-generering celler. Disse faktorer stimulerer dannelsen af funktionelle blodkar ved positivt at påvirke alle trin i angiogene kaskade (dvs. spredning, spiring, migration og endelig dannelsen af rørformede strukturer i endotelceller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med standarderne i Tel Aviv University Sackler School of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. konditionerede medier Fremstilling
- Seed 2 x 10 6 U-87 MG-celler i en 10 cm agarplade i et volumen på 8 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / nystatin opløsning.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C; 5% CO2 indtil opnå fuld konfluens på 48 timer.
- Ved hjælp af en 10 ml sprøjte, trække alle medium fra pladen og filtreres gennem et 0,45 um filter over i en 15 ml rør.
- Uden vask af celler plade, tilsættes 1 ml trypsin opløsning (0,25%), og der inkuberes.
- Når alle celler er fritliggende, inaktivere trypsin ved anvendelse af mindst 5 ml DMEM suppleret med 10% FBS og præforme en celletælling.
- Overfør CM til et glas rundbundet kolbe og koncentreres under højvakuum rotationsfordamper. For at fremskynde processen, øge badtemperatur til 37 ° C, hvis det ønskes. Fortsæt, indtil CM opnår en pasta-lignende konsistens.
- Resuspender CM fra hver kultur plade i 400 pi saltvand. Når du bruger mere end en plade, skal du bruge tilsvarende volumen. For eksempel, for 2 dyrkningsplader bruge 800 pi. Brug hver plade til 4 mus.
- For at kunne sammenligne forskellige cellelinier eller behandlinger, justere lydstyrken ifølge celle forholdet modtaget i trin 1.6. For eksempel, hvis en plade indeholder 1,5x flere celler, der tilsættes 200 pi af saltvand til de allerede eksisterende 400 pi. Dette vil være den justeret CM
BEMÆRK: Det vil blive brugt senere til at normalisere CM koncentration.
- Før podning af ECM-mimic gel i mus, forberede følgende materialer:
- Vækstfremmende faktorer reduceret phenol-fri ECM-efterligner gel (tø natten over, en dag før forsøget, ved 4 ° C på is).
- Elektrisk shaver.
- Ketamin og xylazin med henblik på at bedøve musene.
- Iskold 1.000 pi sterile tips.
- Iskold 1 ml sprøjte og 27 g nåle.
- Forbered hver mus en 1,5 ml Eppendorf-rør indeholdende 80 pi justeret CM og holde på is.
- Til hvert rør tilsættes 600 pi iskold vækst-faktorer reduceret phenol-fri ECM-mimic gel, der blev optøet natten over ved 4 ° C, på is. ECM-mimic gel er flydende i 4 ° C og størkner ved kropstemperatur; For at forhindre, at ECM-mimic gel fra størkne, brug iskolde 1.000 tips pi. Bland rør omhyggeligt uden at danne bobler og holde på is.
- Bedøver 6 uger gamle BALB / c-mus ved hjælp af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (12 mg / kg). Bekræft ordentlig anæstesi ifølge den institutionelle pasning af dyr og brug udvalg, dvs. før påbegyndelse af forsøget. Dyr har nået deres rette plan af anæstesi, når de ikke længere reagerer på en fast tå knivspids.
- Barber maveregionen musenes og desinficere at bruge en kirurgisk krat / alkohol.
- Brug en kold 1 ml sprøjte og en 27 G nål til at injicere indholdet af Eppendorf-rør subkutant. Udfør injektionen meget langsomt for at forhindre bobledannelse. Når alle volumen administreres, ikke skubbe nålen i flere minutter, indtil størkning forekommer.
3. Evaluering af ECM-efterligner Gel Plug Vaskularisering hjælp af ultralyd
BEMÆRK: Denne del af protokollen kræver forudgående kendskab til drift af en ultralydsscanning system eller bistand fra en autoriseret tekniker.
- Før du starter, har following materialer og instrumenter klar:
- Elektrisk shaver.
- Hårfjerningsmiddel.
- Ketamin og xylazin med henblik på at bedøve musene.
- Ikke-målrettede mikrobobler.
- Aktivering enhed.
