Summary
Doğrusal amplifikasyon aracılı (LAM)-PCR genomu içinde entegre viral vektörlerin tam konumlarını belirlemek için geliştirilen bir yöntemdir. Teknik gen tedavisi hastaların, vb roman vektör teknolojileri, T-hücresi çeşitlilik, kanser kök hücre modelleri, biyogüvenlik klonal dinamiklerini incelemek için üstün bir yöntem olarak gelişmiştir
Introduction
Doğrusal amplifikasyon, PCR (LAM-PCR) aracılık ettiği herhangi bir kökenli bilinen DNA komşu bilinmeyen DNA yan belirlenmesi ve karakterize sağlar. Daha özel olarak, LAM-PCR, konakçı genomu içinde 1,2 (IS) viral vektör entegrasyon alanlarının yerini belirlemek üzere geliştirilmiştir. Retrovirüslere veya transpozonlar gibi Genetik elemanlar, bir (yarı-) rastgele bir şekilde 3-6 konakçı genom içine entegre genom. Pek çok durumda, bu gibi vektörler entegre tam konumunu bilmek belirleyicidir. LAM-PCR ligasyon aracılığında PCR 7 ve onun varyantları ya da ters PCR 8 gibi alternatif teknikler üstün olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntemin duyarlılığı ve sağlamlığı vektör genom birleşme ve amplifiye PCR ürünleri manyetik seçim başlangıç amplifikasyon doğar. Bahsedilen alternatif yöntemler gibi, LAM-PCR IS 9-11 alma kapasiteli bir önyargı sokulması, kısıtlama enzimlerinin kullanımına dayanır. Bu durumda,IS repertuar (integrome) yalnızca bir alt kümesi, bir reaksiyonda tespit edilebilir. Bu eğilim kısıtlama enzimleri 9 en uygun kombinasyonları kullanılarak belirli bir örnek paralel analizi ile en aza indirilmiştir. Son zamanlarda, teknoloji bir varyant kısıtlama enzimlerinin kullanımı önlediği ve tek bir reaksiyonda 9,12 içinde bir numunenin ilgili genom analizleri sağlayan LAM-PCR (nrLAM-PCR) geliştirilmiştir sınırlayıcı olmayan adlandırılır.
Geçmişte, LAM-PCR neden olan retroviral gen terapisi klinik çalışmalarda 13-15 birkaç hastada lösemi sebebiyet veren IS tanımlamak için kullanılmıştır. O zamandan beri, LAM-PCR belirlemek için adapte edilmiş diğer entegre vektörleri (lentiviral vektörler, transpozonlar) ve pasif adeno-ilişkili vektörler (AAV) veya integraz-kusurlu lentiviral vektörleri (IDLV) gibi vektörleri entegre entegrasyonu biçimlerini belirlemek için her 16 -21. LAM-PCR Uygulamaları geniş yayılır: Gelenekselly, teknik yaygın gen tedavisi geçirmiş olan hastalarda gen modifiye edilmiş hücrelerin klonal çalışma bileşimi için ya da entegre davranışlarını 15,16,22-24 çözülmesine göre yeni vektör sistemleri Biogüvenlik değerlendirmek için kullanılır. Son zamanlarda, LAM-PCR bir IDLV yakalama deneyi 25 özgüllük ve tasarımcı nükleazların hedef dışı aktivitesinin belirlenmesinde etkin.
Ayrıca, LAM-PCR kolay bir organizmada zamanla transduse edilmiş hücrenin kaderini takip sağlar. Bu proto-onkogenlerin yanı sıra tümör baskılayıcı genleri tespit etmek ve aynı zamanda hematopoiezis veya kanser kök hücre biyolojisi 26-28 çalışma sağlar. Son fakat en az değil, LAM-PCR insanlarda 29 (ve yayınlanmamış veriler) T-hücre reseptör çeşitliliğini incelemek için adapte edilmiştir.
