Summary
Linear-förstärkning medierad (LAM)-PCR är en metod som utvecklats för att identifiera de exakta positionerna för att integrera virala vektorer i genomet. Tekniken har utvecklats till att bli den överlägsna metoden för att studera klonala dynamik i genterapipatienter, biosäkerhet av nya vektorteknik, T-cells mångfald, cancerstamcellsmodeller etc.
Introduction
Linear-förstärkning medierad PCR (LAM-PCR) möjliggör att identifiera och karakterisera okända flankerande DNA intill kända DNA av orsak. Mer specifikt har LAM-PCR har utvecklats för att lokalisera viral vektor integrationsställen (IS) inom värdgenomet 1,2. Genetiska faktorer som retrovirus eller transposoner integrerar sitt genom i värdgenomet i en (halv-) slumpmässigt sätt 3-6. I många fall är det avgörande att veta exakt den position där dessa vektorer integrerade. LAM-PCR har visat sig vara överlägsen alternativa tekniker som ligation-medierad PCR 7 och dess varianter eller invers PCR 8. Känsligheten och robusthet av denna metod härrör från den första förförstärkning av vektor-genomet korsningar och magnetiska urval av förstärkta PCR-produkter. I likhet med de alternativa metoder som nämns, LAM-PCR förlitar sig på användningen av restriktionsenzymer, införande av en förspänning i inhämtnings kapacitet av IS 9-11. Sålundaendast en delmängd av IS repertoaren (det integrome) kan detekteras i en reaktion. Denna bias minimeras genom parallell analys av ett givet prov med hjälp av optimala kombinationer av restriktionsenzymer 9. Nyligen, en variant av tekniken kallas icke-restriktiv LAM-PCR (nrLAM-PCR) har utvecklats som kringgår användningen av restriktionsenzymer och tillåter opartisk genomet hela analysen av ett prov i en enda reaktion 9,12.
I det förflutna har LAM-PCR använts för att identifiera den orsakande retroviral ger upphov till leukemi hos några patienter i kliniska genterapiförsök 13-15. Sedan dess har LAM-PCR anpassats för att identifiera IS från andra integrerande vektorer (lentivirala vektorer, transposoner) och även för att identifiera integrationsmönster passivt integrerande vektorer som adenoassocierade vektorer (AAV) eller gras-defekt lentivirusvektorer (IDLV) 16 -21. Tillämpningar av LAM-PCR är stor spridning: traditionellly, är den teknik som används i stor utsträckning för att studera klon sammansättningen av genmodifierade celler hos patienter som genomgått genterapi eller för att bedöma biosäkerhet av nya vektorsystem genom att reda ut deras integration beteende 15,16,22-24. Nyligen, LAM-PCR aktiverat bestämma specificitet och off-aktivitetsmål av designade nukleaser av en IDLV fånga analys 25.
Dessutom LAM-PCR tillåter att enkelt följa ödet för en omvandlade cellen över tiden i en organism. Detta gör det möjligt att identifiera proto-onkogener samt tumörsuppressorgener och även för att studera blodbildningen eller cancerstamcellsbiologi 26-28. Sist men inte minst, var LAM-PCR anpassad för att studera T-cellsreceptor mångfald hos människor 29 (och opublicerade data).
Den inneboende kraften i teknik förstärks genom att koppla metoden till djupa sekvensering teknik som gör det möjligt att karakterisera miljontals okända flankerande DNA med enda nukleotid resolution i hela genom. I följande protokoll, beskriver vi steg för steg förstärkning och identifiering av flankerande okända DNA såsom exempel för att identifiera lentivirusvektor IS. Oligonukleotider som används i protokollet är listade i tabell 1. Extraherat DNA eller cDNA någon källa kan användas som DNA-mall för LAM-PCR och nrLAM-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av linker Cassettes (LC)
- Blanda 40 pl av LC1 oligonukleotid (Tabell 1), 40 pl av LC2 oligonukleotid (Tabell 1, med rätt restriktionsenzym överhäng), 110 | il Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) och 10 ^ il 250 mM MgCl2.
