Summary
Lineær-forstærkning medieret (LAM)-PCR er en metode udviklet til at identificere de præcise positioner for at integrere virale vektorer i genomet. Teknikken har udviklet sig til at være den overlegne metode til at studere klonale dynamik i patienter genterapi, biosikkerhed af nye vektor teknologier, T-celle mangfoldighed cancer stamceller modeller osv.
Introduction
Lineær amplifikation medieret PCR (LAM-PCR) kan identificere og karakterisere ukendt flankerende DNA tilstødende til kendte DNA af enhver oprindelse. Mere specifikt har LAM-PCR er blevet udviklet til at lokalisere viral vector integration sites (IS) i værtsgenomet 1,2. Genetiske elementer som retrovirus eller transposoner integrerer deres genom i værtens genom i en (semi-) tilfældig måde 3-6. I mange tilfælde er det afgørende at vide præcis den position, hvor disse vektorer integreret. LAM-PCR har vist sig at være overlegen i forhold til alternative teknikker som ligatur-medieret PCR 7 og dens varianter eller omvendt PCR 8. Følsomheden og robusthed denne metode hidrører fra første forstærkertrinene af vektor-genom kryds og magnetisk udvælgelse af amplificerede PCR-produkter. Ligesom de alternative metoder, der er nævnt, LAM-PCR bygger på anvendelsen af restriktionsenzymer, indførelse af en skævhed i hentning kapacitet IS 9-11. Såledeskun en delmængde af IS repertoiret (det integrome) kan detekteres i en reaktion. Denne skævhed er minimeret ved den parallelle analyse af en given prøve at bruge optimale kombinationer af restriktionsenzymer 9. For nylig, en variant af teknologien betegnes ikke-begrænsende LAM-PCR (nrLAM-PCR) er blevet udviklet, omgår anvendelsen af restriktionsenzymer og tillader objektiv genom-dækkende analyse af en prøve i en enkelt reaktion 9,12.
I fortiden, har LAM-PCR er blevet brugt til at identificere den sygdomsfremkaldende retroviral giver anledning til leukæmi hos nogle få patienter i kliniske forsøg med genterapi 13-15. Siden da har LAM-PCR er blevet tilpasset til at identificere IS fra andre integrerende vektorer (lentivirale vektorer, transposoner) og også til at identificere integration mønstre af passivt integrere vektorer som adenoassocierede vektorer (AAV) eller integrase defekt lentivirusvektorer (IDLV) 16 -21. Anvendelser af LAM-PCR er udbredt: traditionelly, er teknikken udbredt til at studere klonal sammensætning af gen modificerede celler hos patienter, der har gennemgået genterapi eller vurdere biosikkerhed af nye vektorsystemer ved optrevling deres integration adfærd 15,16,22-24. For nylig LAM-PCR aktiveret bestemme specificitet og off-target aktivitet designer nucleaser ved en IDLV fældefangst assay 25.
Desuden LAM-PCR gør det muligt at nemt følge skæbnen for en transduceret celle over tid i en organisme. Dette gør det muligt at identificere protoonkogener samt tumorsuppressorgener og også til at studere hæmatopoiese eller cancer stamcellebiologi 26-28. Sidst men ikke mindst, er LAM-PCR tilpasset til at undersøge T-celle-receptor mangfoldighed i mennesker 29 (og upublicerede data).
Den iboende kraft af teknologien er forstærket ved at knytte den metode til dyb sekventering teknologier, der tillader karakterisere millioner af ukendte flankerende DNA med en enkelt nukleotid resolution i hele genomer. I det følgende protokol beskriver vi trin-trin forstærkning og identifikation af flankerende ukendt DNA eksemplarisk at identificere lentivirusvektor IS. Oligonukleotider, der anvendes i protokollen, er anført i tabel 1.. Ekstraherede DNA eller cDNA af enhver kilde kan anvendes som DNA-template for LAM-PCR og nrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Linker Kassetter (LC)
- Bland 40 pi LC1 oligonukleotid (tabel 1), 40 pi LC2 oligonukleotid (tabel 1 med passende restriktionsenzym overhæng), 110 pi Tris-HCI (100 mM, pH 7,5) og 10 pi 250 mM MgCl2.
- Inkuber ved 95 ° C i 5 min og lad reaktionsblandingen afkøle langsomt til stuetemperatur. Tilsæt 300 ul H2O og koncentrere dsLinker-DNA på en centrifugering filter. Tilføj 80 pi H 2 O til eluatet og alikvote 10 ul af tilberedt linker kassette i 0,2 PCR-rør.