Teknolojinin iç güç tek nükleotid r ile komşu bilinmeyen DNA milyonlarca karakterize izin derin sıralama teknolojileri için yöntem bağlayarak güçlendirilirTüm genomların esolution. Aşağıdaki protokolde, biz adım adım amplifikasyon ve lentiviral vektör IS tanımlamak için örnekli bilinmeyen kuşatıcı DNA tanımlanması için. Protokolünde kullanılan oligonükleotidler,. Olan kaynak Ekstre edilen DNA, cDNA veya LAM-PCR ve nrLAM-PCR için DNA şablonu olarak kullanılabilir Tablo 1 'de listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bağlayıcı Kaset 1. Hazırlama (LC)
- LC1 oligonükleotid (Tablo 1), (uygun kısıtlayıcı enzim çıkıntı ile Tablo 1) LC2 oligonükleotid, 110 ul Tris-HCl (100 mM, pH 7.5) ve 10 ul 250 mM MgCl2, 40 ul, 40 ul karıştırın.
- 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edildi ve reaksiyon yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın. 300 ul H2O ilave edin ve bir santrifüj filtre üzerinde dsLinker-DNA konsantre edilir. 0.2 PCR tüplerine hazırlanan bağlayıcı kaset eluat ve kısım 10 ul 80 ul H2O ekleyin.
Vektör Genom EklemlerininTünelleme 2. Preamplification
- Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
- DNA örneklerinin konsantrasyonunu belirleyin. Pipet x ul (1-1000 ng LAM/100-1 nrLAM için, 000 ng), bir 0.2 ml PCR tüpüne DNA. DNA hacmi her bir örnek olarak ve RAN eşit olmalıdır0,5-25 | il ge.
- Tablo 2 'de tarif edildiği gibi PCR Master Mix karışım hazırlayın (- 50 x). 0.2 ml PCR tüplerine her bir DNA numunesi ile ana karışımı ul.
- PCR tamamlandıktan sonra., Tablo 2'de örneklendiği PCR koşulları kullanılarak Preamplify vektör genom bağlantıları her PCR tüpü ile tekrar işleme PCR programı için Taq Polimeraz ul 0.5 ekleyin. PCR ürünleri, -20 ° C'de 4 güne kadar ya da uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir
PCR Ürünü 3. Manyetik Ayırma
- Manyetik Boncuk hazırlanması
- Pipet 20, bir 1.5 ml tüp içine streptavidin kaplı manyetik boncuklar ul (200 ug) ile, oda sıcaklığında, manyetik parçacık ayırıcı (MPS) 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır. Süpernatant atın.
- MPS dan tüpünü çıkarın ve 40 ul PSB /% 0.1 BSA (pH 7.5) manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. 1 dakika boyunca MPS maruz ve supernatant atın. Kez bu adımı yineleyin.
- Yıkama wi boncuk3 M LiCl çözeltisi 20 ul th (3 M LiCİ, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) 1 dakika süre ile maruz MPS ve supernatant atın. 6 M LiCl çözeltisi (6 M LiCİ, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA), 50 ul içinde süspanse boncuk.
- Hazırlanmış manyetik boncuk tanelerin 50 ul aşama 2.2 'den tüm PCR reaksiyonu karıştırın. En az bir oda sıcaklığında 2 saat boyunca yatay bir çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde inkübe edin. Bu adım, kaplı boncuklar (DNA-boncuk kompleksi) streptavidin biyotinile edilmiş PCR ürününün bağlanması sağlar. DNA boncuk kompleksi, gece boyunca çalkalayıcıda inkübe veya en fazla 4 gün süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
- Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksi Açığa, süpernatant kaldırmak ve 100 ul H2O içinde DNA-boncuk kompleksi tekrar süspansiyon Hemen LAM veya nrLAM için adım 5 için adım 4 ile devam edin.
4. LAM-Prosedürü
- Çift sicimli DNA (dsDNA) Synthesis (LAM için)
- 1 dakika ve dis için MPS adım 3.3 den DNA-Boncuk kompleksini Açığakart yüzer. 8.25 H2O ul, 1 ul 10x hexanucleotide tampon, 0.25 ul dNTP (10 mM) ve 0.5 ul (2 U) Klenow polimerazı ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- H 2 O 90 ul ilave edilir ve 1 dakika süre ile maruz MPS. 100 ul H 2 O. süpernatant ve tekrar süspansiyon DNA-Boncuk kompleksini atın
- Kısıtlama Digest
- 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 8.5 ul 2 H, O, 1 ul 10x kısıtlayıcı enzim tamponu ve sınırlama enzimi, 0.5 ul ilave edin ve 1 saat boyunca bir reaksiyon inkübe edin. 4.1.2 adımı tekrarlayın.
