Summary
선형 증폭 중재 (LAM)-PCR은 게놈에 바이러스 벡터를 통합의 정확한 위치를 식별하기 위해 개발 된 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료 환자 등 새로운 벡터 기술, T-세포의 다양성, 암 줄기 세포 모델의 바이오 안전성에 클론 역학을 공부하는 우수한 방법으로 진화하고있다
Introduction
선형 증폭 PCR (LAM-PCR)을 매개하는 모든 근원의 알려진 DNA에 인접한 알 수없는 측면에서는 DNA를 식별하고 특성화 할 수 있습니다. 보다 구체적으로, LAM-PCR은 숙주 게놈 내에서 1,2 (IS) 바이러스 벡터의 삽입 부위를 집중하기 위해 개발되었다. 레트로 바이러스 나 트랜스포존과 같은 유전 적 요소는 (반) 임의의 방식 3-6 호스트 게놈에 자신의 게놈을 통합 할 수 있습니다. 많은 경우에 이러한 벡터가 통합 정확하게 위치를 알고 결정적이다. LAM-PCR은 결찰 매개 PCR 7 및 그 변종 또는 역 PCR 8와 같은 대체 기술에 우수한 것으로 입증되었습니다. 이 방법의 감도와 견고성은 벡터 게놈 접합 증폭 PCR 제품의 자기 선택의 최초의 프리 앰프에서 발생한다. 언급 된 다른 방법과 마찬가지로, LAM-PCR은 9-11의 검색 능력에 편견을 도입, 제한 효소의 사용에 의존한다. 따라서,IS 레퍼토리 (integrome)의 서브 세트 만이 하나의 반응에서 검출 될 수있다. 이 바이어스는 제한 효소 (9)의 최적의 조합을 사용하여 주어진 샘플의 병렬 분석을 통해 최소화된다. 최근 기술의 변형은 제한 효소의 사용을 우회 한 번의 반응 9,12있는 샘플의 공정한 게놈 넓은 해석을 허용하는 LAM-PCR (nrLAM-PCR)이 개발되었다 비 제한 칭했다.
과거에는, LAM-PCR은 원인 레트로 바이러스가 유전자 치료 임상 시험 13 ~ 15에서 몇 환자에서 백혈병에 상승을주고 식별하는 데 사용되었습니다. 그 이후로, LAM-PCR을 식별하기에 적합 한 다른 통합 벡터 (렌티 바이러스 벡터, 트랜스포존) 또한 수동적으로 아데노 - 관련 벡터 (AAV) 또는 인테그라 불량 렌티 바이러스 벡터 (IDLV)와 같은 벡터를 통합하는 통합 패턴을 식별 할 수에서 (16) -21. LAM-PCR의 응용 프로그램은 광범위한 확산되어 기존의LY,이 기술은 널리 유전자 치료를받은 환자에서 유전자 변형 세포의 클론 구성을 공부하거나 통합 문제 15,16,22-24을 탈피하여 새로운 벡터 시스템의 바이오 안전성을 평가하는 데 사용됩니다. 최근, LAM-PCR은 IDLV 트래핑 분석 (25)에 의해 특이 디자이너 클레아의 오프 대상 활동을 결정하는 사용.
또한, LAM-PCR 쉽게 유기체에서 시간이 지남에 형질 세포의 운명을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토 암 유전자뿐만 아니라 종양 억제 유전자를 확인하고 또한 조혈 또는 암 줄기 세포 생물학 26-28을 연구 할 수 있습니다. 마지막으로 적어도, LAM-PCR은 인간 29 (및 게시되지 않은 데이터)에 T-세포 수용체의 다양성을 연구하기 위해 적응했다.