2.. Preamplification af vektorgenom Junctions
- For hver prøve, der skal analyseres forberede en 50 gl PCR-reaktionen.
- Bestem koncentrationen af DNA-prøver. Pipette x pi (1-1000 ng til LAM/100-1, 000 ng til nrLAM) af DNA i et 0,2 ml PCR-rør. Volumen af DNA skal være ens i hver prøve og i løbge af 0.5 til 25 ul.
- Forbered PCR masterblanding som beskrevet i tabel 2. Mix (50 - x). Pi af master mix med hver DNA-prøve i 0,2 ml PCR-rør.
- Preamplify vektorgenom vejkryds ved hjælp af PCR-forhold eksemplificeret i tabel 2. Efter afslutningen af PCR tilføje 0,5 gl Taq Polymerase til hvert PCR-rør og genudsendelse PCR-programmet. PCR-produkter kan opbevares ved 4 ° C i op til 4 dage eller længere sigt ved -20 ° C.
3.. Magnetic Separation af PCR-produkt
- Udarbejdelse af Magnetic Beads
- Pipetter 20 ul (200 mg) af streptavidin-coatede magnetiske perler i et 1,5 ml rør og udsætte i 1 min på den magnetiske partikel separator (MPS) ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
- Fjern røret fra MPS og resuspender magnetiske perler i 40 pi PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Udsættes for MPS i 1 min og kassér supernatanten. Gentag dette trin én gang.
- Vask perler with 20 pi 3 M LiCI-opløsning (3 M LiCI, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) udsættes for MPS i 1 min og kassér supernatanten. Resuspender perler i 50 pi af 6 M LiCI-opløsning (6 M LiCI, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA).
- Bland hele PCR-reaktion fra trin 2.2 med 50 pi forberedte magnetiske perler. Inkuber på en horisontal ryster (300 rpm) i mindst 2 timer ved stuetemperatur. Dette trin tillader binding af biotinyleret PCR-produkt til streptavidin-coatede kugler (DNA-Bead komplekse). DNA-kugle-kompleksdannelse kan inkuberes på rysteapparatet natten eller opbevaret ved 4 ° C i op til 4 dage.
- Udsætte DNA-Bead kompleks MPS i 1 minut ved stuetemperatur fjernes supernatanten og resuspender DNA-Bead-kompleks i 100 ul H 2 O. Fortsæt straks med trin 4 for LAM eller trin 5 for nrLAM.
4.. LAM-Procedure
- Dobbeltstrenget DNA (dsDNA) Syntese (LAM kun)
- Expose DNA-Bead kompleks fra trin 3,3 til MPS i 1 min og diskort supernatant. Tilføj 8,25 pi H2O, 1 gl 10x hexanucleotid buffer, 0,25 pi dNTPs (10 mm) og 0,5 pi (2 U) Klenow polymerase. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Tilføj 90 ul af H 2 O og udsættes for MPS til 1 min. Supernatanten kasseres, og resuspender DNA-Bead-kompleks i 100 ul H 2 O.
- Restriktionsfordøjelse
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS i 1 min og kassér supernatanten. Tilføj 8,5 pi H2O, 1 pi 10x restriktionsenzym buffer og 0,5 ul restriktionsenzym og inkuber reaktion i 1 time. Gentag trin 4.1.2.
BEMÆRK: Inkuber reaktion ved den temperatur, der anbefales af producenten af restriktionsenzymet. Kontroller, at der ikke er nogen restriktionssted til stede i eller nedstrøms for primerbindingssted anvendes til forforstærkning i DNA'et af interesse. For valg af egnede enzym restriktionsenzymer / begrænsning kombinationer henvise til 9..
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS i 1 min og kassér supernatanten. Tilføj 8,5 pi H2O, 1 pi 10x restriktionsenzym buffer og 0,5 ul restriktionsenzym og inkuber reaktion i 1 time. Gentag trin 4.1.2.
- Ligering af ds Linker (LK)
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS i 1 min og kassér supernatanten. Tilsæt 5 ul H2O, 1 pi 10x FastLink buffer, 1 pi ATP (10 mM), 2 pi Linker kassette fra trin 1.2 og 1 pi Fast-Link DNA Ligase (2 U / ul). Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min. Gentag trin 4.1.2.
- Denaturering af syntetiseret dsDNA
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS i 1 min og kassér supernatanten. Resuspender DNA-Bead kompleks i 5 pi 0,1 N NaOH. Inkuber 5 min ved stuetemperatur på en horisontal ryster.
