Abstract
Den subkutane matrigel plugg-analyse i mus som er en metode for valg for in vivo-evaluering av pro- og anti-angiogene faktorer. I denne metoden, blir ønskede faktorer innføres i kald væske ECM-etterligner gel som etter subkutan injeksjon, størkner for å danne et miljø som etterligner kreft miljø. Denne matrisen muliggjør inntrengning av vertsceller, slik som endotelceller, og derfor dannelsen av blodkar.
Heri foreslår vi en ny modifisert matrigel plugg assay, som kan utnyttes for å illustrere den angiogene potensialet av en pool av faktorer utskilt av cancerceller, i motsetning til en bestemt faktor (f.eks bFGF og VEGF) eller middel. Pluggen som inneholder ECM-ligne gel brukes til å introdusere verten (dvs. mus) med en pool av faktorer som utskilles til CM av raskt voksende tumor generer glioblastom celler. Vi har tidligere beskrevet en omfattende sammenligning av den angiogene potensialetU-87 MG human glioblastoma og dets hvil-avledet klon, i dette system modell, som viser indusert angiogenese i U-87 MG parentale celler. CM fremstilles ved å filtrere innsamlede medier fra sammenflytende vevskulturplater av enten cellelinje følgende 48 timers inkubering. Derfor inneholder det eneste faktorene som utskilles av cellene, uten at cellene selv. Beskrevet her er kombinasjonen av to bildediagnostikk, mikrobobler kontrastforsterket ultralyd billeddiagnostikk og intra fibered-konfokalmikroskoper endomicroscopy, for en nøyaktig, real-time karakterisering av omfanget, morfologi og funksjonalitet av nydannede blodårene i pluggene.
Introduction
Den matrigel plugg angiogenese analysen ble først beskrevet av Kibbey et al. I 1992, der det ble brukt til å evaluere angiogenese stimulering av peptidet SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. I motsetning til andre in vivo angiogenese-assays, slik som mus korneal angiogenese eller chick chorioallantoic membran-analyser, er relativt lett å utføre to denne analysen. Den injiserte ECM-etterligner gel kan inneholde celler, pro-angiogene eller et anti-angiogene forbindelser og / eller faktorer. Når man skal vurdere aktiviteten av en anti-angiogen forbindelse, inneholder pluggen normalt en blanding av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF), og den anti-angiogene stoffer kan administreres direkte inn i pluggen eller systemisk 3, 4.
ECM-ligne gel injiseres subkutant der det stivner i løpet av minutter. Vurderings rekruttering blodåre av i den resulterende pluggen er typically utført ved å måle hemoglobinnivå innenfor pluggen, ved fluorescens signal måling etter injeksjon av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket dekstran, ved farging av histologiske seksjoner for endotelceller spesifikke markører eller ved fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) 2,5, 6. Men denne vurderingen tillater bare ende-punkt-analyse og mangler informasjon om funksjonaliteten og morfologi av blodkar. I tillegg er måling av plasmavolumet, enten ved hemoglobinnivåer eller ved å bruke dekstran-FITC som en indikator, kan være misvisende fordi blodinnholdet påvirkes av størrelsen av blodkar og omfanget av stillestående dammer av blod. Dette er spesielt viktig når det rekruttert blodkar er preget av den forbedrede permeabilitet og oppbevaring (EPJ) effekt 7.
Vi heri foreslår en ny og mer nøyaktig metode for visualisering av de krutt blodkar ved å kombinere to komplementære bildediagnostikk. High-oppløsning mikrobobler kontrast-forsterket ultralyd (US) kombinert med intra nålefilt-konfokalmikroskoper endomicroscopy kan gi informasjon ikke bare om blod fartøy tetthet, men også på deres morfologi og funksjonalitet. Videre kan denne analysen utføres ved flere tidspunkter dermed muliggjør overvåking av angiogenese-kinetikk. USA er en mye brukt avbildningsfunksjonalitet som besitter høy romlig oppløsning for blodkar bildebehandling etter intravenøs (iv) injeksjon av mikrobobler som forblir utelukkende i den vaskulære rommet 8-11. Mikroboblene er gassfylte mikrobobler som produserer et sterkt ekkogene signal når eksitert med et US puls og således tjene som et godt kontrastmiddel. 3D bilder av pluggen er kjøpt ved hjelp av amerikanske imaging system software følgende mikrobobler ødeleggelse. Den resulterende bildene er sammensatt fra bilderammer før og etter ødeleggelsen av mikrobobler og reflekterer forskjellen i video intensitet i fargen. Disse overlappetBildene blir automatisk vises av programvaren. Følgelig kan den prosent av funksjonelle skip innen pluggen kvantifiseres. Høy oppløsning fibered konfokalmikroskoper endomicroscopy fungerer som en komplementær avbildningsfunksjonalitet ved å rapportere på blodkar morfologi. I dette minimalt invasive metoden, er bilder ervervet etter iv administrasjon av FITC-konjugert dekstran 12. Det fluorescerende polymer fargestoffer i blodet og tjener således som en "kontrastmiddel" for blodkar morfologi og blodstrøm. Dessuten, siden den injiserte polymer er i en størrelse på 70 kDa, det kan bare krysse utett fartøyer som befinner seg i tumorvaskulatur. Dette vil føre til høy bakgrunn fra FITC-merket dekstran utenfor blodårene. Følgelig kan fibered konfokalmikroskoper endomicroscopy brukes til å visualisere typiske karakteristikker av EPJ effekt på tumor neovasculature- forstørret, utett, høyt sammenfiltrede fartøy, med butte ender.
