Summary
ליניארי הגברה בתיווך (לאם)-PCR היא שיטה שפותחה כדי לזהות את העמדות של שילוב וקטורים ויראליים בגנום המדויקות. הטכניקה התפתחה להיות השיטה מעולה ללמוד דינמיקה משובט בחולי ריפוי גנטי, בטיחות ביולוגית של טכנולוגיות חדישות וקטורית, גיוון תא T, מודלים תא גזע סרטני, וכו '
Introduction
ליניארי הגברה בתיווך PCR (לאם-PCR) מאפשר זיהוי ואפיון DNA איגוף לא ידוע הסמוך לDNA ידוע מכל מקור. באופן ספציפי יותר, לאם-PCR פותח כדי לבצע לוקליזציה של אתרי אינטגרציה וקטור ויראלי (IS) בתוך הגנום המארח 1,2. אלמנטים גנטיים כמו רטרווירוסים או transposons לשלב הגנום שלהם לתוך הגנום המארח באופן אקראי (למחצה) 3-6. במקרים רבים זה הוא מכריע לדעת בדיוק המצב שבו הווקטורים האלה משולבים. לאם-PCR הוכח להיות עדיף על שיטות אלטרנטיביות כמו בתיווך קשירת PCR 7 וגרסותיה או PCR ההפוך 8. הרגישות וחוסנה של שיטה זו נובעים מpreamplification הראשוני של צמתים וקטור הגנום ובחירה מגנטית של מוצרי ה-PCR מוגבר. כמו השיטות חלופיות שהוזכרו, לאם-PCR מסתמך על השימוש באנזימי הגבלה, מציג נטייה ליכולת אחזור של IS 9-11. כך,רק קבוצת משנה של הרפרטואר (integrome) ניתן לאתרם בתגובה אחת. הטיה זו היא למזער על ידי הניתוח המקביל של מדגם נתון באמצעות שילובים אופטימליים של אנזימי הגבלה 9. לאחרונה, גרסה של הטכנולוגיה שמכונה שאינם מגבילה לאם-PCR (nrLAM-PCR) פותח שעוקפת את השימוש באנזימי הגבלה ומאפשרת ניתוח הגנום משוחד של מדגם בתגובה אחת 9,12.
בעבר, לאם-PCR נעשה שימוש כדי לזהות את רטרווירלי סיבתי נותן עלייה לוקמיה בכמה חולים בניסויים בריפוי גנטי קליניים 13-15. מאז, לאם-PCR הותאם לזהות IS מוקטורים אחרים שילוב (וקטורי lentiviral, transposons) וגם לזהות דפוסי השתלבות של פסיבי שילוב וקטורים כמו וקטורי adeno קשור (AAV) או וקטורי lentiviral אינטגראז פגום (IDLV) 16 -21. יישומים של האם-PCR הם רחב התפשטו: מסורתיly, הטכניקה היא בשימוש נרחב כדי לחקור את ההרכב המשובט של תאי גנים שונה בחולים שעברו טיפול גנטי או להעריך את הבטיחות הביולוגית של מערכות וקטור רומן של התרת האינטגרציה שלהם התנהגות 15,16,22-24. לאחרונה, לאם-PCR אפשר קביעת הספציפיות ופעילות מחוץ היעד של nucleases מעצב ידי assay השמנת IDLV 25.
יתר על כן, לאם-PCR מאפשר לעקוב בקלות את גורלו של תא transduced לאורך הזמן באורגניזם. זה מאפשר לזהות אב - אונקוגנים כמו גם גנים מדכאי סרטן וגם ללמוד ביולוגיה של תא גזע סרטני hematopoiesis או 26-28. אחרון אך לא פחות חשוב, לאם-PCR הותאם ללמוד גיוון קולט תא T בבני אדם 29 (ונתונים שלא פורסמו).