- US imaging system herunder en 55 MHz 708 sonde og et 3D erhvervelse mikromanipulator.
- Mål kardannelse inden propperne tre uger efter inokulering:
BEMÆRK: I U-87 MG-baserede dyremodel, var på 3 uger fundet at repræsentere den ideelle tidspunkt til billeddannelse. Under forskellige indstillinger, kalibrere vaskularisering kinetik startende fra et par dage efter podning af propper.- Bedøver mus under anvendelse af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (12 mg / kg). Bekræft ordentlig anæstesi ifølge den institutionelle pasning af dyr og brug udvalg, dvs. før påbegyndelse af forsøget. Dyr har nået deres rette plan af anæstesi, når de ikke længere reagerer på en fast tå knivspids.
- Barber detmaveregion af musene og behandl med hårfjerningsmiddel.
- Fix musene dvask på scenen af mikro-manipulator.
- Ved hjælp af en 1 ml injektionssprøjte indeholdende saltvand og en 30 G nål, placere nålen i halevenen, fastsætte kanylen fast og løsne sprøjten.
- Opsætning for kontrast 3D-mode billede erhvervelse session:
- Tryk på "3D" for at initialisere 3D motor scenen og placere transduceren i midten af det ønskede scanningsområdet.
- Tryk på "3D" og input scanningen afstand og skridt størrelse, og tryk derefter på "Scan".
- Sørg for, at hele stikket blev scannet i billeddata 3D vises. Hvis ikke, skal du justere transduceren, så hele proppen er synlig i scanningen, og gentag trin 3.5.2.
- Tryk på "Kontrast" og skub den tid gain kompensation (TGC) styrer til venstre for at gøre billedet mørkere.
- Aktiver mikrobobler ved hjælp af en hætteglas mixer, der er designated til aktivering af mikrobobler i 45 sek.
- Bland i en 1 ml sprøjte 50 pi mikrobobler med 50 pl saltvand.
- Udskift saltvand indeholdende løsnet sprøjte med en sprøjte indeholdende aktiverede mikrobobler. Injicer den fortyndede mikrobobler i halevenen af musene, vent et par sekunder for boblerne til at nå en stabil tilstand, og derefter erhverve 3D kontrast-forstærket cine loop af proppen ved hjælp af 3D-erhvervelse motor:
- Tryk på "3D", og vælg "Scan" for at erhverve 3D kontrast-forstærket billeder og derefter trykke på "Cine Store" for at gemme billeddata.
- Tryk på "3D", og klik på "Destroy 3D" for at tilintetgøre de mikrobobler.
- Tryk på "3D" igen og vælg "Scan" for at erhverve en post-ødelæggelse cine loop, og tryk derefter på "Cine Store".
- Generer overlay billedrammer før og efter ødelæggelse af mikrobobler:
- I &# 8220; reference indstillinger "i venstre side af skærmen skal du klikke på" Opret reference ".
- Tryk på "Study Management" for at åbne før destruktion cine loop erhvervet.
- Klik på "Process Cine" for at generere den grønne kontrast overlay og klik på "Load Into 3D".
- Brug US imaging software med henblik på at kvantificere det resulterende 3D-billede for blodvolumen i propperne:
- Tryk på "Scan / Freeze", og tryk derefter på "indstillinger Mode".
- Klik på "Volume" og vælg "Parallel".
- Lav en 3D volumen af målvævet ved segmentering af en række konturer.
- Klik på "Finish" for at fuldføre segmentering.
BEMÆRK: Mængden af kontrastmidlet vil blive vist på den nederste venstre side af skærmen.
- Ved afslutningen af proceduren, anbringes musene i en varm, ren, tør, rolige miljø væk fraandre dyr. Give varme ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kirurgisk varmepude eller en glødelampe (50-75 watt), placeret 12-14 inches væk fra gnaver. Overvåg mus kontinuerligt indtil bevare oprejst kropsholdning og gå normalt.
4. Evaluering af ECM-efterligner Gel Plug kar morfologi Brug fibered Konfokal Endomicroscopy
BEMÆRK: denne del af protokollen udføres umiddelbart efter amerikansk billedbehandling og det kræver forudgående kendskab til betjening af fibered konfokal endomicroscopy imaging system, eller bistand fra en autoriseret tekniker.