Not: kısıtlama enzimi üretici tarafından tavsiye edilen sıcaklıkta reaksiyonu inkübe edin. Herhangi bir kısıtlama alanı içinde mevcut ya da ilgi duyulan DNA amplifikasyon için kullanılan primer bağlanma yerinin alt olduğundan emin olun. Uygun kısıtlama enzimleri / sınırlama enzim kombinasyonlarının seçimi için 9'a bakın.
- 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 8.5 ul 2 H, O, 1 ul 10x kısıtlayıcı enzim tamponu ve sınırlama enzimi, 0.5 ul ilave edin ve 1 saat boyunca bir reaksiyon inkübe edin. 4.1.2 adımı tekrarlayın.
- Ligasyon ds Linker (LK)
- 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 5 ul 2 H, O, 1 ul 10x FastLink tamponu, 1 ul ATP (10 mM), aşama 1.2 'den 2 ul Bağlayıcı kaset ve 1 ul Fast-Link DNA Ligaz (2 U / ml) eklenir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4.1.2 adımı tekrarlayın.
- Sentezlenen dsDNA denatürasyonu
- 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın. 5 ul 0.1 N NaOH içinde süspanse DNA-Boncuk kompleksi. Yatay çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini ortaya çıkarmak ve yeni bir 1.5 ml tüp içeren yüzer preamplified vektör genom kavşak toplamak. Hemen -20 ° C'de adım 6 veya mağaza süpernatant ile devam
5. NrLAM-Prosedürü
- Tek şeritli bağlayıcının ligasyon (SSLC) (nrLAM için)
- MPS adım 3.3 den DNA-Boncuk kompleksini Açığa1 dakika ve atma süpernatant için. 6.5 ul H2O ekleme, 1 ul 10x reaksiyon tamponu, 0.5 ul CircLigase MnCI2 (50 mM), 0.5 ATP (1 mM) ul, 1 ul ssLinker oligonükleotid ve 0.5 ul CircLigase (100 U / ml). 1 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
- H 2 O 90 ul ilave edilir ve 1 dakika süre ile maruz MPS. Süpernatant atın ve 100 ul H 2 O DNA-Boncuk kompleksini yıkayın Yine 10 ul H 2 O 1 dakika, ıskarta süpernatant ve tekrar süspansiyon DNA-Boncuk kompleksi için MPS maruz
6.. Üstel Amplifikasyon I
- Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
- Pipet 2 ul şablonu (adım 4.4.2 (LAM) veya 5.1.2 (nrLAM)) DNA, bir 0.2 ml PCR tüp içine.
- Tablo 3 'de tarif edildiği gibi PCR master karışımı hazırlayın. Aşama 6.1.1 her örnek için ana karışımı 48 ul eklenir ve PCR tarafından vektör genom conditio kavşakları yükseltmekTablo 3'de örneklenen ns. PCR ürünleri, -20 ° C'de 4 güne kadar ya da uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir
PCR Ürünü 7. Manyetik Ayırma
- 3.1.3 - 3.1.1 adımda de örneklendiği gibi, manyetik boncuklar hazırlayın. (LAM için), 20 ul ya da 6 M LiCl çözeltisi (6 M LiCİ, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA) içinde (nrLAM için), 50 ul içinde süspanse boncuk. 20 ul (LAM) veya hazırlanmış manyetik boncuklar ile adım 6.1.2 ikinci PCR reaksiyonunda (adım 7.1), 50 ul (nrLAM) karıştırınız ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca yatay bir çalkalayıcıda (300 rpm) üzerinde inkübe edilir. DNA boncuk kompleksi, gece boyunca çalkalayıcıda inkübe veya en fazla 4 gün süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
- 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa, süpernatant kaldırmak ve 100 ul H 2 O DNA-Boncuk kompleksini tekrar süspansiyon 1 dakika boyunca MPS DNA-Boncuk kompleksini Açığa ve süpernatant atın.
