Summary
Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren
Introduction
Linear-PCR-vermittelte Amplifikation (LAM-PCR) ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von unbekannten flankierenden DNA benachbart zu bekannten DNA beliebigen Ursprungs. Genauer gesagt, LAM-PCR wurde zur viralen Vektor Integrationsstellen zu lokalisieren (IS) innerhalb des Wirtsgenoms 1,2. Genetische Elemente wie Transposons oder Retroviren integrieren ihr Genom in das Wirtsgenom in einer (halb-) zufälliger Weise 3-6. In vielen Fällen ist es entscheidend, genau die Position, wo diese Vektoren integriert kennen. LAM-PCR nachgewiesen worden überlegen alternative Techniken wie PCR-vermittelte Ligation 7 und seiner Varianten oder inversen PCR-8 sein. Die Empfindlichkeit und Robustheit dieses Verfahrens ergibt sich aus der anfänglichen Vorverstärkung der Vektor-Genom Gänge und magnetische Auswahl amplifizierte PCR-Produkte. Wie die genannten alternativen Verfahren beruht LAM-PCR auf der Verwendung von Restriktionsenzymen, die Einführung eines Bias in Abrufkapazität 9-11. Folglichnur ein Teil des IS-Repertoire (die integrome) in einer Reaktion nachgewiesen werden. Diese Vorspannung wird durch die parallele Analyse einer gegebenen Probe mit optimalen Kombinationen von Restriktionsenzymen 9 minimiert. Kürzlich wurde eine Variante der Technik bezeichnet nicht einschränkenden LAM-PCR (nrLAM-PCR) entwickelt worden, die die Verwendung von Restriktionsenzymen umgeht und ermöglicht unvoreingenommene genomweiten Analyse einer Probe in einem einzigen Reaktions 9,12.
In der Vergangenheit LAM-PCR wurde zur Identifizierung der Verursacher retroviralen IS, die zu Leukämie bei einigen Patienten in der klinischen Gentherapie-Versuche 13-15. Seitdem LAM-PCR wurde angepasst, um zu identifizieren, ist von anderen Integrationsvektoren (lentiviralen Vektoren, Transposons) sowie Integrationsmuster passiv integrierende Vektoren wie Adeno-assoziierten Vektoren (AAV) oder Integrase-defekt lentiviralen Vektoren (IDLV) identifizieren 16 -21. Anwendungen der LAM-PCR sind weit verbreitet: traditionellely, die Technik ist weit verbreitet, um die klonale Zusammensetzung von Gen-veränderten Zellen bei Patienten, die Gen-Therapie unterzogen haben oder studieren, um die biologische Sicherheit von neuartigen Vektorsysteme mit der Entschlüsselung ihrer Integration 15,16,22-24 Verhalten zu beurteilen. Kürzlich LAM-PCR aktiviert Bestimmung Spezifität und Off-Target-Aktivität von Designer-Nukleasen durch eine IDLV Trapping-Assay 25.
Darüber hinaus ermöglicht LAM-PCR, um leicht folgen das Schicksal einer Zelle transduziert im Laufe der Zeit in einem Organismus. Dies erlaubt es, Proto-Onkogene als auch Tumor-Suppressor-Gene zu identifizieren und auch zu Blutbildung oder Krebsstammzellbiologie 26-28 studieren. Nicht zuletzt, LAM-PCR wurde an T-Zell-Rezeptor-Diversity beim Menschen 29 (unveröffentlichte Daten) zu studieren.
Die Eigenleistung der Technik wird durch die Verknüpfung der Methode, um tiefe Sequenzierungstechnologien, die Charakterisierung von Millionen von unbekannten flankierenden DNA mit Einzel-Nukleotid-r erlauben verstärkteSOLUTION in ganzer Genome. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt die Amplifikation und Identifizierung von unbekannten DNA-flankierenden exemplarisch zu identifizieren Lentivirusvektor IST. Oligonukleotide in dem Protokoll verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Heraus DNA oder cDNA von jeder Quelle kann als DNA-Matrize für LAM-PCR und nrLAM-PCR verwendet werden.