Dette systemet modellen ble descriSengen i sammenligning av den angiogene potensialet U-87 MG human glioblastoma og dets hvil klon 13. Vaskularisering innenfor pluggene ble evaluert tre uker etter ECM-ligne gel vaksinasjon. Det ble vist at vaskularisering i løpet av plugger som inneholder CM fra U-87 MG hurtig voksende tumor-genererende celler ble signifikant øket når det gjelder antall, tetthet og funksjonalitet, sammenlignet med vaskularisering i løpet av plugger som inneholder CM fra den sovende tumor-genererende celler. Derfor forfatterne var i stand til å konkludere med at CM isolert fra U-87 MG hurtig voksende tumor-genererende celler som inneholder høyere nivåer av pro-angiogene faktorer, sammenlignet med CM fra sovende tumor-genererende celler. Disse faktorene stimulere dannelsen av funksjonelle blodkar ved å positivt påvirke alle trinnene i den angiogene kaskade (dvs. proliferasjon, spirende, migrering og til slutt dannelse av rørformede strukturer av endotelceller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med standarder for Tel Aviv University Sackler School of Medicine Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Betinget av medier
- Seed 2 x 10 6 U-87 MG-celler i en 10 cm kulturplate i et volum på 8 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / nystatin løsning.
- Inkuber celler ved 37 ° C; 5% CO 2 til oppnå full confluency på 48 timer.
- Ved hjelp av en 10 ml sprøyte trekkes hele medium fra platen og filtreres gjennom et 0,45 um filter over i et 15 ml rør.
- Uten å vaske cellene plate, tilsett 1 ml trypsin løsning (0,25%) og ruge.
- Når alle cellene er frittliggende, inaktivere trypsin ved anvendelse av minst 5 ml DMEM supplert med 10% FBS og preform en celletelling.
- Overfør CM til en glassrundkolbe og konsentrer under høyt vakuum rotasjonsfordamper. For å akselerere prosessen, øker badtemperaturen til 37 ° C, hvis ønskelig. Fortsett til CM oppnår en lime-aktig struktur.
- Resuspender CM fra hver kulturplate i 400 ul saltvann. Når du bruker mer enn én plate, bruker tilsvarende volum. For eksempel for to kulturplater ved å bruke 800 pl. Bruk hver plate for 4 mus.
- For å kunne sammenligne ulike cellelinjer eller behandlinger, justere volumet i henhold til cellen forholdet mottatt i trinn 1.6. For eksempel, hvis en plate inneholder 1,5x flere celler, tilsett 200 mL av saltvann til de allerede eksisterende 400 mL. Dette vil være den justert CM
MERK: Den vil bli brukt senere for å normalisere CM konsentrasjon.
- Før inoculating ECM-ligne gel i mus, forberede følgende materialer:
- Vekst-faktorer reduseres fenol-fri ECM-etterligner gel (tine over natten, en dag før eksperimentet, ved 4 ° C på is).
- Barbermaskin.
- Ketamin og xylazin for å bedøve musene.
- Iskald 1000 mL sterile tips.
- Iskald 1 ml sprøyte og 27 G nåler.
- Forberede for hver mus en 1,5 ml Eppendorf rør som inneholder 80 mikroliter justert CM og holde på is.
- Til hvert rør, legge til 600 mL iskald vekstfaktorer redusert fenol-free ECM-ligne gel som ble tint over natten ved 4 ° C, på is. ECM-etterligner gel er væske i 4 ° C og størkner ved kroppstemperatur; for å hindre at ECM-ligne gel fra stivner, bruker iskalde 1000 mL tips. Bland rør forsiktig uten å danne bobler og holde på is.