기술의 본질적인 힘은 단일 염기 R과 함께 알 수없는 측면에서는 DNA의 수백만의 특성을 허용 깊은 시퀀싱 기술과 방법을 연결하여 강화전체 게놈의 esolution. 다음과 같은 프로토콜에서, 우리는 단계별로 증폭 및 렌티 바이러스 벡터입니다 확인하는 예시 적으로 알 수없는 DNA를 측면에서는 식별을 설명합니다. 프로토콜에 사용 된 올리고 뉴클레오티드. 어떤 소스의 추출 된 DNA 또는 cDNA를이 LAM-PCR 및 nrLAM-PCR을위한 DNA 템플릿으로 이용 될 수는 표 1에 나타내었다.
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Protocol
링커 카세트 1. 준비 (LC)
- LC1 올리고 뉴클레오티드 (표 1), (적절한 제한 효소 오버행 표 1) LC2 올리고, 110 ㎕의 트리스 - 염산 (100 ㎜, 산도 7.5), 10 ㎕의 250 mM의 MgCl2를 40 μL의 40 μl를 섞는다.
- 5 분 95 ° C에서 품어 반응이 실온으로 천천히 냉각 할 수 있습니다. 300 μL의 H 2 O를 추가하고 원심 분리 필터에 dsLinker-DNA를 집중한다. 0.2 PCR 튜브에 준비 링커 카세트의 용출액과 나누어지는 10 μL에 80 μL의 H 2 O를 추가합니다.
벡터 게놈 접합 2. 프리 앰프
- 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
- DNA 샘플의 농도를 결정합니다. 피펫은 X μL (1-1,000이 nrLAM에 겨 LAM/100-1, 000 겨) 0.2 ML PCR 튜브에 DNA의. DNA의 양이 각각의 샘플과 RAN에서 동일해야합니다0.5-25 μL의 GE.
- 표 2에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비 믹스 (50 - X). 0.2 ML PCR 튜브에 각각의 DNA 샘플과 마스터 믹스 μL.
- PCR을 완료 한 후. 표 2에 예시 된 PCR 조건을 사용하여 프리 앰프를 벡터 게놈 접합 각 PCR 튜브를 다시 실행 PCR 프로그램의 Taq 중합 효소 μL 0.5을 추가합니다. PCR 제품은 -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다
PCR 제품의 3. 자기 분리
- 자석 구슬의 준비
- 피펫 (20) 1.5 ML 튜브에 스트렙 타비 딘 코팅 자석 구슬의 μL (200 μg) 및 상온에서 자성 입자 분리기 (MPS)에 1 분간 노출. 상층 액을 버린다.
- MPS에서 튜브를 제거하고 40 ㎕의 PSB / 0.1 % BSA (산도 7.5)에 자석 구슬을 재현 탁. 1 분 동안 MPS에 노출하고 상층 액을 버린다. 일단이 단계를 반복합니다.
- 워시 무선 비즈3 M의 LiCl 용액 20 μL 번째 (3 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)은 1 분 동안 MPS에 노출하고 상층 액을 버린다. 6 M의 LiCl 용액 (6 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)의 50 μL에 재현 탁 구슬.
- 준비 자석 구슬의 50 μL와 2.2 단계에서 전체 PCR 반응을 섞는다. 적어도 실온에서 2 시간 동안 수평 진탕 기 (300 RPM)에 품어. 이 단계는 코팅 된 비즈 (구슬 DNA 복합체를) 스트렙 타비 딘에 바이오틴 PCR 제품의 결합을 할 수 있습니다. DNA 구슬 복잡한 하룻밤 진탕 배양 또는 최대 4 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 실온에서 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한 노출, 상층 액을 제거하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한을 재현 탁 즉시 LAM 또는 nrLAM을위한 5 단계에 대해 4 단계를 진행합니다.
4. LAM-절차
- 이중 가닥 DNA (dsDNA) 합성 (LAM 전용)
- 1 분 및 표시에 대한 MPS 단계 3.3에서 DNA 비드 복잡한 노출카드 뜨는. 8.25 H 2 O의 μL, 1 μL 배 hexanucleotide 버퍼 0.25 μL의의 dNTPs (10 ㎜) 0.5 μL (2 U) 클레 나우 중합 효소를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- H 2 O의 90 μl를 추가하고 1 분 동안 MPS에 노출. 100 μL의 H 2 O에 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한 폐기
- 제한 다이제스트
- 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 8.5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 제한 효소 버퍼와 제한 효소의 0.5 μl를 추가하고 1 시간 동안 반응을 품어. 4.1.2 단계를 반복합니다.