הכוח הפנימי של הטכנולוגיה מקבל חיזוק על ידי קישור השיטה לטכנולוגיות רצף עמוקים המאפשרות אפיון מיליונים DNA ידוע איגוף עם r נוקלאוטיד יחידesolution בגנומים שלמים. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים צעד אחר צעד ההגברה וזיהוי של איגוף DNA ידוע exemplarily לזהות וקטור lentiviral IS. Oligonucleotides שימוש בפרוטוקול מפורטת בטבלה 1. חולץ DNA או cDNA של כל מקור יכול לשמש כתבנית ה-DNA לאם-PCR וnrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת קלטות לינקר (LC)
- מערבבים 40 μl של oligonucleotide LC1 (טבלת 1), 40 μl של oligonucleotide LC2 (טבלת 1, עם הסככה אנזים הגבלה מתאימה), 110 μl טריס-HCl (100 מ"מ, pH 7.5), ו10 μl 250 מ"מ MgCl 2.
- לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5min ולתת התגובה להתקרר באיטיות לטמפרטורת חדר. הוסף 300 μl H 2 O ולהתרכז dsLinker-DNA על מסנן צנטריפוגה. הוסף 80 μl H 2 O לeluate וaliquot 10 μl של קלטת מקשר מוכנה ב0.2 צינורות PCR.
2. Preamplification של צמתי הגנום וקטור
- עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
- לקבוע את הריכוז של דגימות דנ"א. פיפטה x μl (1-1,000 ng לLAM/100-1, 000 ng לnrLAM) של ה-DNA לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. נפח של ה-DNA צריך להיות שווה בכל דגימה וברןGE של 0.5-25 μl.
- הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 2 מיקס (50 - x). Μl של תמהיל ההורים עם כל דגימת ה-DNA ב0.2 מיליליטר צינורות PCR.
- צמתים הגנום וקטור Preamplify באמצעות תנאי PCR שהודגם בטבלה 2. לאחר השלמת PCR להוסיף 0.5 μl תקי פולימראז לכל צינור PCR ותכנית ה-PCR בשידור חוזר. ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
3. הפרדה מגנטית של מוצרי ה-PCR
- הכנת חרוזים מגנטיים
- פיפטה 20 μl (200 מיקרוגרם) של חרוזים מגנטיים streptavidin המצופה לתוך צינור 1.5 מ"ל ולחשוף דקות 1 על מפריד החלקיקים המגנטי (MPS) בטמפרטורת חדר. בטל supernatant.
- הסר את הצינור מMPS ו resuspend חרוזים מגנטיים ב40 PSB μl / BSA 0.1% (pH 7.5). לחשוף לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו פעם אחת.
- לשטוף חרוזי wiה 20 μl של 3 פתרון M LiCl (3 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA) לחשוף לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. חרוזים resuspend ב 50 μl של 6 פתרון M LiCl (6 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA).
- מערבבים את תגובת PCR כל משלב 2.2 עם 50 μl של חרוזים מגנטיים שהוכנו מראש. דגירה על שייקר אופקי (300 סל"ד) לפחות לשעה 2 בטמפרטורת חדר. שלב זה מאפשר קשירה של מוצר ה-PCR biotinylated לstreptavidin חרוזים מצופים (מורכב ה-DNA ביד). מורכב חרוז ה-DNA יכול להיות מודגרות שבייקרה לילה או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים.
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS 1 דקות בטמפרטורת חדר, להסיר supernatant, resuspend מורכב-DNA חרוז ב100 μl H 2 O. מייד להמשיך בשלב 4 לאם או על שלב 5 עבור nrLAM.
4. לאם-סדר דין
- הכפול הגדיל DNA (dsDNA) סינתזה (לאם בלבד)
- לחשוף את ה-DNA המורכב ביד מהשלב 3.3 לMPS דקות 1 ודיסsupernatant כרטיס. הוספת 8.25 μl של H 2 O, 1 μl חיץ 10x hexanucleotide, 0.25 dNTPs μl (10 מ"מ) ו0.5 μl (2 U) פולימראז Klenow. לדגור על C ° 37 במשך שעה 1.
- הוספת 90 μl של H 2 O ולחשוף לMPS דקות 1. בטל supernatant ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב 100 μl H 2 O.
- ההגבלה Digest
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוספת 8.5 μl H 2 O, 1 μl חיץ 10x אנזים הגבלה ו0.5 μl של אנזים הגבלה ודגירת תגובה במשך שעה 1. חזור על השלב 4.1.2.