- Bedøve seks ukers gamle BALB / c-mus ved bruk av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (12 mg / kg). Bekreft riktig anestesi i henhold til institusjonelle dyr omsorg og bruk komité, dvs. før start av forsøket. Dyr har nådd sin rette plan av anestesi når de ikke lenger svare på en fast tå klype.
- Barbere mageområdet av mus og desinfisere hjelp av et kirurgisk skrubb / alkohol.
- Bruke en kald 1 ml sprøyte og en 27 G nål for å injisere innholdet i Eppendorf-rør subkutant. Utføre injeksjonen veldig sakte for å unngå bobledannelse. Når alt volum administreres, ikke løse ut nålen i flere minutter, før størkning oppstår.
3. Evaluering av ECM-ligne Gel Plug vaskularisering hjelp av ultralyd
MERK: Denne delen av protokollen krever forkunnskaper for å drive en ultralyd imaging system, eller ved hjelp av en autorisert tekniker.
- Før du starter, har following materialer og instrumenter klare:
- Barbermaskin.
- Hårfjerningskrem.
- Ketamin og xylazin for å bedøve musene.
- Ikke-målrettede mikrobobler.
- Enhetsaktivering.
- USA imaging system inkludert en 55 MHz 708 sonde og en 3D-oppkjøpet micromanipulator.
- Mål vaskularisering innenfor pluggene tre uker etter vaksinasjon:
NB: I U-87 MG-baserte dyremodell, ble 3 uker funnet å representere den ideelle tidspunkt for avbildning. Under forskjellige innstillinger, kalibrere vaskularisering kinetikk med start fra noen dager etter vaksinasjonen av plugger.- Bedøve mus ved hjelp av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (12 mg / kg). Bekreft riktig anestesi i henhold til institusjonelle dyr omsorg og bruk komité, dvs. før start av forsøket. Dyr har nådd sin rette plan av anestesi når de ikke lenger svare på en fast tå klype.
- Barberemageområdet av mus og behandle med Hårfjerningskrem.
- Fest mus supinely på scenen av mikro-manipulator.
- Ved hjelp av en 1 ml sprøyte med saltvann og en 30 G nål, plasserer nålen inne i halevenen, fikse nålen fast og løsne sprøyten.
- Satt opp for Kontrast 3D-modus image oppkjøpet økt:
- Trykk på "3D" for å initialisere 3D-motor scenen og plassere svingeren i midten av det ønskede skanneområdet.
- Trykk på "3D" og innspill skanningen avstand og trinnstørrelse, og trykk deretter på "Scan".
- Sørg for at hele pluggen ble skannet i 3D-bildedata vises. Hvis ikke, juster svingeren slik at hele pluggen er synlig i skanningen og gjenta trinn 3.5.2.
- Trykk "Contrast" og trykk den tid gevinst kompensasjon (TGC) styrer mot venstre for å gjøre bildet mørkere.
- Aktiver mikrobobler med en ampulle mikser som er designated for aktivering av mikrobobler i 45 sek.
- Bland i en 1 ml sprøyte 50 ul av mikrobobler med 50 mL saltvann.
- Erstatte saltholdige løsnet sprøyte med en sprøyte som inneholdt aktiverte mikrobobler. Injisere utvannet mikrobobler inn i halevenen av mus, vente noen sekunder for boblene for å nå en stabil tilstand, og deretter kjøpe 3D kontrastforsterket cine løkke av pluggen, ved hjelp av 3D-oppkjøpet motor:
- Trykk på "3D" og velg "Scan" for å hente bilder 3D kontrastforsterket og deretter trykke "Cine Store" for å lagre bildedata.
- Trykk på "3D" og klikk "Destroy 3D" for å ødelegge mikrobobler.
- Trykk på "3D" igjen og velg "Scan" for å skaffe seg en post-ødeleggelse cine loop, deretter trykker du "Cine Store".
- Generere overlay bilde rammer før og etter ødeleggelsen av mikrobobler:
- I &# 8220; Referanse Settings "på venstre side av skjermen klikker du på" Create Reference ".
- Trykk "Study Management" for å åpne den pre-ødeleggelse cine sløyfe ervervet.
- Klikk "Process Cine" for å generere den grønne kontrast overlegg, og klikk på «Load Into 3D".
- Bruker amerikanske bildebehandlingsprogrammer for å kvantifisere den resulterende 3D-bilde for blodvolum innenfor pluggene:
- Trykk på "Scan / Freeze" og trykk "Modusinnstillinger".
- Klikk "Volume" og velg "Parallell".