- Expose DNA-Bead kompleks til MPS i 1 min og indsamle forforstærkede vektor-genom krydset supernatant i ny 1,5 ml rør. Fortsæt straks med trin 6 eller butik supernatanten ved -20 ° C.
5.. NrLAM-Procedure
- Ligering af enkeltstrenget linker (SSLC) (nrLAM kun)
- Expose DNA-Bead kompleks fra trin 3,3 til MPS1 min kassere supernatanten. Tilføj 6,5 pi H2O, 1 gl CircLigase 10x Reaction Buffer, 0,5 pi MnCI2 (50 mM), 0,5 pi ATP (1 mM), 1 gl ssLinker oligonukleotid og 0,5 pi CircLigase (100 U / ul). Inkuber ved 60 ° C i 1 time.
- Tilføj 90 ul af H 2 O og udsættes for MPS til 1 min. Supernatanten kasseres, og vask DNA-Bead-kompleks i 100 ul H 2 O. Igen udsættes for MPS til 1 min, discard supernatanten og resuspender DNA-Bead kompleks i 10 pi H 2 O.
6.. Eksponentiel Amplification I
- For hver prøve, der skal analyseres forberede en 50 gl PCR-reaktionen.
- Afpipetteres 2 pi skabelon-DNA (fra trin 4.4.2 (LAM), eller 5.1.2 (nrLAM)) i en 0,2 ml PCR-rør.
- Forbered PCR masterblanding som beskrevet i tabel 3.. Tilføj 48 ul mester mix til hver prøve fra trin 6.1.1 og forstærke vektorgenom vejkryds ved PCR conditions eksemplificeret i tabel 3. PCR-produkter kan opbevares ved 4 ° C i op til 4 dage eller længere sigt ved -20 ° C.
7.. Magnetisk separation af PCR-produkt
- Forbered magnetiske perler som eksemplificeret i trin 3.1.1 - 3.1.3. Resuspender perler i 20 pi (for LAM) eller 50 pi (for nrLAM) 6 M LiCI-opløsning (6 M LiCI, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA). Mix 20 pi (LAM) eller 50 pi (nrLAM) af PCR-reaktionen fra trin 6.1.2 med forberedte magnetiske perler (trin 7.1) og inkuberes på en horisontal ryster (300 rpm) i 2 timer ved stuetemperatur. DNA-kugle-kompleksdannelse kan inkuberes på rysteapparatet natten eller opbevaret ved 4 ° C i op til 4 dage.
- Udsætte DNA-Bead kompleks MPS for 1 min, fjerne supernatanten og resuspender DNA-Bead-kompleks i 100 ul H 2 O. Expose DNA-Bead kompleks til MPS i 1 min og kassér supernatanten.
- Resuspender DNA-Bead kompleks i 20 pi (LAM) eller 5 pi (nrLAM) 0,1 N NaOH. INCUdebat i 10 minutter ved stuetemperatur på en horisontal ryster, udsættes for MPS i 1 min og indsamle amplificeret DNA indeholdende supernatant i ny 1,5 ml rør. Fortsæt straks med trin 8.1 eller butik supernatanten ved -20 ° C.
8.. Eksponentiel Amplification II
- For hver prøve, der skal analyseres forberede en 50 gl PCR-reaktionen.
- Pipetter 2 ul template DNA (fra trin 7.3) i et 0,2 ml PCR-rør.
- Forbered PCR masterblanding som beskrevet i tabel 4.. Læg 48 pi masterblandingen hver prøve fra trin 8.1.1 og forstærke vektorgenom vejkryds ved PCR-betingelser, der er eksemplificeret i tabel 4.. PCR-produkter kan opbevares ved 4 ° C i op til 4 dage eller længere sigt ved -20 ° C.
- At visualisere (NR) LAM-PCR-produkter, belastning 10 pi af PCR-produktet fra trin 8.1.2 på en 2% agarosegel. Hvis bands er synlige, analysere 10 ul af LAM-PCR-produkt på høj opløsning gel. ADVARSEL: Ethidium bromid er mutagent. Arbejde meget omhyggeligt og altid bære egnede handsker.
9.. Forberedelse til High-throughput sekventering
- Oprensning af (NR) LAM-PCR-produkter
- Bland 40 pi PCR-produkt fra trin 8.1.2 med 44 pi stuetemperatur AMPure XP Magnetiske perler. Inkuber 5 min ved stuetemperatur og udsættes for MPS i yderligere 2 min.