הערה: דגירה תגובה בטמפרטורה המומלצת על ידי היצרן של אנזים ההגבלה. ודא כי אין כיום אתר הגבלה בתוך או במורד הזרם של האתר מחייב פריימר משמש לpreamplification ב-DNA של עניין. לבחירה של שילובי אנזים אנזימי הגבלה / הגבלה המתאימים להתייחס ל9.
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוספת 8.5 μl H 2 O, 1 μl חיץ 10x אנזים הגבלה ו0.5 μl של אנזים הגבלה ודגירת תגובה במשך שעה 1. חזור על השלב 4.1.2.
- קשירה של ds לינקר (LK)
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוסף 5 μl H 2 O, 1 μl חיץ 10x Fastlink, ATP μl 1 (10 מ"מ), 2 μl קלטת לינקר משלב 1.2, ו1 μl מהיר-Link-DNA אנזים (2 U / μl). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על השלב 4.1.2.
- Denaturation של המסונתז dsDNA
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. מורכב resuspend-DNA חרוז ב5 μl 0.1 N NaOH. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר אופקי.
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 ולאסוף צומת וקטור הגנום preamplified המכילה supernatant בצינור 1.5 מיליליטר חדש. מייד להמשיך בשלב 6 או supernatant חנות ב -20 ° C.
5. NrLAM-סדר דין
- קשירה של מקשר חד גדילים (ssLC) (nrLAM בלבד)
- לחשוף את ה-DNA המורכב ביד מהשלב 3.3 לMPSדקות 1 ו supernatant קלפים שנזרקו. הוספת 6.5 μl H 2 O, μl 1 CircLigase 10x תגובת הצפת, 0.5 μl MnCl 2 (50 מ"מ), 0.5 μl-ATP (1 מ"מ), oligonucleotide ssLinker μl 1 וCircLigase 0.5 μl (100 U / μl). לדגור על C ° 60 במשך שעה 1.
- הוספת 90 μl של H 2 O ולחשוף לMPS דקות 1. בטל supernatant ולשטוף מורכבים-DNA חרוז ב100 μl H 2 O. שוב לחשוף לMPS דקות 1, supernatant קלפים שנזרקו ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב H μl 10 2 O.
6. מעריכי ההגברה אני
- עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
- פיפטה 2 תבנית ה-DNA μl (משלב 4.4.2 (לאם) או 5.1.2 (nrLAM)) לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר.
- הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 3. הוספת 48 μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 6.1.1 ולהגביר צמתים הגנום וקטור ידי conditio PCRNS שהודגם בטבלה 3. ניתן לאחסן מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
7. הפרדה מגנטית של מוצרי ה-PCR
- הכן את חרוזים מגנטיים כפי שהודגם בצעדים 3.1.1 - 3.1.3. חרוזים resuspend ב 20 μl (לאם) או 50 μl (לnrLAM) של 6 פתרון M LiCl (6 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA). מערבבים 20 μl (לאם) או 50 μl (nrLAM) של תגובת PCR מהצעד 6.1.2 עם חרוזים מגנטיים מוכנים (צעד 7.1) ו דגירה על שייקר אופקי (300 סל"ד) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. מורכב חרוז ה-DNA יכול להיות מודגרות שבייקרה לילה או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים.
- לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1, להסיר את supernatant ו resuspend מורכב-DNA חרוז ב100 μl H 2 O. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant.
- קומפלקס ה-DNA חרוז resuspend ב 20 μl (לאם) או 5 μl (nrLAM) 0.1 N NaOH. Incuבייט ל10 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר אופקי, לחשוף לMPS דקות 1 ולאסוף supernatant DNA המכיל מוגבר בצינור 1.5 מיליליטר חדש. מייד להמשיך עם צעד 8.1 או supernatant חנות ב -20 ° C.
8. מעריכי ההגברה השני
- עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
- פיפטה 2 תבנית ה-DNA μl (משלב 7.3) לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר.