- Lag et 3D volum av målvevet ved å segmentere en serie av konturer.
- Klikk på "Finish" for å fullføre segmentering.
MERK: Volumet av kontrastmidlet vil bli vist på nedre venstre side av skjermen.
- På slutten av prosedyren, plasserer mus i en varm, ren og tørr, rolig miljø unnaandre dyr. Gi varme ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kirurgisk oppvarming puten eller en glødelampe (50-75 watt), plassert 12-14 inches unna gnager. Overvåke mus kontinuerlig til å opprettholde oppreist holdning og gå som normalt.
4. Evaluering av ECM-ligne Gel Plug blodkar Morfologi hjelp fibered Confocal Endomicroscopy
MERK: denne delen av protokollen utføres umiddelbart etter amerikanske bildebehandling og det krever forkunnskaper for drift av fibered konfokal endomicroscopy imaging system, eller ved hjelp av en autorisert tekniker.
- Før du starter, har følgende materialer og instrumenter klare:
- Kirurgi verktøy som pinsett, saks og absorberbare sytråd.
- FITC-konjugert dekstran (70 kd).
- Kalibrerings løsninger (tre rør hver inneholdende hydrogenperoksyd, vann eller fluorescerende oppløsning).
- Bildebehandlingssystem og ensonde egnet for avbildning av blodkar i henhold til produsenten.
- Bedøve mus ved hjelp av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (12 mg / kg).
- Administrere iv, via halevenen, 200 ul 10 mg / ml FITC-merket dekstran.
- Desinfisere mageområdet ved hjelp av en kirurgisk skrubb / alkohol og bruke et lite snitt ca 1 cm fra pluggen.
- Plasser endomicroscopy sonden på toppen av pluggen forsiktig samtidig holde pluggen intakt.
- Oppkjøpet:
- Når sonden er satt på pluggen, trykker du "Start laser" ved hjelp av fotpedal. Fluorescens som skal vises på skjermen.
- Erverve korte filmer (opp til 30 sek) ved å trykke på "Record" på skjermen eller på Velg ved hjelp av fotpedal.
- Mellom film, vaske sonden ved å plassere spissen i et rør som inneholder vann.
- Når du er ferdig, fjern sonden og rengjør spissen med en bomullspinne.
- Å analysere bety vessel diameter:
- Klikk på "Detect microvessels" ikonet i øvre panel for å åpne fartøyet deteksjonsmodul vinduet.
- Klikk på "Preferences" og markere "Mean fartøy diameter" i «Statistisk av interesse" og "Vis histogram barer" i "Display mode".
- Klikk "søk" for å vise de valgte målinger.
- Å analysere fluorescerende signal intensitet i områder som grenser til blodkar:
- Klikk på "Opprett sirkel ROI" på venstre panel og lage en sirkel i det aktuelle området.
- Klikk "Beregn histogrammet innenfor ROI" for å beregne verdier knyttet til denne regionen.
5. Post-prosessuelle Behandling av Mus
- På slutten av hvert bilde prosedyre, plasserer mus i en varm, ren og tørr, rolig miljø bort fra andre dyr. Gi varme ved hjelp av en kommersielt-enTilg kirurgisk oppvarming puten eller en glødelampe (50-75 W) som er lagt inn 12-14 i unna gnager. Overvåke mus kontinuerlig til å opprettholde oppreist holdning og gå som normalt.
- For ytterligere analyse av plugger 'vaskularisering på flere tidspunkter, gjelder følgende gjenopprettings vilkår:
- Sutur lite snitt ved bruk av absorberbare suturer.
- Gi mus analgesi som buprenorfin (1 mg / kg) subkutant, og gå tilbake til den enkelte merder.
- Observere alle dyr for å avgjøre om ytterligere smertestillende behandling er nødvendig og re-evaluere daglig for å overvåke og vurdere for nød.
- Ved endepunktet av eksperimentet, avlive mus ved først å påføre isofluran, etterfulgt av cervikal dislokasjon.
- Hvis ytterligere bildebehandling vil bli utført i ukene etter de første bilde trinnene, skal alle prosedyrer holdes så sterilt som mulig. En kirurgisk hud skrubb bør utføres, steril water og steril bomulls tips bør brukes til å rengjøre endomicroscopy sonde, og sonden bør desinfiseres mellom hvert dyr ved hjelp av sterilt vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Implantere ECM-ligne gel plugger med CM fra raskt voksende angiogent svulst generercellelinje U-87 MG, resulterer i omfattende angiogenese. Dette blodkar kan i stor utstrekning utforskes ved hjelp av to komplementære avbildningsmetoder.