- Supernatanten kasseres, og vaskes to gange med 200 pi 70% EtOH på MPS.
- Supernatanten kasseres, og resuspender DNA-Bead-kompleks i 30 ul H2O Inkuber 1 min og overførsel supernatanten til friske 0,2 ml rør. Bestem koncentrationen af renset DNA.
- Fusionprimer PCR til at tilføje sekventering specifikke adaptere.
- For hver prøve, der skal analyseres forberede en 50 gl PCR-reaktionen.
- Pipette x pi (40 ng) af DNA i et 0,2 ml PCR-rør. Volumen af DNA skal være ens i hver prøve, og i området fra 0.5 til 25 ul.
- Forbered PCR Master Mix, som beskrevet i tabel 5 Tilføj (50 - x). Gl master mix til hver prøve fra trin 9.2.2 og introducere Sekvenseringskabler adaptere til (NR) LAM-PCR-produkter af PCR-forhold eksemplificeret i Tabel 5 PCR-produkter. kan opbevares ved 4 ° C i op til 4 dage eller længere sigt ved -20 ° C.
- At visualisere Fusionprimer-PCR produkter belastning 10 pi af PCR-produktet fra trin 9.2.3 på en 2% agarosegel. Rense resterende PCR-produkt som beskrevet i trin 9.1.1 - 9.1.3. Analyser 1 ml renset PCR-produkt fra trin 9.4 på et automatiseret høj opløsning elektroforeseapparat til præcist at kvantificere koncentrationen og fragment størrelse Fusionprimer-PCR-produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR resulterer i opformering af vektorgenom vejkryds med en defineret fragment størrelse for hver krydset. Størrelsen af individuelle PCR-fragmenter er afhængig af afstanden mellem placeringen af kendte DNA i genomet, og den nærmeste restriktionsenzym genkendelsessted. Dette gør det muligt at visualisere de forskellige amplificerede kryds i analyserede prøver ved hjælp af gelelektroforese, f.eks. Hvis kun single (monoklonale), flere (oligoclonal) eller flere (polyklonale) bånd er til stede på gelen. Resultaterne af LAM-PCR ses bedst ved høj opløsning elektroforesegeler (figur 2A), men kan også visualiseres på 2% agarosegeler (figur 2B). nrLAM-PCR resulterer i PCR-fragmenter af forskellig længde for hver enkelt knudepunkt. Således monoklonale, oligoklonale eller polyklonale prøver vises som en udstrygning ved elektroforese, og kan ikke skelnes visuelt. Visualisere nrLAM-PCR-produktet på 2% agarosegel er tilstrækkeligt at fastslå succes af protokollen (figur 2C). Efter sekventering af den genvundne genomisk DNA kan tilpasses til den respektive værtsgenomet at identificere nøjagtige position af placeringen af vektoren (figur 3A). Annotation af genomet gør det muligt at analysere IS repertoire for forskellige vektor specifikke funktioner som præference for integration i gen kodende regioner (figur 3B) eller tæt på transcription start sites (figur 3C).
Fig. 1. Skematisk skitse af LAM-PCR og nrLAM-PCR. A) Begge metoder begynder med en indledende forforstærkning af vektor genomet knudepunkter anvender biotinylerede primere hybridiserer tæt på slutningen af den kendte DNA-sekvens (her den lange terminale gentagelse (LTR) af en retroviral vektor). Forforstærkning resultater i biotinyleretssDNA af forskellig størrelse for identiske eller forskellige vektorgenom vejkryds. Biotinyleret ssDNA er fanget på magnetiske partikler. B) Ved LAM PCR enzymatiske reaktionstrin sammensat af dsDNA syntese, restriktionsfordøjelse og ligering af en kendt linker-DNA frembringe produkter af forskellige størrelser med kendte sekvenser i begge ender af produktet. På grund af begrænsninger polymorfisme hver amplificeret junction har en karakteristisk længde. Efter denaturering LAM-PCR-produktet amplificeret ved nested PCR med linker-og vektor-specifikke primere. C) For nrLAM et ssDNA linkersekvens direkte ligeret til det ukendte ende af forforstærkede ssDNA fra A) tillader eksponentiel amplificering af nestet PCR med linkeren og vektor-specifikke primere. Dette tal er blevet ændret fra 2,12. Klik her for at se en større version af dette tal. >