- 20 ul (LAM) ya da 5 ul (nrLAM) 0.1 N NaOH içinde süspanse DNA-boncuk kompleksi. Incuyatay karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kesmek, 1 dakika boyunca MPS ortaya çıkarmak ve yeni bir 1.5 ml bir tüp içinde büyütülmüş DNA ihtiva eden süpernatan toplamak. Hemen -20 ° C'de adım 8.1 veya mağaza süpernatant ile devam
8. Üstel Amplifikasyon II
- Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
- Bir 0.2 ml PCR tüpüne (adım 7.3) Pipet 2 ul DNA şablonu.
- Tablo 4 'de tarif edildiği gibi PCR master karışımı hazırlayın. Aşama 8.1.1 her örnek için ana karışımı 48 ul ekleyin ve Tablo 4'te örneklenen PCR koşullarına göre vektör genom kavşaklar amplifiye. PCR ürünleri kadar 4 için 4 ° C'de saklanabilir -20 ° C'de gün veya uzun vadeli
- Görselleştirmek için (nr) LAM-PCR ürünleri,% 2 agaroz jeli üzerinde adım 8.1.2 elde edilen PCR ürünü yükü 10 ul. Bantlar görünür durumdaysa, yüksek çözünürlüklü jel üzerinde LAM-PCR ürünü 10 ul analiz. DİKKAT: Ethidium bromür mutajenik değildir. Çok dikkatli çalışmak ve her zaman uygun eldivenler giyin.
Yüksek sekanslama için 9. Hazırlanması
- (Nr) LAM-PCR ürünlerinin saflaştırılması
- Oda sıcaklığı AMPure XP Manyetik Boncuk 44 ul ile adım 8.1.2 40 ul PCR-Ürün karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve 2 dakika boyunca ilave MPS maruz.
- Süpernatant atın ve MPS 200 ul% 70 EtOH ile iki kez yıkayın.
- 30 ul H 2 O. süpernatant ve tekrar süspansiyon DNA-Boncuk kompleksini atın Taze 0.2 ml tüp 1 dakika ve transfer süpernatant inkübe. Saflaştınldı DNA konsantrasyonu tayin edilir.
- Fusionprimer PCR özel adaptörleri sıralanmasıyla eklemek.
- Analiz edilecek her bir örnek, 50 | il PCR reaksiyonu hazırlamak için.
- Bir 0.2 ml PCR tüpüne DNA Pipet x ul (40 ng). DNA hacmi her bir örnek olarak ve 0,5-25 ul aralığında eşit olmalıdır.
- Tablo 5'te tarif edildiği gibi PCR ana karışımı hazırlayın ekle (50 - x). Aşama 9.2.2 her örnek için ana karışımı ul ve Tablo 5'te PCR ürünleri örneklenen PCR koşullarının (nr) LAM-PCR ürünlerine Sequencing adaptörleri tanıtmak. -20 ° C'de 4 güne kadar ya da uzun bir süre için 4 ° C'de saklanabilir
- Fusionprimer-PCR ürünleri yüklemek bir% 2 agaroz jeli üzerinde adım 9.2.3 ikinci PCR ürününün 10 ul görselleştirmek için. 9.1.3 - 9.1.1 adımda tarif edildiği gibi geriye kalan PCR ürünü arındırın. Doğru Fusionprimer-PCR ürünleri konsantrasyon ve parça boyutu ölçmek için otomatik bir yüksek çözünürlüklü elektroforez aygıtı, adım 9.4 1 ul saflaştırılmış PCR ürünü analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR her bir birleşme için tanımlı bir parça boyutu ile birleşme vektör genom amplifikasyonu ile sonuçlanır. Tek tek PCR parçalarının büyüklüğü genomunda bilinen DNA'nın konumu ve en yakın sınır enzimi tanıma sitesi arasındaki mesafeye bağlıdır. Bu jel elektroforezi ile analiz örneğin örneklerde amplifiye birleşme çeşitliliğini görselleştirme sağlar., Sadece tek bir (monoklonal), birkaç (oligoklonal) ya da birden fazla (poliklonal) bantlar jel üzerinde mevcut ise. LAM-PCR sonuçları iyi yüksek çözünürlüklü elektroforez jellerinin (Şekil 2A) tarafından görüntülenebilir ama aynı zamanda% 2 agaroz jel (Şekil 2B) üzerinde görülebilir. nrLAM-PCR, her bir birleşme için çeşitli uzunlukta PCR parçaları ile sonuçlanır. Bu nedenle, monoklonal ya da poliklonal oligoklonal örnekleri elektroforez ile bir yayma olarak görünür ve görsel olarak ayırt edilemez. % 2 agaroz jeli üzerinde nrLAM-PCR ürünü görselleştirme suc belirlenmesi yeterlidirprotokolü (Şekil 2C) cess. Sequencing sonra geri kazanılan genomik DNA vektörü (Şekil 3A) yere kesin konumlarını belirlemek için, ilgili konakçı genomuna hizalanabilir. Genomunun açıklama gen kodlayan bölgelerin (Şekil 3B) veya transkripsiyon başlangıç siteleri yakın (Şekil 3C) entegrasyon için tercih gibi farklı vektör belirli özellikler için IS repertuar analiz etmeyi sağlar.