참고 : 제한 효소의 제조업체에서 권장하는 온도에서 반응을 품어. 제한 사이트 내에 존재하는 또는 관심의 DNA에 프리 앰프에 사용되는 프라이머 결합 부위의 다운 스트림이 없는지 확인합니다. 적당한 제한 효소 / 제한 효소 조합의 선택을 위해 9를 참조하십시오.
- 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 8.5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 제한 효소 버퍼와 제한 효소의 0.5 μl를 추가하고 1 시간 동안 반응을 품어. 4.1.2 단계를 반복합니다.
- 결찰 DS의 링커 (LK)
- 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 FastLink 버퍼, 1 μL의 ATP (10 ㎜), 단계 1.2 ~ 2 μL 링커 카세트, 1 ㎕를 고속 링크 DNA 리가 제 (2 U / μL)를 추가합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다. 4.1.2 단계를 반복합니다.
- 신시 dsDNA의 변성
- 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 5 ㎕를 0.1 N 수산화 나트륨에 재현 탁 DNA 비드 복잡한. 가로 통에 실온에서 5 분 알을 품다.
- 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 포함 증폭 된 벡터 게놈 접합을 수집합니다. 즉시 -20 ℃에서 6 단계 또는 저장 상층 액을 진행
5. nrLAM - 절차
- 단일 가닥 링커의 결찰 (SSLC) (nrLAM 만)
- MPS에 단계 3.3에서 DNA 비드 복잡한 노출1 분 및 폐기 뜨는하십시오. 6.5 μL의 H 2 O를 추가, 1 ㎕의 10 배 반응 버퍼, CircLigase 0.5 ㎕의 MnCl 2 (50 ㎜), 0.5 ATP (1 ㎜) μL, 1 μL의 ssLinker 올리고 0.5 μL의 CircLigase (100 U / μL). 1 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다.
- H 2 O의 90 μl를 추가하고 1 분 동안 MPS에 노출. 뜨는을 취소하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한 세척 다시 10 μL의 H 2 O에서 1 분, 폐기 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한에 대한 MPS에 노출
6. 지수 증폭 I
- 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
- 피펫 2 μL 템플릿 (단계 4.4.2 (LAM부터) 또는 5.1.2 (nrLAM)) DNA 0.2 ml의 PCR 튜브에.
- 표 3에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 6.1.1에서 각각의 샘플에 마스터 믹스 48 μl를 추가하고 PCR 컨디셔닝 시스템에 의해 벡터 게놈 접합을 증폭표 3에 예시 된 NS는. PCR 제품은 -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다
PCR 제품의 7. 자기 분리
- 3.1.3 - 3.1.1 단계에 예시 된 바와 같이 자석 구슬을 준비합니다. (LAM에 대한) 20 μL 6 M의 LiCl 용액 (6 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)의 (nrLAM에 대한) 50 μL에 재현 탁 구슬. 20 μL (LAM) 또는 준비 자석 구슬 단계 6.1.2에서 PCR 반응 (단계 7.1) 50 μL (nrLAM)를 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 수평 진탕 기 (300 RPM)에 품어. DNA 구슬 복잡한 하룻밤 진탕 배양 또는 최대 4 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 1 분 MPS에 DNA 비드 복잡한 노출, 상층 액을 제거하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한을 재현 탁 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다.
- 20 μL (LAM) 또는 5 μL (nrLAM) 0.1 N 수산화 나트륨에 재현 탁 DNA 비드 복잡한. 인큐가로 통에 실온에서 10 분 동안 BATE는 1 분 MPS에 노출 새로운 1.5 ML 튜브에서 증폭 된 DNA가 포함 상층 액을 수집합니다. 즉시 -20 ℃에서 8.1 단계 또는 저장 상층 액을 진행
8. 지수 증폭 II
- 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
- 0.2 ML PCR 튜브에 (단계 7.3) 피펫 2 μL 템플릿 DNA.