- Inkubera vid 95 ° C under 5 min och låt reaktionen svalna långsamt till rumstemperatur. Addera 300 pl H2O och koncentrera dsLinker-DNA på en centrifuge filter. Tillsätt 80 ^ il H2O till eluatet och alikvot 10 jil av beredd linker kassett i 0,2 PCR-rör.
2. Preamplification av Vector Genome Junctions
- För varje prov som skall analyseras bereda en 50 | il PCR-reaktion.
- Bestäm koncentrationen av DNA-prover. Pipett x il (1-1000 ng för LAM/100-1, 000 ng för nrLAM) av DNA i en 0,2 ml PCR-rör. Volymen av DNA bör vara lika i varje prov och i sprangGE av 0,5 till 25 | il.
- Bered PCR-masterblandning enligt Tabell 2 Mix (50 - x). Pl av mastermixen med varje DNA-prov i 0,2 ml PCR-rör.
- Preamplify vektorgenomet korsningar med användning PCR-betingelser som exemplifieras i tabell 2. Efter slutförande av PCR lägga 0,5 | il Taq-polymeras till varje PCR-rör och kör PCR-program. PCR-produkter som kan lagras vid 4 ° C i upp till 4 dagar eller lång sikt vid -20 ° C.
3. Magnetisk separation av PCR-produkt
- Beredning av magnetiska pärlor
- Pipettera 20 | il (200 ng) av streptavidinbelagda magnetiska pärlor i ett 1,5 ml rör och exponera för en min på det magnetiska partikelavskiljare (MPS) vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Ta bort röret från MPS och slamma magnetiska kulor i 40 pl PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Exponera till MPS för 1 min och kassera supernatanten. Upprepa det här steget en gång.
- Tvätta pärlor with 20 ul av 3 M LiCl-lösning (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) utsättas för MPS under 1 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendera pärlorna i 50 | il 6 M LiCl-lösning (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
- Blanda hela PCR-reaktionen från steg 2,2 med 50 pl förberedda magnetiska kulor. Inkubera på en horisontell skakanordning (300 rpm) i minst 2 h vid rumstemperatur. Detta steg tillåter bindningen av biotinylerad PCR-produkt till streptavidinbelagda pärlor (DNA-Bead-komplexet). DNA-pärla komplex kan inkuberas på skak under natten eller lagras vid 4 ° C i upp till 4 dagar.
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS under 1 min vid rumstemperatur, avlägsna supernatanten och resuspendera DNA-Bead komplexet i 100 ^ il H2O Fortsätt omedelbart med steg 4 för LAM eller steg 5 för nrLAM.
4. LAM-Tillvägagångssätt
- Dubbelsträng-DNA (dsDNA) Syntes (endast LAM)
- Exponera DNA-Bead komplex från steg 3.3 till MPS för 1 min och diskort supernatant. Addera 8,25 pl H2O, 1 pl 10x hexanukleotid buffert, 0,25 | il dNTP (10 mM) och 0,5 | il (2 U) Klenow-polymeras. Inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Lägg till 90 l av H2O och utsättas för MPS för 1 min. Kassera supernatanten och återsuspendera DNA-Bead komplex i 100 pl H2O
- Restriktionsdigere
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min och kassera supernatanten. Lägg 8,5 | il H2O, 1 | il 10 x restriktionsenzymbuffert och 0,5 pl av restriktionsenzym och inkubera reaktionsblandningen under en timme. Upprepa steg 4.1.2.
OBSERVERA: Inkubera reaktionen vid den temperatur som rekommenderas av tillverkaren av restriktionsenzymet. Se till att det inte finns någon begränsning webbplats finns inom eller nedströms primerbindningsstället används för förförstärkning i DNA av intresse. För val av lämpliga restriktionsenzymer / restriktionsenzymkombinationer avser 9.