Şekil 1. LAM-PCR ve nrLAM-PCR şematik anahat. A) Her iki yöntem de bilinen DNA sekansı, bir retroviral vektör (burada uzun terminal tekrar (LTR)) sonuna yakın hibridize biyotinile edilmiş primerler kullanılarak vektör genom birleşme bir başlangıç amplifikasyon ile başlar. Biotinlenmiş içinde Preamplification sonuçlarıaynı ya da farklı vektör genom birleşme için farklı büyüklükte ssDNA. Biyotinile edilmiş ssDNA manyetik parçacıkları üzerinde yakalanır. B) LAM PCR, dsDNA sentez oluşan enzimatik reaksiyon aşamaları, sınırlama özütü ve bilinen bir bağ DNA'sı, ürünün her iki ucunda da bilinen dizilerle farklı boyutlarda ürünleri üretmek ligasyonu için. Due kısıtlama uzunluğu polimorfizmi için her güçlendirilmiş bağlantı karakteristik uzunluğa sahiptir. Denatürasyon sonra LAM-PCR ürünü, bir bağlayıcı ve vektör spesifik primerler ile iç içe PCR ile amplifiye edilir. C) nrLAM için bir ssDNA bağlayıcı dizisi, doğrudan bağlayıcı ile iç içe PCR ile gittikçe artar şekilde çoğalmasını sağlayan) A preamplified ssDNA bilinmeyen ucuna bağlanır ve özel primerler vektör. Bu rakam modifiye edilmiştir 2,12. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. >
Şekil 2,. LAM-PCR ve nrLAM-PCR temsil edici sonuçları. Gen terapisi ile tedavi edilen hastaların periferal kanından izole edilmiş DNA A, B) LAM-PCR analizi. Jeli üzerinde bantların sayısı numunede mevcut IS sayısına karşılık gelir. Yüksek çözünürlüklü jeli (B) (A). C) lentiviral vektör transduse tek hücre klonları veya toplu hücreleri nrLAM-PCR analizi,% 2 agaroz jel göre analiz numunelerinin klonalitesi görselleştirmek için daha uygundur. Amplifiye ekleme sitelerinin sayısı bağımsız olarak bir yayma Elektroforezden sonra, jel üzerinde görülür. M, 100 bp merdiven; MC, monoklonal; OC, oligoclonal; PC, poliklonal. Bu rakam 2,9 modifiye edilmiştir.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 3. Temsilcisi örnekler LAM-PCR ve sonraki yüksek verimlilik sıralaması ile analiz IS. Gammaretroviral (mavi) veya Lentiviral (yeşil) klinik gen tedavisi çalışmaları iki hastada dağıtım IS. Ilgili genom sıralı ve LAM-PCR ürünlerinin haritalama değerlendirilebilir IS sonra örn:.. Gammaretroviral ve lentiviral vektörler ve C arasında gen kodlayan bölgelerin içine yerleştirilmesi için tercihinize göre IS B) Fark A) Genom çapında dağıtım) transkripsiyon başlangıç siteleri yakın yerleştirilmesi için tercih. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
| Amaç | Isim | Dizi (5'-3 '); |
| LK-evrensel | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GAİK |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplification | LTR-I (3'-yönü) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-yönü) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Üstel büyütme I | LTR-II (3'-yönü) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-yönü) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Üstel büyütme II | LTR-III (3'-yönü) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-yönü) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tablo 1. Oligonükleotidler için LAM ve nrLAM-PCR lentiviral yükseltmek için SSLC 5'-ucu (P) fosforilatlanır. IS ve bağlanması esnasında SSLC of multimerizasyonunu önlemek için (ddC) didesoxycytidin 3 'de bulunmaktadır. Genel olarak, (NR) LAM-PCR primerleri, 18-25 nükleotid arasında olmalıdır ve ev sahibi genom hizalanacak olmamalıdır. Amplifikasyon primerleri, vektörün 5 'veya 3' ucuna (120 bp ≤) mümkün olduğu kadar yakın yerleştirilmelidir. Üstel PCR I ve II için iki ek primer astar arasına yerleştirilmesi gerekiramplifikasyon ve vektör sonu için kullanılır. Primerler amplifikasyon ve Üstel PCR için I 5'-fosforile (P) olması gerekir.