- 표 4에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 8.1.1에서 각각의 샘플에 마스터 믹스 48 μl를 추가하고 표 4에 예시 PCR 조건에 벡터 게놈 접합을 증폭. PCR 제품은 최대 4 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다 -20 ° C에서 일 또는 장기
- 시각화 (NR) LAM-PCR 제품, 2 % 아가로 오스 겔상에서 단계 8.1.2의 PCR 생성물의 부하 10 μL. 밴드가 보이지 않는 경우, 고해상도 겔 LAM-PCR 생성물의 10 μl를 분석한다. 주의 : 잇hidium 브로마이드 변이원성이다. 매우 신중하게 작업하고 항상 적절한 장갑을 착용하십시오.
높은 처리량 시퀀싱 9. 준비
- (NR) LAM-PCR 제품의 정제
- 실내 온도 AMPure XP 자석 구슬의 44 μL와 단계 8.1.2에서 40 ㎕의 PCR-제품을 섞는다. 실온에서 5 분을 품어 추가로 2 분 동안 MPS에 노출.
- 뜨는을 취소하고 MPS에 200 ㎕의 70 % EtOH로 두 번 씻어.
- 30 μL의 H 2 O에 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한 폐기 신선한 0.2 ML 튜브에 1 분 및 전송 뜨는을 품어. 정제 된 DNA의 농도를 결정합니다.
- Fusionprimer PCR은 특정 어댑터를 시퀀싱 추가 할 수 있습니다.
- 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
- 0.2 ML PCR 튜브에 DNA의 피펫 X μL (40 NG). DNA의 양이 각각의 샘플과 0.5-25 μL의 범위에서 동일해야합니다.
- 표 5에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비 추가 (50 - X). 단계 9.2.2에서 각 샘플에 대한 마스터 믹스 ㎕의 표 5 PCR 제품에 예시 PCR 조건에 따라 (NR) LAM-PCR 제품 시퀀싱 어댑터를 소개합니다. -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다
- Fusionprimer-PCR 제품 부하에게 2 % 아가 로스 겔상에서 단계 9.2.3의 PCR 생성물의 10 μL를 시각화. 9.1.3 - 9.1.1 단계에 설명 된대로 나머지 PCR 제품을 정화. 정확하게 Fusionprimer-PCR 제품의 농도 및 단편의 크기를 정량화하는 자동화 된 고해상도 전기 영동 장치에 단계 9.4에서 1 ㎕의 정제 된 PCR 생성물을 분석한다.
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Representative Results
LAM-PCR 각 접합에 대한 정의 조각의 크기와 벡터 게놈 접합의 증폭 결과. 각각의 PCR 단편의 크기는 게놈 DNA의 공지 된 위치와 가장 가까운 제한 효소 인식 부위 사이의 거리에 의존한다. 이 겔 전기 영동에 의해 분석 샘플 예에서 증폭 접합 다양성을 시각화한다. 단지 단일 (모노클로 날), 몇개 (올리고 클론), 또는 다수의 (폴리 클로 날) 밴드는 겔에 존재하는 경우. LAM-PCR의 결과는 가장 높은 해상도의 전기 영동 젤 (그림 2A)로 볼 수 있습니다뿐만 아니라, 2 % 아가 로스 젤 (그림 2B)에 시각화 할 수 있습니다. nrLAM-PCR은 각각의 접합을위한 다양한 길이의 PCR 단편 발생합니다. 따라서, 단일 클론 올리고 클론 또는 클론 샘플은 전기에 의한 얼룩으로 표시하고 시각적으로 구별 할 수 없습니다. 2 % 아가 로스 겔상에서 nrLAM-PCR 생성물을 떠올리 SUC를 결정하기에 충분하다프로토콜 (그림 2C)의 운. 서열화 후 회수 된 게놈 DNA는 벡터 (도 3a)의 위치의 정확한 위치를 식별하기 위해 각각의 호스트 게놈으로 정렬 될 수있다. 게놈의 주석 유전자 코딩 영역 (그림 3B) 또는 전사 시작 사이트에 가까운 (그림 3C)에 통합을위한 환경 설정과 같은 다른 벡터의 특정 기능에 대한 IS 레퍼토리를 분석 할 수 있습니다.