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min och kassera supernatanten. Lägg 8,5 | il H2O, 1 | il 10 x restriktionsenzymbuffert och 0,5 pl av restriktionsenzym och inkubera reaktionsblandningen under en timme. Upprepa steg 4.1.2.
- Ligering av ds-linker (LK)
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min och kassera supernatanten. Tillsätt 5 | il H2O, 1 pl 10x Fastlink-buffert, 1 ^ il ATP (10 mM), 2 | il Linker kassetten från steg 1,2 och 1 | il Snabb-Link DNA-ligas (2 U / pl). Inkubera vid rumstemperatur under 5 min. Upprepa steg 4.1.2.
- Denaturering av syntetiserade dsDNA
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min och kassera supernatanten. Resuspendera DNA-Bead komplex i 5 pl 0,1 N NaOH. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur på en horisontell skakanordning.
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min och samla förförstärkta vektorgenomet junction innehållande supernatanten i nya 1,5 ml rör. Fortsätt omedelbart med steg 6 eller lagra supernatanten vid -20 ° C.
5. NrLAM-Tillvägagångssätt
- Ligering av enkelsträngad linker (SSLC) (nrLAM endast)
- Exponera DNA-Bead komplex från steg 3,3 till MPSunder 1 minut och kassera supernatanten. Lägg 6,5 | il H2O, 1 pl CircLigase 10x reaktionsbuffert, 0,5 pl MnCl2 (50 mM), 0,5 | il ATP (1 mM), 1 | il ssLinker oligonukleotiden och 0,5 | il CircLigase (100 U / ^ il). Inkubera vid 60 ° C under 1 timme.
- Lägg till 90 l av H2O och utsättas för MPS för 1 min. Kassera supernatanten och tvätta DNA-Bead komplex i 100 pl H2O Igen utsättas för MPS för en min, kassera supernatanten och återsuspendera DNA-Bead komplexet i 10 | il H2O
6. Exponentiell amplifiering I
- För varje prov som skall analyseras bereda en 50 | il PCR-reaktion.
- Pipettera 2 pl mall-DNA (från steg 4.4.2 (LAM) eller 5.1.2 (nrLAM)) i en 0,2 ml PCR-rör.
- Förbered PCR Master Mix som beskrivs i tabell 3. Lägg till 48 l av Master Mix till varje prov från steg 6.1.1 och förstärka vektorgenom korsningar med PCR conditions som exemplifieras i tabell 3. kan PCR-produkter lagras vid 4 ° C i upp till 4 dagar eller lång sikt vid -20 ° C.
7. Magnetisk separation av PCR-produkt
- Förbered magnetiska kulor som exemplifieras i steg 3.1.1 - 3.1.3. Återsuspendera pärlorna i 20 | il (för LAM) eller 50 | il (för nrLAM) av 6 M LiCl-lösning (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Blanda 20 pl (LAM) eller 50 jil (nrLAM) av PCR-reaktionen från steg 6.1.2 med förberedda magnetiska pärlor (steg 7,1) och inkubera på en horisontell skakanordning (300 rpm) under 2 h vid rumstemperatur. DNA-pärla komplex kan inkuberas på skak under natten eller lagras vid 4 ° C i upp till 4 dagar.
- Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera DNA-Bead komplexet i 100 ^ il H2O Exponera DNA-Bead komplexet till MPS för 1 min och kassera supernatanten.
- Resuspendera DNA-Bead komplexet i 20 | il (LAM) eller 5 pl (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incubate för 10 min vid rumstemperatur på en horisontell skakanordning, exponera för MPS för 1 min och samla amplifierade DNA innehållande supernatanten i nya 1,5 ml rör. Fortsätt omedelbart med steg 8.1 eller lagra supernatanten vid -20 ° C.
8. Exponentiell amplifiering II
- För varje prov som skall analyseras bereda en 50 | il PCR-reaktion.
- Pipettera 2 pl mall-DNA (från steg 7,3) i en 0,2 ml PCR-rör.