| Reaktif | Hacim (ul) | Konsantrasyon | PCR Parametreleri | Sıcaklık | Zaman | |
| H2O | 43 - x | İlk denatürasyon | 95 ° C | 5 dakika | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Denatürasyonu | 95 ° C | 45 saniye | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0.5 uM (nrLAM) | Tavlama | 60 ° C | 45 saniye | 2 x 50 döngüleri |
| LTR-I | 0.5 | 0.17 iM | Uzama | 72 ° C | 60 sn (LAM); 10 sn (nrLAM) | |
| TaqPolimeraz | 0.5 | 2.5 U / ul | Final Uzama | 72 ° C | 5 dk (LAM sadece) |
Tablo 2. Vektör genom birleşme (aşama 2) ve amplifikasyon için PCR koşulları. Sütunlar 1-3, tek bir DNA örneği amplifikasyonu için kullanılan PCR reaktifleri gösterir. Sütunlar 4-6 vektör genom kavşaklar preamplify için PCR programı örneklemektedir.
| Reaktif | Hacim (ul) | Konsantrasyon | PCR Parametreleri | Sıcaklık | Zaman | |
| H 2 O | 40.5 | İlk denatürasyon | 95 ° C | 5 dakika | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Denatürasyonu | 95 ° C | 45 saniye | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Tavlama | 60 ° C | 45 saniye | 35 döngüleri |
| LTR-II | 0.5 | 16.7 iM | Uzama | 72 ° C | 60 sn (LAM); 5 sn (nrLAM) | |
| LC-I | 0.5 | 16.7 iM | Final Uzama | 72 ° C | 5 dk (LAM sadece) | |
| Taq Polimeraz | 0.5 | 2.5 U / ul |
Tablo 3. PCR-amplifikasyonu için koşullar üslü I (adım 6). Sütunlar 1-3, tek bir DNA örneğinin üslü amplifikasyonu için kullanılan PCR reaktifleri gösterir. Sütunlar 4-6 katlanarak bağ dizisi bağlanmasından sonra bir örnek amplifiye etmek için kullanılan PCR programı örneklemektedir.
| Reaktif | Volume (ul) | Konsantrasyon | PCR Parametreleri | Sıcaklık | Zaman | |
| H 2 O | 40.5 | İlk denatürasyon | 95 ° C | 5 dakika | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Denatürasyonu | 95 ° C | 45 saniye | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Tavlama | 60 ° C | 45 saniye | 35 döngüleri |
| LTR-III | 0.5 | 16.7 iM | Uzama | 72 ° C | 60 sn (LAM); 5 sn (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16.7 iM | Final Uzama | 72 ° C | 5 dakika | |
| Taq Polimeraz | 0.5 | 2.5 U / ul |
Tablo 4. PCR-amplifikasyonu için koşullar üslü I (adım 8). Sütunlar 1-3, tek bir numunenin iç içe katlanarak amplifikasyonu için kullanılan PCR reaktifleri gösterir. Kolonlar, bir 4-6 numuneden vektör genom birleşme kısımlarının iç içe katlanarak amplifikasyonu için kullanılan PCR programı örneklemektedir.