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Protocol
1. Vorbereitung der Linker-Kassetten (LC)
- Mischungs 40 ul LC1 Oligonukleotid (Tabelle 1), 40 ul Oligonukleotid LC2 (Tabelle 1, mit der richtigen Restriktionsenzym Hang), 110 &mgr; l Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) und 10 ul 250 mM MgCl 2.
- Inkubation bei 95 ° C für 5min und ließ die Reaktion abkühlen langsam auf Raumtemperatur. In 300 ul H 2 O und konzentrieren dsLinker-DNA auf einem Zentrifugation Filter. In 80 ul H 2 O zu den aliquoten Eluat und 10 ul bereit Linker-Kassette in 0,2 PCR-Röhrchen.
2. Vorverstärkung der Vektor-Genom-Junctions
- Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
- Bestimmen Konzentration der DNA-Proben. Pipette x ul (1-1000 ng für LAM/100-1, 000 ng für nrLAM) von DNA in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Volumen der DNA sollte in jeder Probe und in der ran gleich seinge von 0,5 bis 25 &mgr;.
- Vorbereitung PCR Master Mix, wie in Tabelle 2 beschrieben Mix (50 - x). &mgr; L Mastermix mit jeder DNA-Probe in 0,2 ml PCR-Röhrchen.
- Preamplify Vektorgenom Kreuzungen mit PCR-Bedingungen in Tabelle 2 veranschaulicht. Nach Abschluss der PCR mit 0,5 ul Taq-Polymerase zu jedem PCR-Röhrchen und erneut PCR-Programm. PCR-Produkte können bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden
3. Magnetische Trennung von PCR-Produkt
- Vorbereitung der Magnetic Beads
- Je 20 ul (200 ug) von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen und setzen für 1 min auf dem Magnet Partikelabscheider (MPS) bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen.
- Röhrchen aus MPS und resuspendieren magnetischen Kügelchen in 40 ul PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Expose MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
- Wash Perlen witen 20 ul 3 M LiCl-Lösung (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) aussetzen MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Resuspendieren Perlen in 50 ul 6 M LiCl-Lösung (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
- Mix gesamten PCR-Reaktion aus Schritt 2.2 mit 50 ul hergestellten magnetischen Kügelchen. Inkubieren auf einem Horizontalschüttler (300 rpm) mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Dieser Schritt ermöglicht die Bindung von biotinylierten PCR-Produkt zu beschichteten Kügelchen (DNA-Bead-Komplex) Streptavidin. DNA-Bead-Komplex auf dem Schüttler über Nacht inkubiert und bei 4 ° C für 4 Tage aufbewahrt werden.
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min bei Raumtemperatur entfernen Überstand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O. Sofort mit Schritt 4 für LAM oder Schritt 5 für nrLAM fortzufahren.
4. LAM-Verfahren
- Doppelstrang-DNA (dsDNA) Synthese (LAM nur)
- Expose DNA-Bead-Komplex aus Schritt 3,3 bis 1 min und dis MPSKartenstand. Hinzufügen 8,25 ul H &sub2; O, 1 &mgr; l 10 × Puffer Hexanukleotid, 0,25 ul dNTPs (10 mM) und 0,5 ul (2 U) Klenow-Polymerase. Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Hinzufügen von 90 &mgr; l H 2 O und aussetzen MPS für 1 min. Überstand verwerfen und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O.
- Beschränkung Digest
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Add 8,5 ul H &sub2; O, 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und 0,5 ul Restriktionsenzym inkubieren Reaktion für 1 Stunde. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
HINWEIS: Inkubieren Reaktion bei der Temperatur, die vom Hersteller des Restriktionsenzyms empfohlen. Stellen Sie sicher, dass es innerhalb von nicht vorhanden oder nach der Primer-Bindungsstelle für die Vorverstärkung in der DNA von Interesse verwendet Restriktionsstelle. Für die Wahl des geeigneten Restriktionsenzymen / Restriktionsenzym-Kombinationen beziehen sich auf neun.