- הכינו תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 4. הוספת 48 μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 8.1.1 ולהגביר צמתים הגנום וקטור ידי תנאי ה-PCR שהודגם בטבלה 4. ניתן לאחסן מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
- כדי להמחיש (ע"נ) מוצרים לאם-PCR, עומס 10 μl של המוצר ה-PCR מצעד 8.1.2 על ג'ל agarose 2%. אם להקות גלויות, לנתח 10 μl של המוצר לאם-PCR על ג'ל ברזולוציה גבוהה. זהירות: Etברומיד hidium הוא mutagenic. לעבוד בזהירות ותמיד ללבוש כפפות מתאימות.
9. הכנה לרצף תפוקה גבוהה
- טיהור (ע"נ) מוצרים לאם-PCR
- מערבבים 40 μl PCR-מוצרים מהצעד 8.1.2 עם 44 μl של חרוזים מגנטיים טמפרטורת חדר AMPure XP. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר ולחשוף לMPS למשך 2 דקות נוספות.
- בטל supernatant ולשטוף פעמיים עם 200 μl EtOH 70% על MPS.
- בטל supernatant ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב30 H μl 2 O. דגירה 1 דקות וsupernatant העברה לצינור 0.2 מיליליטר טרי. לקבוע את הריכוז של ה-DNA מטוהר.
- Fusionprimer PCR להוסיף רצף מתאמים ספציפיים.
- עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
- פיפטה x μl (40 ng) של ה-DNA לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. נפח של ה-DNA צריך להיות שווה בכל דגימה ובטווח של 0.5-25 μl.
- הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 5 הוסף (50 - x). Μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 9.2.2 ולהציג את מתאמי רצף ל( ע"נ) מוצרים לאם-PCR על ידי תנאי ה-PCR שהודגם בלוח 5 מוצרי ה-PCR. יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
- כדי להמחיש את עומס מוצרי Fusionprimer-PCR 10 μl של המוצר ה-PCR מהצעד 9.2.3 על ג'ל agarose 2%. לטהר את המוצר ה-PCR שנותר כפי שמתואר בצעדים 9.1.1 - 9.1.3. נתח 1 μl מוצר ה-PCR מטוהר מצעד 9.4 על מכשיר אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה אוטומטי מדויק לכמת גודל ריכוז ושבר של מוצרי Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאם-PCR תוצאות בהגברה של צמתים הגנום וקטור עם גודל שבר שהוגדר עבור כל צומת. הגודל של שברי PCR פרט תלוי במרחק בין המיקום של ה-DNA הידוע בגנום ואתר ההכרה הקרוב ביותר הגבלת האנזים. זה מאפשר לדמיין את המגוון של צמתים מוגברות בדגימות נותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה, למשל., אם רק להקות בודדות (חד שבטי), כמה (oligoclonal), או מרובות (polyclonal) נמצאות על ג'ל. תוצאות לאם-PCR הם נראים במיטבו על ידי ג'לים ברזולוציה גבוה אלקטרופורזה (איור 2 א), אך יכולות גם להיות דמיינו על ג'ל agarose 2% (איור 2). nrLAM-PCR תוצאות שבברי PCR של אורך שונים עבור כל צומת בודדת. דגימות כך חד שבטיים, oligoclonal או polyclonal יופיעו ככתם על ידי אלקטרופורזה ולא ניתן להבחין באופן חזותי. לדמיין את מוצר nrLAM-PCR על 2% agarose ג'ל די בכך כדי לקבוע sucסס של הפרוטוקול (איור 2 ג). לאחר רצף הדנ"א הגנומי התאושש יכול להיות מיושר לגנום המארח המתאים כדי לזהות את עמדות של המיקום של הווקטור (איור 3 א) מדויקות. ביאור של הגנום מאפשר לנתח את הרפרטואר לתכונות ספציפיות וקטור שונים כמו העדפת השתלבות באזורי גן קידוד (איור 3 ב) או בסמוך לאתרים להתחיל שעתוק (איור 3 ג).