그림 1. LAM-PCR 및 nrLAM-PCR의 도식 개요. A) 두 가지 방법은 알려진 DNA 서열 레트로 바이러스 벡터 (여기에 긴 터미널 반복 (LTR))의 끝 부분에 가까운 하이브리드 바이오틴 프라이머를 사용하여 벡터 게놈 접합의 초기 프리 앰프로 시작합니다. 비오틴의 프리 앰프 결과동일하거나 다른 벡터 게놈 접합에 대해 서로 다른 크기의 ssDNA를. 비오틴의 ssDNA는 자성 입자에 캡처됩니다. B) LAM PCR, dsDNA 합성으로 구성 효소 반응 단계, 제한 다이제스트 및 알려진 링커 DNA 제품의 양쪽에 알려진 시퀀스와 다른 크기의 제품을 생성 결찰하십시오. 때문에 제한 길이 다형성에 각각 증폭 접합 특성 길이를 가지고 있습니다. 변성 후 LAM-PCR 생성물을 링커 및 벡터 특이 적 프라이머와 중첩 PCR에 의해 증폭된다. C) nrLAM 들어 ssDNA를 링커 서열 직접 링커 중첩 PCR에 의해 지수 적 증폭을 허용)에서 증폭 된 ssDNA를 중에서 불명 단부에 라이 게이션되며 특정 프라이머를 벡터. 이 그림에서 수정되었습니다 2,12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. >
그림 2. LAM-PCR 및 nrLAM-PCR의 대표 결과. 유전자 요법 치료를받은 환자의 말초 혈액으로부터 분리 된 DNA의 A, B) LAM-PCR 분석. 겔에서 밴드의 개수는 샘플 IS 선물의 개수에 대응한다. 고해상도 겔 (B)는 (A). C) 렌티 바이러스 벡터 형질 도입 된 단일 세포 클론 또는 대량 세포 nrLAM-PCR 분석을 2 % 아가 로스 젤보다 분석 시료의 클론 성을 시각화하기에 더 적합하다. 증폭 삽입 사이트의 수의 독립은 얼룩은 전기 영동 후 겔에 볼 수 있습니다. M, 100 bp의 사다리; MC, 단일 클론; OC, 올리고 클론; PC, 클론. 이 수치는 2.9에서 수정되었습니다.
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그림 3.에 대한 대표적인 예는 LAM-PCR 이후의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 분석된다. gammaretroviral (파란색) 또는 렌티 바이러스 (녹색) 임상 유전자 치료 임상 시험이 환자의 분포. 각각의 게놈을 시퀀싱 및 LAM-PCR 제품의 매핑이 평가 될 수 후 예 :.. gammaretroviral 및 렌티 바이러스 벡터와 C 사이의 유전자 코딩 영역에 삽입 취향에 따라 IS B) 차이의) 게놈 전체의 분포) 전사 시작 사이트에 가까운 삽입에 대한 선호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 목적 | 이름 | 서열 (5'-3 ') |
| LK-범용 | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| 프리 앰프 | LTR-I (3'-방향) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-방향) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| 지수 증폭 I | LTR-II (3'-방향) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-방향) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| 지수 증폭 II | LTR-III (3'-방향) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-방향) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
표 1. 올리고 뉴클레오티드에 대한 LAM과 nrLAM-PCR 렌티 바이러스를 증폭은 SSLC가 5'-말단 (P)에 인산화된다. IS 및 결찰 동안 SSLC의 multimerization을 방지하기 위해 (DDC)을 didesoxycytidin 3 '에 있습니다. 일반적으로, (NR) LAM-PCR 프라이머 18-25 뉴클레오티드로 구성되어야하고 호스트 게놈에 정렬하지 않아야합니다. 프리 앰프 프라이머는 벡터의 5 '또는 3'말단에 (120 bp의 ≤) 가능한 한 가깝게 배치해야합니다. 지수 PCR I 및 II에 대한 두 개의 추가 프라이머는 프라이머 사이에 배치 될 필요프리 앰프와 벡터 끝을 사용했다. 프라이머는 프리 앰프와 지수 PCR에 나는 5'-인산화 (P) 할 필요가있다.