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Add 8,5 ul H &sub2; O, 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und 0,5 ul Restriktionsenzym inkubieren Reaktion für 1 Stunde. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
- Ligation von ds Linker (LK)
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Mit 5 &mgr; l H 2 O, 1 ul 10x Fastlink-Puffer, 1 ul ATP (10 mM), 2 &mgr; l Linker Kassette aus Schritt 1.2 und 1 ul Fast-Link-DNA-Ligase (2 U / ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
- Denaturierung von Synthesizer-dsDNA
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 5 ul 0,1 N NaOH. Inkubiere 5 min bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler.
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und sammeln vorverstärktes Vektor-Genom-Übergang Überstand in neue 1,5 ml Röhrchen mit. Sofort mit Schritt 6 oder speichern Stand gehen bei -20 ° C
5. NrLAM-Verfahren
- Ligation von Einzelstrang-Linker (SSLC) (nrLAM nur)
- Expose DNA-Bead-Komplex aus Schritt 3.3 MPSfür 1 min und Ablagestand. Add 6,5 ul H &sub2; O, CircLigase 1 ul 10x Reaktionspuffer, 0,5 &mgr; l MnCl 2 (50 mM), 0,5 ul ATP (1 mM), 1 ul ssLinker Oligonukleotid und 0,5 ul CircLigase (100 U / ul). Inkubieren bei 60 ° C für 1 Stunde.
- Hinzufügen von 90 &mgr; l H 2 O und aussetzen MPS für 1 min. Überstand verwerfen und waschen DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O. Wieder zu MPS für 1 min, Ablagestand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 10 ul H 2 O. aussetzen
6. Exponential Amplification ich
- Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
- Pipette 2 ul Template-DNA (aus Schritt 4.4.2 (LAM) oder 5.1.2 (nrLAM)) in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen.
- Bereiten PCR Master Mix, wie in Tabelle 3 beschrieben. Hinzufügen 48 ul der Master-Mix zu jeder Probe aus Schritt 6.1.1 und verstärken Vektorgenom Gänge durch PCR conditions in Tabelle 3 veranschaulicht. PCR-Produkte bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden,
7. Magnetische Trennung von PCR-Produkt
- Bereiten magnetischen Kügelchen wie in den Schritten 3.1.1 Beispiel - 3.1.3. Resuspendieren Perlen in 20 ul (LAM) oder 50 &mgr; l (für nrLAM) von 6 M LiCl-Lösung (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Mischungs 20 ul (LAM) oder 50 ul (nrLAM) der PCR-Reaktion aus Schritt 6.1.2 mit vorbereiteten magnetischen Kügelchen (Schritt 7.1) und Inkubation auf einem Horizontalschüttler (300 rpm) für 2 h bei Raumtemperatur. DNA-Bead-Komplex auf dem Schüttler über Nacht inkubiert und bei 4 ° C für 4 Tage aufbewahrt werden.
- Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min, entfernen Stand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen.
- Resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 20 ul (LAM) oder 5 ul (nrLAM) 0,1 N NaOH. IncuDebatte für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler, aussetzen MPS für 1 min und sammeln amplifizierte DNA-haltige Überstand in neues 1,5-ml-Tube. Sofort mit Schritt 8.1 oder speichern Stand gehen bei -20 ° C
8. Exponential Amplification II
- Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
- Pipette 2 &mgr; l Matrizen-DNA (aus Stufe 7.3) in 0,2 ml PCR-Röhrchen.
- Vorbereitung PCR Master Mix, wie in Tabelle 4 beschrieben. In 48 &mgr; l Mastermix zu jeder Probe aus Schritt 8.1.1 und verstärken Vektorgenom Gänge von PCR-Bedingungen in Tabelle 4 veranschaulicht. PCR-Produkte bei 4 ° C für bis zu 4 gespeichert werden, Tage-oder langfristig bei -20 ° C
- Zu visualisieren (nr) LAM-PCR-Produkte, Last 10 ul des PCR-Produkts aus Schritt 8.1.2 auf einem 2% Agarosegel. Wenn Banden sichtbar sind, zu analysieren 10 ul der LAM-PCR-Produkt auf hochauflösenden Gel. ACHTUNG: Ethidium Bromid ist mutagen. Arbeiten Sie sehr sorgfältig und immer eine geeignete Schutzhandschuhe.