| Reaktif | Hacim (ul) | Konsantrasyon | PCR Parametreleri | Sıcaklık | Zaman | |
| H 2 O | 42.5 - x | İlk denatürasyon | 95 ° C | 2 dakika | ||
| Tampon | 5 | 10 x | Denatürasyonu | 95 ° C | 45 saniye | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Tavlama | 58 ° C | 45 saniye | 12 döngüleri |
| Fusionprimer A | 0.5 | 10 uM | Uzama | 72 ° C | 60 sn | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 uM | Final Uzama | 72 ° C | 5 dakika | |
| Taq Polimeraz | 0.5 | 2.5 U / ul |
Fusionprimer-PCR için Tablo 5. PCR koşulları (adım 9.2). Sütunlar 1-3 (nr) LAM-PCR ürünlerine dizileme adaptörlerin getirilmesi için kullanılan PCR reaktifleri gösterir. Kolonlar 4-6 Fusionprimer-PCR için kullanılan PCR programı örneklemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LAM-PCR tekniği, bilinen bir DNA bölgesine eşlik bilinmeyen DNA sekanslarının belirlenmesi izin verir. Çünkü bilinen DNA dizisinde spesifik primerler hibridize olan birleşme kısımlarının amplifikasyon kaynaklanan yüksek duyarlılığın, bu tek hücre seviyesine kadar da nadir kavşaklar yükseltmek ve tespit etmek mümkündür. Aksine, bir poliklonal durumda LAM-PCR tek bir reaksiyonda farklı birleşme binlerce amplifiye edebilir.
Bununla birlikte, sınırlama kullanımı nedeniyle integrome sadece bir alt parçası, her bir kısıtlama enzimi ile birleşme varlığı için LAM-PCR ile analiz edilebilir enzimleri. Bu nedenle, farklı enzimler ile aynı numunenin tekrarlı analizi 9 tavsiye edilir. No LAM-PCR amplikonları jeli üzerinde mevcut ise, büyük olasılıkla bilinen DNA fragmanının konumu ve seçilen kısıtlama enzimi en yakın tanıma sitesi arasındaki mesafe LAM-PCR ürünlerinin sağlanması için çok büyük9. Bu durumda, diğer enzimler, birleşme amplifiye etmek için kullanılmalıdır.
nrLAM restriksiyon enzimlerinin kullanılması bağımsız olan ve bu nedenle geniş kapsamlı bilinen bir DNA dizisini kuşatan sekansları tanımlamak için son derece değerli bir yöntemi temsil eder. Kısıtlama her güçlendirilmiş kavşak karakterize belirli bir kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmi kaybına protokol sonuçlarından sindirmek atlama. Bunun yerine her güçlendirilmiş bağlantı amplifiye birleşme çeşitliliğinin bağımsız elektroforezi, sonra jel üzerinde bir yayma ile sonuçlanan çeşitli boyutlarda PCR ürünler ile temsil edilmektedir.
LAM ve nrLAM-PCR Her iki ürün de mükemmel bir şekilde aşağı doğru, yüksek sekanslama için uygundur. Karşılık gelen genomuna (nr) LAM-PCR ürünleri ve alınan ham dizilerin haritalama yüksek verim sıralama bilinmeyen kuşatıcı DNA veya vektör genom birleşme 30 tesisinin lokalizasyonunu tespit karakterize sağlar.Fusionprimers içine barkod dizilerinin yerleştirilmesi ile LAM ve nrLAM-PCR ürünlerinin birkaç yüz bir dizilim vadede 30 dizilenebilir.
Inattentively idam eğer nedeniyle yüksek duyarlılığı, LAM-PCR kirlenmeye eğilimli. Bu durumda, protokol işleme temizlemek için bir PCR dereceli doğası ve başarılı bir şekilde özel bir dikkat Numuneleri kirleten olmayan kuşatıcı DNA bilinmeyen amplifiye etmek için büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle, untransduced genomik DNA ve LAM-PCR protokolü, negatif kontroller olarak her bir PCR reaksiyonu için bir su kontrolü dahil olmak üzere şiddetle tavsiye edilir. Kontrol numuneleri çapraz kontaminasyon protokolü esnasında meydana belirtiyorsa, her duraklama noktadan ürünlerin protokol parçaları tekrar kullanılabilir. Bantları hala mevcut olduğunda, tüm reaktifler (örneğin,., Primer, dNTP, polimerazlar, vb) atmak ve yeni kısmı ile (NR) LAM-PCR protokolü tekrar tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