| 시약 | 양 (μL) | 집중 | PCR 매개 변수 | 온도 | 시간 | |
| H2O | 43 - X | 초기 변성 | 95 ° C | 5 분 | ||
| 완충기 | 5 | 10 × | 변성 | 95 ° C | 45 초 | |
| 의 dNTP | 1 | 10 MM (LAM); 0.5 μM (nrLAM) | 가열 냉각 | 60 ° C | 45 초 | 2 × 50 회 |
| LTR-I | 0.5 | 0.17 μM | 연장 | 72 ° C | 60 초 (LAM); 10 초 (nrLAM) | |
| 의 Taq중합 효소 | 0.5 | 2.5 U / μL | 최종 신장 | 72 ° C | 5 분 (LAM 전용) |
표 2. 벡터 게놈 접합 (2 단계)의 프리 앰프에 대한 PCR-조건. 열 1-3 하나의 DNA 샘플의 증폭에 사용되는 PCR 시약을 보여줍니다. 열 4-6 벡터 게놈 접합 프리 앰프를하는 PCR 프로그램을 예시.
| 시약 | 양 (μL) | 집중 | PCR 매개 변수 | 온도 | 시간 | |
| H 2 O | 40.5 | 초기 변성 | 95 ° C | 5 분 | ||
| 완충기 | 5 | 10 × | 변성 | 95 ° C | 45 초 | |
| 의 dNTP | 1 </ TD> | 10 mM의 | 가열 냉각 | 60 ° C | 45 초 | 35 회 |
| LTR-II | 0.5 | 16.7 μM | 연장 | 72 ° C | 60 초 (LAM); 5 초 (nrLAM) | |
| LC-I | 0.5 | 16.7 μM | 최종 신장 | 72 ° C | 5 분 (LAM 전용) | |
| 의 Taq 중합 효소 | 0.5 | 2.5 U / μL |
표 3. PCR-조건 지수 증폭 나는 (6 단계). 열 1-3 하나의 DNA 샘플의 기하 급수적 인 증폭에 사용되는 PCR 시약을 보여줍니다. 열 4-6 기하 급수적 링커 서열의 결찰 후 하나의 샘플을 증폭하기 위해 사용되는 PCR 프로그램을 예시.
| 시약 | 할머니륨 (μL) | 집중 | PCR 매개 변수 | 온도 | 시간 | |
| H 2 O | 40.5 | 초기 변성 | 95 ° C | 5 분 | ||
| 완충기 | 5 | 10 × | 변성 | 95 ° C | 45 초 | |
| 의 dNTP | 1 | 10 mM의 | 가열 냉각 | 60 ° C | 45 초 | 35 회 |
| LTR-III | 0.5 | 16.7 μM | 연장 | 72 ° C | 60 초 (LAM); 5 초 (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16.7 μM | 최종 신장 | 72 ° C | 5 분 | |
| 의 Taq 중합 효소 | 0.5 | 2.5 U / μL |
표 4. PCR-조건 지수 증폭 나는 (8 단계). 열 1-3 단일 샘플의 중첩 지수 증폭에 사용되는 PCR 시약을 보여줍니다. 열 4-6은 하나의 샘플에서 벡터 게놈 접합의 중첩 지수 증폭에 사용되는 PCR 프로그램을 예시.