9. Vorbereitung für die Hochdurchsatz-Sequenzierung
- Reinigung von (nr) LAM-PCR-Produkte
- Mischen Sie 40 ul PCR-Produkt von Schritt 8.1.2 mit 44 ul der Raumtemperatur AMPure XP Magnetic Beads. Inkubiere 5 min bei Raumtemperatur ausgesetzt werden, um MPS für weitere 2 min.
- Überstand verwerfen und zweimal waschen mit 200 ul 70% EtOH auf den MPS.
- Überstand verwerfen und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 30 ul H 2 O. 1 min inkubieren und Überstand in frische 0,2 ml-Tube. Bestimmen Konzentration von DNA gereinigt.
- Fusionprimer PCR-Sequenzierung, um spezifische Adapter hinzufügen.
- Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
- Pipette x ul (40 ng) von DNA in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Volumen von DNA sollte in jeder Probe und in dem Bereich von 0,5 bis 25 &mgr; gleich sein.
- Bereiten PCR Master Mix, wie in Tabelle 5 beschrieben hinzufügen (50 - x). Ul Master Mix zu jeder Probe aus Schritt 9.2.2 und Sequenzierung einzuführen Adapter (nr) LAM-PCR-Produkte von PCR-Bedingungen in Tabelle 5 PCR-Produkte veranschaulicht. bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden
- Um Fusionprimer-PCR-Produkte sichtbar Last 10 ul des PCR-Produkts aus Schritt 9.2.3 auf einem 2% Agarosegel. Reinige verbleibenden PCR-Produkt wie in den Schritten 9.1.1 - 9.1.3. Analysieren 1 ul gereinigte PCR-Produkt aus Schritt 9.4 auf einem automatisierten Hochauflösung Elektrophorese-Gerät genau zu quantifizieren, Konzentration und Fragmentgröße von Fusionprimer-PCR-Produkte.
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Representative Results
LAM-PCR-Amplifikation resultiert in der Vektor-Genom-Übergänge mit einer definierten Fragmentgröße für jede Kreuzung. Die Größe der einzelnen PCR-Fragmente hängt von der Entfernung zwischen dem Ort der bekannten DNA in das Genom und dem nächsten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle. Dies ermöglicht die Visualisierung der Vielfalt der amplifizierten Gänge in analysierten Proben durch Gelelektrophorese, zB. Wenn nur einzelne (monoklonal), mehrere (oligoklonale) oder mehrere (polyklonal) Banden auf dem Gel vorhanden sind. Die Ergebnisse der LAM-PCR am besten durch hochauflösende Elektrophorese-Gelen (2A) angesehen, sondern kann auch auf 2% Agarosegelen (2B) dargestellt werden. nrLAM-PCR-Ergebnisse in PCR-Fragmente verschiedener Länge für jede einzelne Kreuzung. So monoklonale, oligoklonale oder polyklonalen Proben erscheinen als ein Abstrich durch Elektrophorese und können nicht unterschieden werden. Visualisierung des nrLAM-PCR-Produkt auf einem 2% Agarose-Gel ist ausreichend, um festzustellen, erfolgreichProzess des Protokolls (Fig. 2C). Nach der Sequenzierung kann die gewonnene genomische DNA an die jeweilige Wirtsgenom, um genaue Positionen der Position des Vektors (Fig. 3A) ausgerichtet werden, zu identifizieren. Annotation des Genoms ermöglicht es, den IS-Repertoire für verschiedene Vektor-spezifische Features wie Präferenz für die Integration in Gen-kodierenden Regionen (3B) oder in der Nähe Transkriptionsstartstellen (3C) zu analysieren.