- Förbered PCR Master Mix som beskrivs i tabell 4. Lägg till 48 l av Master Mix till varje prov från steg 8.1.1 och förstärka vektorgenom korsningar genom PCR-villkor som exemplifieras i tabell 4. Kan PCR-produkter lagras vid 4 ° C i upp till 4 dagar eller längre sikt vid -20 ° C.
- Att visualisera (NR) LAM-PCR-produkter, belastning 10 | il av PCR-produkten från steg 8.1.2 på en 2% agarosgel. Om band är synliga, analysera 10 ul av LAM-PCR-produkten på högupplösande gel. VARNING: Ethidium bromid är mutagent. Arbeta mycket försiktigt och alltid bära lämpliga skyddshandskar.
9. Förberedelse för hög genomströmning sekvense
- Rening av (NR) LAM-PCR-produkter
- Blanda 40 pl PCR-produkt från steg 8.1.2 med 44 l av rumstemperatur AMPure XP Magnetiska pärlor. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur och utsättas för MPS för ytterligare 2 min.
- Kasta bort supernatanten och tvätta två gånger med 200 | il 70% EtOH på MPS.
- Kassera supernatanten och återsuspendera DNA-Bead komplex i 30 pl H2O Inkubera 1 min och överföra supernatanten till frisk 0,2 ml tub. Bestäm koncentrationen av renat DNA.
- Fusionprimer PCR för att lägga sekvensera specifika adaptorer.
- För varje prov som skall analyseras bereda en 50 | il PCR-reaktion.
- Pipett x il (40 ng) av DNA i en 0,2 ml PCR-rör. Volymen av DNA bör vara lika i varje prov och i området av 0,5 till 25 | il.
- Förbered PCR Master Mix som beskrivs i tabell 5 Lägg till (50 - x). Il av Master Mix till varje prov från steg 9.2.2 och införa Sekvense adaptrar till (nr) LAM-PCR-produkter av PCR-villkor som exemplifieras i tabell 5 PCR-produkter. kan lagras vid 4 ° C i upp till 4 dagar eller lång sikt vid -20 ° C.
- Att visualisera Fusionprimer-PCR produkter belastning 10 | il av PCR-produkten från steg 9.2.3 på en 2% agarosgel. Rena återstående PCR-produkt som beskrivs i steg 9.1.1 - 9.1.3. Analysera 1 l renade PCR-produkten från steg 9,4 på en automatiserad högupplösta elektroforesenhet att exakt kvantifiera koncentration och fragment storlek Fusionprimer-PCR-produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LAM-PCR resulterar i förstärkning av vektorgenom korsningar med en definierad fragmentstorlek för varje korsning. Storleken av individuella PCR-fragment beror på avståndet mellan placeringen av den kända DNA i genomet och den närmaste restriktionsenzymigenkänningsställe. Detta gör det möjligt att visualisera mångfalden av förstärkta korsningar i analyserade prover med gelelektrofores, t ex., Om bara enstaka (monoklonala), flera (oligoklonala), eller flera (polyklonala) band finns på gelen. Resultaten av LAM-PCR ses bäst genom högupplösnings elektroforesgeler (figur 2a), men kan även visualiseras på 2% agarosgeler (fig 2B). nrLAM-PCR resulterar i PCR-fragment av olika längd för varje enskild övergång. Således monoklonala, oligoklonala eller polyklonala prover visas som en smutsfläck genom elektrofores och kan inte särskiljas visuellt. Visualisera nrLAM-PCR-produkten på 2% agarosgel är tillräcklig för att bestämma framgångcess av protokollet (figur 2C). Efter sekvensering av det utvunna genom-DNA kan inriktas till respektive värdgenomet för att identifiera exakta positioner platsen i vektorn (figur 3A). Notering av genomet möjliggör att analysera IS repertoar för olika vektorspecifika funktioner som preferens för integration i genen kodande regionerna (figur 3B) eller nära transkriptionsstartställen (Figur 3C).