| 시약 | 양 (μL) | 집중 | PCR 매개 변수 | 온도 | 시간 | |
| H 2 O | 42.5 - X | 초기 변성 | 95 ° C | 2 분 | ||
| 완충기 | 5 | 10 × | 변성 | 95 ° C | 45 초 | |
| 의 dNTP | 1 | 10 mM의 | 가열 냉각 | 58 ° C | 45 초 | 12 회 |
| Fusionprimer | 0.5 | 10 μM | 연장 | 72 ° C | 60 초 | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 μM | 최종 신장 | 72 ° C | 5 분 | |
| 의 Taq 중합 효소 | 0.5 | 2.5 U / μL |
Fusionprimer-PCR 표 5. PCR-조건 (단계 9.2). 열 1-3 (NR) LAM-PCR 제품에 대한 시퀀싱 어댑터의 도입에 사용되는 PCR 시약을 보여줍니다. 열 4-6 Fusionprimer-PCR에 사용 된 PCR 프로그램을 예시.
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Discussion
LAM-PCR 기술은 공지 된 DNA 영역의 측면 불명 DNA 서열을 식별한다. 때문에 공지 된 DNA 서열에 특이 적 프라이머의 혼성화와 접합부의 증폭 량으로 인해 고감도, 그것은 단일 세포 수준까지조차 희귀 접합을 증폭 및 검출 할 수있다. 반대로, 클론 상황에서 LAM-PCR은 하나의 반응에 다른 접합의 수천을 증폭 할 수 있습니다.
그러나, 제한의 사용으로 인해이 integrome 만 하위 성분마다 특정한 제한 효소 접합부의 존재를 LAM-PCR에 의해 분석 할 수있는 효소. 따라서, 다른 효소와 동일한 샘플의 반복 분석은 9를 권장합니다. 제공된 LAM-PCR 증폭 산물은 젤 상에 존재하지 않으면, 가장 가능성이 알려진 DNA 단편의 위치와 선택된 제한 효소의 가장 인식 부위 사이의 거리 LAM-PCR 제품 초래할 너무 커서15.이 경우 다른 효소 접합을 증폭하는 데 사용되어야한다.
nrLAM는 제한 효소의 사용은 독립적이며, 따라서 포괄적으로 공지 된 DNA 서열을 플 랭킹 서열의 특성을 매우 유용한 방법을 나타낸다. 제한은 각 증폭 된 접합의 특징 인 특정 제한 단편 길이 다형성 손실 프로토콜 결과로부터 다이제스트 생략. 대신 모든 증폭 접합이 증폭 접합의 다양성의 독립적 인 전기 영동 후 겔에 얼룩의 결과로 다양한 크기의 PCR 제품으로 표시됩니다.
LAM과 nrLAM-PCR 두 제품 모두 완벽하게 하류 높은 처리량 시퀀싱에 적합합니다. 해당 게놈 (NR) LAM-PCR 제품 및 검색 원시 시퀀스의 매핑의 높은 처리량 시퀀싱은 알 수없는 DNA를 측면에서는 또는 벡터 게놈 접합 (30)의 정확한 현지화를 식별의 특성을 수 있습니다.fusionprimers에 바코드 시퀀스를 도입함으로써 LAM과 nrLAM-PCR 제품의 수백은 하나의 연속 실행 (30)의 염기 서열을 할 수 있습니다.
건성으로 실행 된 경우로 인해 높은 감도로, LAM-PCR 오염하는 경향이있다. 따라서, 프로토콜의 처리를 청소하는 PCR-등급의 환경과 특별한주의가 성공적으로 샘플을 오염하지 않고 DNA를 측면에서는 알 수없는 증폭을 가장 중요합니다. 따라서 untransduced 게놈 DNA와 LAM-PCR 프로토콜에 음성 대조군으로 모든 PCR 반응에 물 제어를 포함하는 것이 좋습니다. 컨트롤 샘플은 교차 오염이 프로토콜 동안 발생한다고 나타내면, 각 정지 점으로부터 제품은 프로토콜의 부분을 반복 할 수있다. 밴드가 여전히 존재하는 경우, 모든 시약 (예., 프라이머, dNTPs를, 중합 효소 등)을 폐기하고 새로운 분주로 (NR) LAM-PCR 프로토콜을 반복하는 것이 좋습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
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