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der LAM-PCR und nrLAM-PCR. A) Beide Methoden beginnen mit einer Anfangs Vorverstärkung des Vektorgenoms Kreuzungen mit biotinylierten Primern hybridisieren, in der Nähe des Ende der bekannten DNA-Sequenz (hier Long Terminal Repeat (LTR) eines retroviralen Vektors). Vorverstärkung Ergebnisse in biotinyliertenssDNA unterschiedlicher Größe für gleiche oder verschiedene Vektorgenom Kreuzungen. Biotinylierten ssDNA auf magnetische Teilchen für LAM PCR enzymatischen Reaktionsschritte des dsDNA-Synthese besteht, Restriktionsverdau und Ligation eines bekannten Linker-DNA zu erzeugen, Produkte unterschiedlicher Größe mit bekannten Sequenzen an beiden Enden des Produktes erfasst B.). Durch Restriktionslängen-Polymorphismus jeder verstärkten Übergang eine charakteristische Länge. Nach der Denaturierung der LAM-PCR-Produkt wird durch verschachtelte PCR mit Vektor-Linker und spezifischen Primern amplifiziert. C) Für nrLAM ein ssDNA-Linker-Sequenz wird direkt mit dem unbekannten Ende der vorverstärkten ssDNA von A ligiert) ermöglicht exponentielle Amplifikation durch verschachtelte PCR mit Linker und Vektor-spezifischen Primern. Diese Zahl hat sich aus geändert worden 2,12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. >
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse der LAM-PCR und nrLAM-PCR. A, B) LAM-PCR-Analyse der isolierten DNA aus peripheren Blut-Gentherapie behandelten Patienten. Die Zahl der Banden auf dem Gel entspricht der Anzahl der vorhanden in der Probe. Hochauflösende Gele (B) sind besser geeignet, um die Klonalität der untersuchten Proben als 2% Agarose-Gelen (A). C) nrLAM-PCR-Analyse von lentiviralen Vektor transduziert Einzelzellklone oder Bulk-Zellen sichtbar zu machen. Unabhängig von der Anzahl von amplifizierten Insertionsstellen ein Abstrich wird auf dem Gel nach der Elektrophorese zu sehen. M, 100 bp-Leiter; MC, monoklonalen; OC, oligoklonale; PC, polyklonalen. Diese Zahl hat sich von 2,9 geändert.
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Abbildung 3. Repräsentative Beispiele für IS-Analyse durch LAM-PCR und anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung. IST Verteilung bei zwei Patienten aus gammaretroviral (blau) oder lentiviralen (grün) der klinischen Gentherapie-Versuche. Nach der Sequenzierung und Kartierung von LAM-PCR-Produkte an die jeweilige Genom ausgewertet werden können zB:.. A) Genom-weite Verteilung von IS-B) Differenz je nach Präferenz für die Einführung in Gen-kodierenden Regionen zwischen gammaretroviral und lentiviralen Vektoren und C) Präferenz für das Einsetzen der Nähe von Transkriptionsstartstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zweck | Name | Sequenz (5'-3 ') |
| LK-Universal | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Vorverstärkung | LTR-I (3'-Richtung) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-Richtung) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Exponentielle Amplifikation I | LTR-II (3'-Richtung) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-Richtung) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Exponentielle Amplifikation II | LTR-III (3'-Richtung) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-Richtung) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabelle 1 Oligonukleotide. LAM-und nrLAM-PCR zu amplifizieren lentiviralen IST. SSLC wird am 5'-Ende (P) phosphoryliert ist und an 3 'didesoxycytidin (DDC), die während der Ligation zu vermeiden Multimerisierung der SSLC. Im allgemeinen (nr) LAM-PCR-Primer sollte von 18-25 Nukleotiden bestehen und sollte nicht mit dem Wirtsgenom auszurichten. Primer für die Vorverstärkung sollte so nah wie möglich (≤ 120 bp) mit dem 5'-oder 3'-Ende des Vektors angeordnet werden. Zwei zusätzliche Primer für Exponential PCR I und II müssen zwischen dem Primer angebracht werdenzur Vorverstärkung und dem Vektor Ende verwendet. Primer für die Vorverstärkung und Exponential PCR Ich muss 5'-phosphoryliert (P) sein.