Figur 1. Schematisk skiss av LAM-PCR och nrLAM-PCR. A) Båda metoderna börjar med en inledande föramplifiering av vektorgenomet korsningar med hjälp av biotinylerade primrar hybridiserar nära änden av den kända DNA-sekvensen (här långa terminala upprepningen (LTR) av en retroviral vektor). Förförstärkning resultat i biotinyleradssDNA av olika storlek för identiska eller olika vektorgenom korsningar. Biotinylerad ssDNA fångas på magnetiska partiklar. B) För LAM PCR, enzymatiska reaktionssteg som består av dsDNA-syntes, restriktionsdigerering och ligering av en känd linker-DNA generera produkter av olika storlekar med kända sekvenser i båda ändarna av produkten. På grund av begränsningar length polymorphism var förstärkt korsning har en karakteristisk längd. Efter denaturering av LAM-PCR-produkten förstärks av kapslad PCR med länkare och vektorspecifika primers. C) För nrLAM en ssDNA länksekvens är direkt ligeras till det okända änden av den förförstärkta ssDNA från A) tillåter exponentiell förstärkning av kapslad PCR med länkare och vektorspecifika primrar. Denna siffra har modifierats 2,12. Klicka här för att se en större version av denna siffra. >
Figur 2. Representativa resultat av LAM-PCR och nrLAM-PCR. A, B) LAM-PCR-analys av isolerad DNA från perifert blod från genterapibehandlade patienter. Antalet band på gelén motsvarar antalet är närvarande i provet. Högupplösta geler (B) är bättre lämpade för att visualisera klona analyserade prover än 2% agarosgeler (A). C) nrLAM-PCR-analys av lentivirusvektor transducerade enkelcellkloner eller bulkceller. Oberoende av antalet amplifierade insättningsställen ett utstryk ses på gelén efter elektrofores. M, 100 bp stege; MC, monoklonal; OC, oligoklonal; PC, polyklonala. Denna siffra har ändrats från 2,9.
es/ftp_upload/51543/51543fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Representativa exempel för IS analys av LAM-PCR och efterföljande hög genomströmning sekvensering. IS fördelning i två patienter från gammaretroviral (blå) eller lentiviral (grön) kliniska genterapiförsök. Efter IS kan utvärderas sekvensering och kartläggning av LAM-PCR-produkter till respektive genom t.ex.:.. A) Genomvid spridning av IS B) Skillnad beroende på preferens för insättning i gen kodande regioner mellan gammaretroviral och lentivirusvektorer och C) preferens för insättning nära transkriptionsstartplatser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Ändamål | Namn | Sekvens (5'-3 ') |
| LK-universal | LC1 | GACCCGGGAGATCTGAATTCAGTGGCACAG CAGTTAGG |
| LK-AATT | LC2 (AATT) | AATTCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCA GATC |
| LK-CG | LC2 (CG) | CGCCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC |
| LK-TA | LC2 (TA) | TACCTAACTGCTGTGCCACTGAAATCAGATC |
| LK-nrLAM-PCR | SSLC | (P) CCTAACTGCTGTGCCACTGAATTCAGATC TCCCGGGTddC |
| Preamplification | LTR-I-(3'-riktning) | (B) AGTAGTGTGTGCCCGTCTGT |
| LTR-I (5'-riktning) | (B) TTAGCCAGAGAGCTCCCAGG | |
| Exponentiell amplifiering I | LTR-II (3'-riktning) | (B) GTGTGACTCTGGTAACTAGAG |
| LTR-II (5'-riktning) | (B) GATCTGGTCTAACCAGAGAG | |
| LC-I | GACCCGGGAGATCTGAATTC | |
| Exponentiell förstärkning II | LTR-III-(3'-riktning) | GATCCCTCAGACCCTTTTAGTC |
| LTR-III (5'-riktning) | CCCAGTACAAGCAAAAAGCAG | |
| LC-II | GATCTGAATTCAGTGGCACAG |
Tabell 1. Oligonukleotider för LAM-och nrLAM-PCR för att amplifiera Lentiviral IS. SSLC fosforyleras vid 5'-änden (P) och har vid 3 'didesoxycytidin (ddC) för att undvika multimerisering av SSLC under ligering. I allmänhet (NR) LAM-PCR-primrar bör bestå av 18 till 25 nukleotider och bör inte ansluter till värdgenomet. Primrar för föramplifiering bör placeras så nära som möjligt (≤ 120 bp) till 5'-eller 3'-änden hos vektorn. Ytterligare två primers för Exponential PCR I och II måste placeras mellan primernanvänds för förförstärkning och vektorn ände. Primers för förförstärkning och exponentiell PCR jag behöver vara 5'-fosforyleras (P).