- Før du starter, har de følgende materialer og instrumenter klar:
- Kirurgi værktøjer som pincet, saks og absorberbare sytråd.
- FITC-konjugeret dextran (70 kDa).
- Kalibreringsopløsningerne (tre rør hver indeholdende hydrogenperoxid, vand eller fluorescerende opløsning).
- The imaging system og enprobe egnet til billeddannelse af blodkar ifølge fabrikanten.
- Bedøver mus under anvendelse af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (12 mg / kg).
- Administrere IV via halevenen, 200 pi 10 mg / ml FITC-mærket dextran.
- Desinficer maveregionen ved hjælp af en kirurgisk krat / alkohol og anvende et lille snit ca. 1 cm fra stikket.
- Placer endomicroscopy sonde på toppen af proppen forsigtigt samtidig holde proppen intakt.
- Erhvervelse:
- Når sonden er indstillet på stikket, skal du trykke på "Start laser" ved hjælp af fodpedal. Fluorescensen skal vises på skærmen.
- Anskaf korte film (op til 30 sek) ved at trykke på 'Record' på skærmen eller 'Vælg' ved hjælp af fodpedal.
- Mellem film, vaske proben ved at placere spidsen i et rør indeholdende vand.
- Når du er færdig, skal du fjerne sonden og rengør spidsen med en vatpind.
- At analysere middelværdi veSSEL diameter:
- Klik på "Detect mikrokar" ikonet i det øverste panel for at åbne skibet detektionsmodulet vindue.
- Klik på "Preferences" og markere "Mean fartøj diameter" i "Statistik for interesse" og "Vis histogram søjler" i "Display Mode".
- Klik på "Detect" for at vise de valgte målinger.
- For at analysere det fluorescerende signal intensitet i områder, der støder til blodkar:
- Klik på "Opret cirkel ROI" i venstre panel og skabe en cirkel i området af interesse.
- Klik på "Compute histogram indenfor ROI" for at beregne de værdier relateret til dette område.
5. Post-proceduremæssige behandling af mus
- Ved afslutningen af hver imaging procedure, anbringes musene i en varm, ren, tør, rolige omgivelser væk fra andre dyr. Give varme ved hjælp af et kommercielt-available kirurgisk varmepude eller en glødelampe (50-75 W), placeret 12-14 i væk fra gnaver. Overvåg mus kontinuerligt indtil bevare oprejst kropsholdning og gå normalt.
- For yderligere analyse af propper 'vaskularisering på yderligere tidspunkter, gælder følgende inddrivelse betingelser:
- Suturere lille snit ved hjælp af absorberbare suturer.
- Giv mus analgesi såsom buprenorphin (1 mg / kg) subkutant, og vende tilbage til individuelle bure.
- Overhold alle dyr for at afgøre, om yderligere smertestillende behandling er nødvendig og revurdere dagligt for at overvåge og vurdere for nød.
- I slutningen-point af forsøget, aflive mus ved først at isofluran, efterfulgt af cervikal dislokation.
- Hvis yderligere billeddannelse vil blive udført i ugerne efter de indledende billedbehandling trin, skal alle procedurer holdes så sterilt som muligt. Et kirurgisk hud scrub skal udføres, steril water og steril vatpind bør bruges til at rense endomicroscopy probe, og proben skal desinficeres mellem hvert dyr under anvendelse af sterilt vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Implantering ECM-efterligner gel stik med CM fra hurtigtvoksende angiogen tumor-generering cellelinje U-87 MG, resulterer i omfattende angiogenese. Denne vaskulaturen kan udførligt undersøgt ved anvendelse af to komplementære billeddannende metoder.
Mikrobobler kontrast-forstærkede amerikanske imaging afslører omfattende rekruttering af funktionelle blodkar i proppen ved at illustrere omfattende blodgennemstrømningen i U-87 MG CM belastede stik, i modsætning til målbart blodgennemstrømningen i stik indeholdende CM fra hvilende tumor-generering celler (figur 1) .