| Reagens | Volumen (ul) | Konzentration | PCR-Parameter | Temperatur | Zeit | |
| H2O | 43 - x | Initiale Denaturierung | 95 ° C | 5 min | ||
| Puffer | 5 | 10 x | Denaturierung | 95 ° C | 45 Sek. | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0,5 &mgr; M (nrLAM) | Annealing | 60 ° C | 45 Sek. | 2 x 50 Cycles |
| LTR-I | 0,5 | 0,17 uM | Verlängerung | 72 ° C | 60 Sek. (LAM); 10 sec (nrLAM) | |
| TaqPolymerase | 0,5 | 2,5 U / ul | Finale Dehnung | 72 ° C | 5 min (nur LAM) |
Tabelle 2. PCR-Bedingungen für die Vorverstärkung des Vektorgenoms Gänge (Schritt 2). Spalten 1-3 zeigen die zur Amplifikation eines einzelnen DNA-Probe verwendet, PCR-Reagenzien. Die Spalten 4-6 sind Beispiele für die PCR-Programm zu-Vektor-Genom Kreuzungen preamplify.
| Reagens | Volumen (ul) | Konzentration | PCR-Parameter | Temperatur | Zeit | |
| H 2 O | 40,5 | Initiale Denaturierung | 95 ° C | 5 min | ||
| Puffer | 5 | 10 x | Denaturierung | 95 ° C | 45 Sek. | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Annealing | 60 ° C | 45 Sek. | 35 Zyklen |
| LTR-II | 0,5 | 16,7 uM | Verlängerung | 72 ° C | 60 Sek. (LAM); 5 Sek. (nrLAM) | |
| LC-I | 0,5 | 16,7 uM | Finale Dehnung | 72 ° C | 5 min (nur LAM) | |
| Taq-Polymerase | 0,5 | 2,5 U / ul |
Tabelle 3. PCR-Bedingungen für die exponentielle Amplifikation I (Schritt 6). Spalten 1-3 zeigen die zur exponentiellen Amplifikation eines einzelnen DNA-Probe verwendeten PCR-Reagenzien. Die Spalten 4-6 veranschaulichen die verwendet werden, um ein exponentiell verstärken Probe nach Ligation der Linker-Sequenz PCR-Programm.
| Reagens | Volume (ul) | Konzentration | PCR-Parameter | Temperatur | Zeit | |
| H 2 O | 40,5 | Initiale Denaturierung | 95 ° C | 5 min | ||
| Puffer | 5 | 10 x | Denaturierung | 95 ° C | 45 Sek. | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Annealing | 60 ° C | 45 Sek. | 35 Zyklen |
| LTR-III | 0,5 | 16,7 uM | Verlängerung | 72 ° C | 60 Sek. (LAM); 5 Sek. (nrLAM) | |
| LC-II | 0,5 | 16,7 uM | Finale Dehnung | 72 ° C | 5 min | |
| Taq-Polymerase | 0,5 | 2,5 U / ul |
Tabelle 4. PCR-Bedingungen für die exponentielle Amplifikation I (Schritt 8). Spalten 1-3 zeigen die für verschachtelte exponentielle Amplifikation einer einzigen Probe verwendeten PCR-Reagenzien. Die Spalten 4-6 veranschaulichen die für verschachtelte exponentielle Amplifikation der Vektor-Genom-Übergänge von einer Probe verwendeten PCR-Programm.
| Reagens | Volumen (ul) | Konzentration | PCR-Parameter | Temperatur | Zeit | |
| H 2 O | 42,5 - x | Initiale Denaturierung | 95 ° C | 2 min | ||
| Puffer | 5 | 10 x | Denaturierung | 95 ° C | 45 Sek. | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Annealing | 58 ° C | 45 Sek. | 12 Zyklen |
| Fusionprimer A | 0,5 | 10 uM | Verlängerung | 72 ° C | 60 Sek. | |
| Fusionprimer B | 0,5 | 10 uM | Finale Dehnung | 72 ° C | 5 min | |
| Taq-Polymerase | 0,5 | 2,5 U / ul |
Tabelle 5. PCR-Bedingungen für Fusionprimer-PCR (Schritt 9.2). Spalten 1-3 zeigen die für die Einführung der Sequenzierung Adapter (nr) LAM-PCR-Produkte verwendet, PCR-Reagenzien. Die Spalten 4-6 veranschaulichen die für Fusionprimer-PCR verwendeten PCR-Programm.