איור 1. מתווה סכמטי של האם-PCR וnrLAM-PCR. א) שני השיטות להתחיל עם preamplification ראשוני של צמתים הגנום וקטור באמצעות פריימרים biotinylated הכלאה קרוב לסופו של רצף ה-DNA הידוע (חוזר כאן הרבה זמן מסוף (LTR) של וקטור retroviral). תוצאות preamplification בbiotinylatedssDNA של גודל שונה לצמתי הגנום וקטור זהות או שונות. Biotinylated ssDNA הוא נתפס על חלקיקים מגנטיים. ב ') לאם PCR, צעדי תגובה האנזימטית מורכבים מסינתזת dsDNA, הגבלה לעכל וקשירה של ה-DNA מקשר ידוע לייצר מוצרים בגדלים שונים עם רצפים ידועים בשני הקצוות של המוצר. בשל אורך פולימורפיזם הגבלה כל צומת מוגברת יש אורך אופייני. לאחר denaturation המוצר לאם-PCR מוגבר על ידי PCR המקונן עם פריימרים ספציפיים מקשר וקטורית. C) לnrLAM רצף מקשר ssDNA גבעול ישירות לסוף לא ידוע של ssDNA preamplified מ) המאפשר הגברה מעריכי על ידי PCR המקונן עם מקשר ו וקטור פריימרים ספציפיים. נתון זה שונה מ 2,12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. >
איור 2. תוצאות נציג של האם-PCR וnrLAM-PCR. ב) ניתוח לאם-PCR, של DNA המבודד מהדם היקפי של חולים שטופלו בטיפול גנטי. מספר הלהקות על הג'ל מתאים למספר של הווה הוא במדגם. ג'לים ברזולוציה גבוהה (B), מתאימים יותר לדמיין clonality של דגימות נותחו מאשר ג'ל agarose 2% (). ניתוח nrLAM-PCR של וקטור lentiviral שיבוטים transduced תא בודד או תאים בתפזורת C). ללא תלות במספר של אתרי החדרה מוגברות למרוח הוא ראה על ג'ל אלקטרופורזה לאחר. M, 100 סולם נ"ב; MC, חד שבטי; OC, oligoclonal; מחשב, polyclonal. נתון זה שונה מ2,9.
"Width =" es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg 500 "/>
איור 3. דוגמאות מייצגות להוא ניתוח על ידי האם-PCR ורצף תפוקה גבוהה שלאחר מכן. הוא הפצה בשני חולים מgammaretroviral (כחול) או lentiviral (ירוק) ניסויים בריפוי גנטי קליני. לאחר רצף ומיפוי של מוצרים לאם-PCR לגנום בהתאמה IS ניתן להעריך לדוגמא:.. הפצת הגנום רחבה) של הבדל הוא ב ') על פי ההעדפה להכנסה לתוך אזורי קידוד גנים בין gammaretroviral ווקטורי lentiviral ו-C) העדפה להכנסה קרובה לאתרים להתחיל שעתוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מטרה | שם | רצף (5'-3 ") |
| LK-אוניברסלי | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-ת"א | LC2 (ת"א) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | ssLC | CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC (P) TCCCGGGTddC |
| Preamplification | LTR-I (3'-כיוון) | AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT (ב ') |
| LTR-I (5'-כיוון) | TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG (ב ') | |
| אני הגברה מעריכי | LTR-II (3'-כיוון) | GTGTGACTCTGGTAACTAGAG (ב ') |
| LTR-II (5'-כיוון) | (ב) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC- | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| הגברה מעריכי השני | LTR-III (3'-כיוון) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-כיוון) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
טבלה 1. Oligonucleotides לאם וnrLAM-PCR כדי להגביר lentiviral IS. SsLC פוספורילציה בסוף 5'-(P) ויש לו בשעה 3 'didesoxycytidin (DDC), כדי למנוע multimerization של ssLC במהלך קשירה. באופן כללי, (ע"נ) פריימרים לאם-PCR צריכים להיות מורכבים של 18-25 נוקלאוטידים ולא צריך ליישר לגנום המארח. צבעי יסוד לpreamplification צריך להיות ממוקם קרוב ככל האפשר (≤ 120 נ"ב) עד סוף 5 'או 3' של הווקטור. שני פריימרים נוספים למעריכים PCR I ו-II צריכים להיות ממוקמים בין פריימרמשמש לpreamplification וסוף הווקטור. צבעי יסוד לpreamplification והמעריכים PCR אני צריך להיות 5'phosphorylated-(P).