Mikrobobler kontrastforsterket amerikanske bildebehandling avslører omfattende rekruttering av funksjonelle blodårer inn pluggen ved å illustrere omfattende blodstrømmen i U-87 MG CM lastet plugger, i motsetning til undetectable blodstrøm innenfor plugger som inneholder CM fra sovende tumor genererende celler (figur 1) .
Morfologi av disse nydannede blodkar understrekes av fibered konfokal endomicroscopy (figur 2). Blodårene i plugger lastet med U-87 MG CM utstilt morfologi typisk til økt permeabilitet og oppbevaring (EPJ) effekt for makromolekyler som Dextran-FITC på 70 kDa størrelse som brukes her. Blodkar ble utvidet og høyt ta ngled, med ikke-kontinuerlig og svak flow (Figur 2A, C). Også lekkasje av blod ble observert i det omgivende miljø, som vist ved høy fluorescerende signal utenfor blodkarene (figur 2B).
Figur 1:. Microbubbles kontrastforsterket amerikanske bildebehandling Etter intravenøs administrasjon av mikrobobler og deres ødeleggelse, U-87 MG CM inneholder plugger utstillings økt vaskularisering (i grønt). Plugger som inneholder CM fra U-87 MG-avledet sovende tumor genererende celler ble brukt som kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Src =" / files / ftp_upload / 51525 / 51525fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Fiber konfokalmikroskopi bildebehandling. (A) Intravenøs administrering av 70 kDa Dextran-FITC, muliggjør visualisering av blodstrømmen og blodårer morfologi. U-87 MG CM inneholder plugger blodkar består av utette, forstørrede fartøy med blunts slutter. Blodkar lekkasje er utstilt ved fluorescerende signal utenfor blodkar. Normal vaskulatur hos mus magen ble anvendt som kontroll. (B) Fluorescent signalintensitet i områder som grenser til blodkar. Det fluorescerende signalet er eksemplifisert ved et spektrum fra rødt til hvitt. Mørk rød representerer lav signalintensitet, mens hvit representerer høy fluorescerende signal. U-87 MG CM inneholder plugger viser en klar fluorescerende signal utenfor fartøyene, mens ingen signal vises utenfor normale kar. (C) Mean Vessel Diameter (MVD) av blodkar i U-87 MG CM inneholder plugger (22,4 mm) er significantly høyere sammenlignet med MVD av normale kar (6,7 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinere komplementære avbildningsmetoder gjør at tilegnelsen av informasjon om ulike angiogenese komponenter 'microvessel tetthet, funksjonalitet og morfologi. Lasting CM på ECM-ligne gel plugger genererer en svulst mikromiljøet, som er atskilt fra andre cellepopulasjoner, som endotelceller, som er rekruttert og ekstravasere inn pluggen.
Ved å utføre, parallelt, mikrobobler kontrastforsterket amerikanske bildebehandling og fibered konfokal endomicroscopy bildebehandling, kan vi konkludere med at en pool av faktorer utskilles raskt voksende angiogeniske svulster genererer celler, uten kreftcellene selv, kan ikke bare rekruttere blodårene, men også danne funksjonelle blodkar med EPJ typiske kjennetegn. Videre tillater denne fremgangsmåte avstanden mellom virkningen av de utskilte faktorer og celle-til-celle-interaksjon i tumormikromiljøet.
Informasjon hentet fra USA og fibered konfokalendomicroscopy er imidlertid utsatt for begrensning av avbildningsteknikk. For eksempel, ved bruk av konfokal fibered endomicroscopy avbildning, er det umulig å avbilde en enkelt bestemt blodåre over tid, eller til og med det samme området ved pluggen.
ECM-ligne gel plug-analysen er relativt lett å utføre, og dette er vedvarende når du legger CM med ECM-ligne gel. Men et kritisk problem som bør tas i betraktning er det CM til ECM-ligne andel gel. Høye volumer av CM kan hindre at ECM-ligne gel fra stivner. Derfor bør CM beløpet ikke overstiger ca 13% av ECM-ligne gel.
Denne fremgangsmåte kan tilpasses for forskjellige eksperimentelle systemer og anvendelser. For eksempel kan det brukes til å vurdere antiangiogene narkotika ved lasting CM fra pre- og post-behandlede celler. I tillegg kan andre cellelinjer brukes under disse eksperimentinnstillinger. Imidlertid er kalibrering nødvendig for å enpply den optimale CM konsentrasjon. Videre bør det ideelle tidspunkt for avbildning bli optimalisert i henhold til hver modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K.
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