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Discussion
Die LAM-PCR-Technik ermöglicht die Identifizierung von unbekannten DNA-Sequenzen, die eine bekannte DNA-Region flankieren. Wegen der hohen Empfindlichkeit von Vorverstärkung der Verbindungen mit spezifischen Primern hybridisiert in der bekannten DNA-Sequenz ergeben, ist es möglich, zu verstärken und zu detektieren, auch seltene Kreuzungen auf Einzelzellebene. Gegenteil, in einem polyklonalen Situation LAM-PCR ist in der Lage, Tausende von verschiedenen Verbindungen in einer einzigen Reaktion zu verstärken.
Aufgrund der Verwendung von Restriktionsenzymen jedoch nur eine Unterfraktion der integrome durch LAM-PCR auf das Vorhandensein von Verbindungen mit jedem bestimmten Restriktionsenzym analysiert werden. Somit wird wiederholte Analyse der gleichen Probe mit verschiedenen Enzymen empfohlen 9. Wenn keine LAM-PCR-Produkte auf dem Gel vorhanden sind, wahrscheinlich die Entfernung zwischen der Lage der bekannten DNA-Fragment und dem nächsten Erkennungsstelle des gewählten Restriktionsenzyms zu groß, um in LAM-PCR-Produkte führen ist9. In diesem Fall sollten andere Enzyme verwendet, um die Kreuzung zu verstärken.
nrLAM ist unabhängig von der Verwendung von Restriktionsenzymen und stellt eine sehr wertvolle Methode zur Charakterisierung umfassend Sequenzen, die eine bekannte DNA-Sequenz, also. Weglassen Restriktionsverdau aus den Protokoll führt zum Verlust von spezifischen RFLP Charakterisieren jedes verstärkten Übergang. Statt jedes verstärkten Übergang durch PCR-Produkte unterschiedlicher Größe, was zu einem Abstrich auf das Gel nach der Elektrophorese, unabhängig von der Vielfalt der verstärkte Übergänge dargestellt.
Sowohl LAM-und nrLAM-PCR Produkte sind perfekt für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Sequenzierung geeignet. Hochdurchsatz-Sequenzierung (nr) LAM-PCR-Produkte und Kartierung der abgerufenen Rohsequenzen zu dem entsprechenden Genom ermöglicht die Charakterisierung unbekannt flankierenden DNA oder Ermittlung der genauen Lokalisierung von Vektor-Genom Gänge 30.Durch die Einführung von Barcode-Sequenzen in den fusionprimers mehrere hundert LAM-und nrLAM-PCR-Produkte können in einer Sequenzierungslauf 30 sequenziert werden.
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit, ist LAM-PCR anfällig für Verschmutzung, wenn unaufmerksam ausgeführt. So ist von größter Bedeutung, eine PCR-grade Umwelt und besonderes Augenmerk auf saubere Handhabung des Protokolls, um den unbekannten flankierenden DNA erfolgreich verstärken Proben ohne Kontamination. Daher einschließlich untransduzierten genomischer DNA und einer Wasserkontrolle für jeden PCR-Reaktion als negative Kontrollen in den LAM-PCR-Protokoll wird dringend empfohlen. Wenn Kontrollproben zeigen, dass eine Kreuzkontamination während des Protokoll aufgetreten ist, können die Produkte aus allen Pause Punkt verwendet, um Teile des Protokolls zu wiederholen. Wenn Bänder noch vorhanden sind, ist es empfehlenswert, alle Reagenzien (zB., Primer, dNTPs, Polymerasen, etc.) zu verwerfen und das Wiederholen des (nr) LAM-PCR-Protokoll mit neuen Teilmengen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
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