Figur 2. Repræsentative resultater af LAM-PCR og nrLAM-PCR. A, B) LAM-PCR-analyse af isoleret DNA fra perifert blod fra patienter genterapi behandles. Antallet af bånd på gelen svarer til antallet af til stede i prøven. Høj opløsning geler (B) er bedre egnet til at visualisere klonalitet analyserede prøver end 2% agarosegeler (A). C) nrLAM-PCR-analyse af lentivirusvektor transducerede enkelte cellekloner eller bulk celler. Uafhængig af antallet af amplificerede indsættelsessteder et smear ses på gelen efter elektroforese. M, 100 bp stigen; MC, monoklonale; OC, oligoklonalt; PC, polyklonale. Dette tal er blevet ændret fra 2,9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3.. Repræsentative eksempler på IS analyse af LAM-PCR og efterfølgende high-throughput sekventering. IS fordeling i to patienter fra gammaretroviral (blå) eller lentiviral (grøn) kliniske forsøg med genterapi. Efter sekventering og kortlægning af LAM-PCR-produkter til det respektive genom kan IS evalueres f.eks.. A) Genom-dækkende distribution af IS B) Forskel i henhold til præference for indsættelse i gen kodende regioner mellem gammaretroviral og lentivirusvektorer og C) præference for indsættelse tæt på transcription start sites. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Formål | Navn | Sequence (5'-3 ') |
| LK-universal | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplification | LTR-I (3'-retning) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR (5'-retningen) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Eksponentiel forstærkning I | LTR-II (3'-retning) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-retning) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Eksponentiel forstærkning II | LTR-III (3'-retning) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-retning) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabel 1. Oligonukleotider for LAM-og nrLAM-PCR til at opformere lentiviral IS. SSLC er phosphoryleret ved 5'-enden (P) og har ved 3'didesoxycytidin (ddC) for at undgå multimerisering af SSLC under ligering. I almindelighed (ir) LAM-PCR-primere skal bestå af 18-25 nukleotider, og bør ikke justeret med værtsgenomet. Primere til forforstærkning bør placeres så tæt som muligt (≤ 120 bp) til 5 'eller 3' enden af vektoren. To yderligere primere til eksponentiel PCR I og II skal placeres mellem primerenanvendes til forforstærkning og vektoren ende. Primere til forstærkertrinene og Eksponentiel PCR jeg skal være 5'-phosphoryleret (P).
| Reagens | Volumen (ul) | Koncentration | PCR-parametre | Temperatur | Tid | |
| H2O | 43 - x | Indledende denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5. | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sekunder | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0,5 uM (nrLAM) | Annealing | 60 ° C | 45 sekunder | 2 x 50 cykler |
| LTR-I | 0.5 | 0,17 uM | Forlængelse | 72 ° C | 60 sek (LAM); 10 sek (nrLAM) | |
| TaqPolymerase | 0.5 | 2,5 U / pl | Final Forlængelse | 72 ° C | 5 min (kun LAM) |
Tabel 2. PCR-Betingelser for forforstærkning af vektor genomet knudepunkter (trin 2). Columns 1-3 viser PCR-reagenser, der anvendes til amplifikation af et enkelt DNA-prøve. Kolonne 4-6 eksemplificerer PCR programmet preamplify vektorgenom vejkryds.
| Reagens | Volumen (ul) | Koncentration | PCR-parametre | Temperatur | Tid | |
| H2O | 40.5 | Indledende denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5. | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sekunder | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Annealing | 60 ° C | 45 sekunder | 35 cykler |
| LTR-II | 0.5 | 16.7 uM | Forlængelse | 72 ° C | 60 sek (LAM); 5 sek (nrLAM) | |
| LC-I | 0.5 | 16.7 uM | Final Forlængelse | 72 ° C | 5 min (kun LAM) | |
| Taq-polymerase | 0.5 | 2,5 U / pl |
Tabel 3. PCR-betingelser til eksponentiel amplifikation I (trin 6). Kolonne 1-3 viser PCR-reagenser, der anvendes til eksponentiel amplifikation af et enkelt DNA-prøve. Kolonner 4-6 eksemplificere PCR program, der bruges til eksponentielt forstærke en prøve efter Ligering af linker sekvens.