| מגיב | נפח (μl) | התרכזות | פרמטרי PCR | טמפרטורה | זמן | |
| H2O | 43 - x | denaturation הראשוני | 95 מעלות צלזיוס | 5 דקות | ||
| חוצץ | 5 | 10 x | Denaturation | 95 מעלות צלזיוס | 45 שניות | |
| dNTP | 1 | 10 מ"מ (לאם); 0.5 מיקרומטר (nrLAM) | רכוך | 60 ° C | 45 שניות | 2 x 50 מחזורים |
| LTR- | 0.5 | 0.17 מיקרומטר | הארכה | 72 ° C | 60 שניות (לאם); 10 שניות (nrLAM) | |
| תקיפולימראז | 0.5 | 2.5 U / μl | התארכות סופית | 72 ° C | 5 דקות (רק לאם) |
טבלה 2. PCR-תנאים לpreamplification של צמתים הגנום וקטור (שלב 2). עמודות 1-3 להראות ריאגנטים PCR משמשים להגברה של דגימת DNA בודדת. טורים 4-6 מדגימים את תכנית ה-PCR לpreamplify צמתים הגנום וקטור.
| מגיב | נפח (μl) | התרכזות | פרמטרי PCR | טמפרטורה | זמן | |
| H 2 O | 40.5 | denaturation הראשוני | 95 מעלות צלזיוס | 5 דקות | ||
| חוצץ | 5 | 10 x | Denaturation | 95 מעלות צלזיוס | 45 שניות | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 מ"מ | רכוך | 60 ° C | 45 שניות | 35 מחזורים |
| LTR-II | 0.5 | 16.7 מיקרומטר | הארכה | 72 ° C | 60 שניות (לאם); 5 שניות (nrLAM) | |
| LC- | 0.5 | 16.7 מיקרומטר | התארכות סופית | 72 ° C | 5 דקות (רק לאם) | |
| תקי פולימראז | 0.5 | 2.5 U / μl |
לוח 3. PCR-תנאים להגברת מעריכי אני (שלב 6). עמודות 1-3 להראות ריאגנטים PCR משמשים להגברה מעריכית של דגימת DNA בודדת. טורים 4-6 מדגימים את תכנית ה-PCR משמשת כדי להגביר באופן אקספוננציאלי מדגם אחד לאחר קשירת של רצף מקשר.
| מגיב | Volume (μl) | התרכזות | פרמטרי PCR | טמפרטורה | זמן | |
| H 2 O | 40.5 | denaturation הראשוני | 95 מעלות צלזיוס | 5 דקות | ||
| חוצץ | 5 | 10 x | Denaturation | 95 מעלות צלזיוס | 45 שניות | |
| dNTP | 1 | 10 מ"מ | רכוך | 60 ° C | 45 שניות | 35 מחזורים |
| LTR-III | 0.5 | 16.7 מיקרומטר | הארכה | 72 ° C | 60 שניות (לאם); 5 שניות (nrLAM) | |
| LC-II | 0.5 | 16.7 מיקרומטר | התארכות סופית | 72 ° C | 5 דקות | |
| תקי פולימראז | 0.5 | 2.5 U / μl |
לוח 4. PCR-תנאים להגברת מעריכי אני (שלב 8). עמודות 1-3 להראות את חומרים כימיים המשמשים להגברת PCR מעריכי מקוננת של מדגם יחיד. טורים 4-6 מדגימים את תכנית ה-PCR משמשת להגברת מעריכי מקוננת של צמתים הגנום וקטור ממדגם אחד.