Morfologien af disse nydannede blodkar understreges af fibered konfokal endomicroscopy (figur 2). Blodkar i stik læsset med U-87 MG CM udviste morfologi typisk for den forbedrede permeabilitet og fastholdelse (EPR) effekt for makromolekyler, såsom Dextran-FITC på 70 kDa størrelse her. Blodkar blev udvidet og stærkt ta ngled med ikke-kontinuert og træg flow (figur 2A, C). Blev også lækage af blod observeret for det omgivende miljø, som vist ved høj fluorescerende signal uden blodkarrene (figur 2B).
Figur 1:. Mikrobobler kontrast-forstærkede amerikanske imaging Efter intravenøs administration af mikrobobler og destruktion, U-87 MG CM indeholder stik udviser øget vaskularisering (i grønt). Stik indeholdende CM fra U-87 mg-afledte hvilende tumor-generering celler blev anvendt som kontrol. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
"Src =" / files / ftp_upload / 51525 / 51525fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Fiber konfokal mikroskopi billeddannelse. (A) Intravenøs administration af 70 KDa Dextran-FITC, muliggør visualisering af blodgennemstrømningen og blodkar morfologi. U-87 MG CM indeholder stik kar består af utætte, forstørrede fartøjer med blunts slutter. Blodkar lækage udvises af fluorescerende signal uden vaskulaturen. Normal vaskulatur i muse abdomen blev anvendt som kontrol. (B) fluorescerende signal intensitet i områder, der støder til blodkar. Det fluorescerende signal er eksemplificeret ved et spektrum fra rød til hvid. Mørkerød repræsenterer lav signalintensitet, mens hvid repræsenterer høj fluorescerende signal. U-87 MG CM indeholder stik viser en klar fluorescerende signal uden for fartøjerne, mens der ikke signal vises uden for normal skibe. (C) Mean kardiameter (MVD) af blodkar inden for U-87 MG CM indeholder stik (22,4 um) er significantly højere i forhold til MVD af normale skibe (6,7 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved at kombinere komplementære billeddiagnostiske metoder muliggør erhvervelse af oplysninger om forskellige angiogenese komponenternes mikrokar tæthed, funktionalitet og morfologi. Loading CM på ECM-mimic gel stik genererer en tumor mikromiljø, som er adskilt fra andre cellepopulationer, som endotelceller, der er rekrutteret og ekstravasere i proppen.
Ved at udføre, parallelt, mikrobobler kontrast-forstærkede amerikanske billedbehandling og fibered konfokal endomicroscopy billeddannelse, kan vi konkludere, at en pulje af faktorer der udskilles af hurtigtvoksende angiogene tumorer generere celler, uden kræftcellerne selv, ikke kun kan rekruttere blodkar, men også danne funktionelle vaskulatur med EPR typiske egenskaber. Desuden giver denne metode tillader adskillelse mellem virkningerne af de udskilte faktorer og celle-til-celle interaktion i tumormikromiljøet.
Oplysninger fra USA og fibered konfokalendomicroscopy er dog udsat for en begrænsning af den billeddannende teknik. For eksempel, mens bruger fibered konfokal endomicroscopy billeddannelse, er det umuligt at afbilde et enkelt specifikt blodkar over tid, eller endda den samme område på proppen.
ECM-efterligner gel stik analysen er forholdsvis let at udføre, og det fastholdes, når du lægger CM med ECM-mimic gel. , Et kritisk spørgsmål, der bør tages under overvejelse er dog CM til ECM-mimic gel andel. Store mængder af CM kan forhindre ECM-mimic gel fra størkne. Derfor bør CM beløbet ikke overstige ca. 13% af ECM-mimic gel.
Denne metode kan justeres til forskellige eksperimentelle systemer og applikationer. For eksempel kan det anvendes til at vurdere anti-angiogene lægemidler ved lastning CM fra præ- og post-behandlede celler. Desuden kan andre cellelinier anvendes under disse eksperiment indstillinger. Imidlertid er kalibrering nødvendig for at enpply den optimale CM koncentration. Desuden bør det ideelle tidspunkt til billeddannelse optimeres i henhold til hver model system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K.
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