| Reagens | Volume (ul) | Koncentration | PCR-parametre | Temperatur | Tid | |
| H2O | 40.5 | Indledende denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffer | 5. | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sekunder | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Annealing | 60 ° C | 45 sekunder | 35 cykler |
| LTR-III | 0.5 | 16.7 uM | Forlængelse | 72 ° C | 60 sek (LAM); 5 sek (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16.7 uM | Final Forlængelse | 72 ° C | 5 min | |
| Taq-polymerase | 0.5 | 2,5 U / pl |
Tabel 4. PCR-betingelser til eksponentiel amplifikation I (trin 8). Kolonne 1-3 viser PCR-reagenser, der anvendes til indlejrede eksponentiel amplifikation af en enkelt prøve. Kolonner 4-6 eksemplificere PCR program, der bruges til indlejrede eksponentiel opformering af vektorgenom kryds fra en prøve.
| Reagens | Volumen (ul) | Koncentration | PCR-parametre | Temperatur | Tid | |
| H2O | 42.5 - x | Indledende denaturering | 95 ° C | 2 min | ||
| Buffer | 5. | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sekunder | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Annealing | 58 ° C | 45 sekunder | 12 Cycles |
| Fusionprimer A | 0.5 | 10 uM | Forlængelse | 72 ° C | 60 sek | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 uM | Final Forlængelse | 72 ° C | 5 min | |
| Taq-polymerase | 0.5 | 2,5 U / pl |
Tabel 5. PCR-Betingelser for Fusionprimer-PCR (trin 9.2). Kolonne 1-3 viser PCR reagenser, der anvendes til introduktion af sekventering adaptere til (NR) LAM-PCR-produkter. Kolonner 4-6 eksemplificere PCR program, der bruges til Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LAM-PCR teknik tillader at identificere ukendte DNA-sekvenser, der flankerer en kendt DNA-region. På grund af den høje følsomhed som følge af forforstærkning af kryds med specifikke primere, der hybridiserer i kendte DNA-sekvens, er det muligt at amplificere og påvise selv sjældne kryds ned til enkelt celle niveau. Derimod er der i et polyklonalt situation, LAM-PCR er i stand til at forstærke tusindvis af forskellige knudepunkter i en enkelt reaktion.
, På grund af anvendelsen af restriktionsenzymer imidlertid kun underfraktion af integrome kan analyseres ved LAM-PCR for tilstedeværelsen af kryds med hvert enkelt restriktionsenzym. Således anbefales 9 gentagne analyser af den samme prøve med forskellige enzymer. Hvis ingen af LAM-PCR amplikoner er til stede på gelen, mest sandsynligt afstanden mellem placeringen af den kendte DNA-fragment og den nærmeste genkendelsesstedet enzym valgt begrænsning er for stor til at resultere i LAM-PCR-produkter9.. I dette tilfælde bør der anvendes andre enzymer til at forstærke krydset.
nrLAM er uafhængig af anvendelse af restriktionsenzymer og repræsenterer derfor en meget værdifuld metode til omfattende karakterisere sekvenser, der flankerer en kendt DNA-sekvens. Udelade restriktionsfordøjelsesprodukt fra protokol resulterer i tab af specifik begrænsning polymorfisme karakteriserer hver forstærket krydset. I stedet hver amplificeret krydset er repræsenteret ved PCR-produkter af forskellige størrelser, hvilket resulterer i en udstrygning på gelen efter elektroforese, uafhængigt af mangfoldigheden af amplificerede vejkryds.
Både LAM-og nrLAM-PCR-produkter er perfekt egnet til nedstrøms high-throughput sekventering. High-throughput sekventering (NR), LAM-PCR-produkter og kortlægning af hentet rå sekvenser til det tilsvarende genom tillader karakterisering ukendt flankerende DNA eller identificere den præcise lokalisering af vektor-genom vejkryds 30.Ved at indføre stregkode sekvenser i fusionprimers flere hundrede LAM-og nrLAM-PCR-produkter kan sekventeret i en sekventering løb 30.
På grund af høj følsomhed, LAM-PCR er tilbøjelig til forurening, hvis henrettet uopmærksomt. Således er en PCR-grade miljø og særlig opmærksomhed til at rense håndteringen af protokollen er af yderste vigtighed at kunne forstærke det ukendte flankerende DNA uden at forurene prøver. Derfor herunder untransduced genomisk DNA og en vand-kontrol for hver PCR-reaktion som negative kontroller i LAM-PCR-protokol anbefales kraftigt. Hvis kontrolprøver viser, at krydskontaminering opstod under protokollen, kan produkterne fra hver pause punkt bruges til at gentage dele af protokollen. Når bands er stadig til stede, anbefales det at kassere alle reagenser (f.eks., Primere, dNTP'er, polymeraser, osv.) og gentage (nr) LAM-PCR-protokol med nye portioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