| מגיב | נפח (μl) | התרכזות | פרמטרי PCR | טמפרטורה | זמן | |
| H 2 O | 42.5 - x | denaturation הראשוני | 95 מעלות צלזיוס | 2 דקות | ||
| חוצץ | 5 | 10 x | Denaturation | 95 מעלות צלזיוס | 45 שניות | |
| dNTP | 1 | 10 מ"מ | רכוך | 58 ° C | 45 שניות | 12 מחזורים |
| Fusionprimer | 0.5 | 10 מיקרומטר | הארכה | 72 ° C | 60 שניות | |
| Fusionprimer B | 0.5 | 10 מיקרומטר | התארכות סופית | 72 ° C | 5 דקות | |
| תקי פולימראז | 0.5 | 2.5 U / μl |
לוח 5. PCR-תנאים לFusionprimer-PCR (שלב 9.2). עמודות 1-3 להראות ריאגנטים PCR משמשים לכניסתה של מתאמי רצף ל( ע"נ) מוצרים לאם-PCR. טורים 4-6 מדגימים את תכנית ה-PCR משמשת לFusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה לאם-PCR מאפשרת זיהוי רצפי DNA ידועים כי האגף אזור ה-DNA ידוע. בגלל הרגישות הגבוהה וכתוצאה מpreamplification של צמתים עם הכלאת פריימרים ספציפיים ברצף ה-DNA הידוע, אפשר להגביר ולזהות אפילו צמתים נדירים עד לרמת התא הבודד. להיפך, במצב polyclonal לאם-PCR הוא מסוגל להגביר אלפי צמתים שונים בתגובה אחת.
עם זאת, בשל השימוש באנזימי ההגבלה רק subfraction של integrome יכול להיות מנותח על ידי אם-PCR לנוכחות של צמתים עם כל אנזים הגבלה מסוים. לפיכך, ניתוח חוזר ונשנה של המדגם זהה עם אנזימים שונים מומלץ 9. אם לא amplicons לאם-PCR נמצאות על הג'ל, סביר להניח שהמרחק בין מיקומו של קטע DNA הידוע ואתר ההכרה הקרוב של אנזים ההגבלה שנבחר הוא גדול מדי כדי לגרום למוצרים לאם-PCR9. במקרה זה יש להשתמש באנזימים אחרים כדי להגביר את הצומת.
nrLAM אינו תלוי בשימוש באנזימי הגבלה, ולכן מייצג את שיטה יקר מאוד לאפיין באופן מקיף רצפי איגוף רצף ה-DNA ידוע. השמטת הגבלה לעכל מתוצאות הפרוטוקול בהפסד של פולימורפיזם אורך ספציפי בר הגבלה מאפיין כל צומת מוגברת. במקום כל צומת מוגברת מיוצגת על ידי מוצרי ה-PCR בגדלים שונים וכתוצאה מכך למרוח על הג'ל לאחר אלקטרופורזה, בלתי תלויה במגוון של צמתים מוגברות.
מוצרים גם לאם וnrLAM-PCR מתאימים בצורה מושלמת לרצף תפוקה גבוהה במורד הזרם. רצף תפוקה גבוהה של (ע"נ) מוצרים לאם-PCR ומיפוי של רצפי גלם יוחזרו להגנום המקביל מאפשר אפיון ידוע איגוף DNA או זיהוי הלוקליזציה של צמתים וקטור הגנום 30 המדויקות.על ידי החדרת רצפים ברקוד לfusionprimers כמה מאות מוצרים לאם וnrLAM-PCR יכולים להיות רצף בריצת רצף אחד 30.
בשל רגישות גבוהה, לאם-PCR הוא נוטה לזיהום אם יבוצע בפיזור נפש. לפיכך, סביבת כיתה PCR ותשומת לב מיוחדת לניקוי טיפול של הפרוטוקול הוא בעל חשיבות עליונה כדי להגביר הצלחה ידועה איגוף DNA בלי לזהם דגימות. לכן, כולל DNA הגנומי untransduced ושליטה במים לכל תגובת PCR כשולט שלילית לפרוטוקול LAM-PCR מומלץ בחום. אם דגימות בקרה מצביעות על כך שהזיהום צולב התרחש במהלך הפרוטוקול, מוצרים מכל נקודת שתיקה יכולים לשמש גם כדי לחזור על חלקים מהפרוטוקול. כאשר להקות עדיין קיימות, מומלץ למחוק את כל חומרים כימיים (למשל., יחל וdNTPs, polymerases, וכו ') וחוזר על הפרוטוקול לאם-PCR (ע"נ) עם aliquots החדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