| Reagens | Volym (^ il) | Koncentration | PCR-parametrarna | Temperatur | Tid | |
| H2O | 43 - x | Initial denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffert | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 | 10 mM (LAM); 0.5 ^ M (nrLAM) | Glödgning | 60 ° C | 45 sek | 2 x 50 cykler |
| LTR-I | 0,5 | 0,17 | iM | Töjning | 72 ° C | 60 sek (LAM); 10 sek (nrLAM) | |
| TaqPolymeras | 0,5 | 2,5 U / | il | Slutlig töjning | 72 ° C | 5 min (endast LAM) |
Tabell 2. PCR-förhållanden för föramplifiering av vektorgenomet korsningar (steg 2). Kolumnerna 1-3 visar PCR-reagens som används för amplifiering av ett enda DNA-prov. Kolumnerna 4-6 exemplifierar PCR-programmet att preamplify vektorgenom korsningar.
| Reagens | Volym (^ il) | Koncentration | PCR-parametrarna | Temperatur | Tid | |
| H2O | 40,5 | Initial denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffert | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 </ Td> | 10 mM | Glödgning | 60 ° C | 45 sek | 35 Cykler |
| LTR-II | 0,5 | 16,7 ^ iM | Töjning | 72 ° C | 60 sek (LAM); 5 sek (nrLAM) | |
| LC-I | 0,5 | 16,7 ^ iM | Slutlig töjning | 72 ° C | 5 min (endast LAM) | |
| Taq-polymeras | 0,5 | 2,5 U / | il |
Tabell 3. PCR-Villkor för exponentiell amplifiering I (steg 6). Kolumnerna 1-3 visar PCR-reagens som används för exponentiell amplifiering av ett enda DNA-prov. Kolumnerna 4-6 exemplifierar PCR-program som används för att exponentiellt förstärka ett prov efter Ligation av länksekvens.
| Reagens | Volume (il) | Koncentration | PCR-parametrarna | Temperatur | Tid | |
| H2O | 40,5 | Initial denaturering | 95 ° C | 5 min | ||
| Buffert | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Glödgning | 60 ° C | 45 sek | 35 Cykler |
| LTR-III | 0,5 | 16,7 ^ iM | Töjning | 72 ° C | 60 sek (LAM); 5 sek (nrLAM) | |
| LC-II | 0,5 | 16,7 ^ iM | Slutlig töjning | 72 ° C | 5 min | |
| Taq-polymeras | 0,5 | 2,5 U / | il |
Tabell 4. PCR-Villkor för exponentiell amplifiering I (steg 8). Kolumnerna 1-3 visar PCR-reagens som används för nästlad exponentiell amplifiering av ett enda prov. Kolumnerna 4-6 exemplifierar PCR-program som används för kapslade exponentiell förstärkning av vektorgenom korsningar från ett prov.
| Reagens | Volym (^ il) | Koncentration | PCR-parametrarna | Temperatur | Tid | |
| H2O | 42,5 - x | Initial denaturering | 95 ° C | 2 min | ||
| Buffert | 5 | 10 x | Denaturering | 95 ° C | 45 sek | |
| dNTP | 1 | 10 mM | Glödgning | 58 ° C | 45 sek | 12 cykler |
| Fusionprimer A | 0,5 | 10 | iM | Töjning | 72 ° C | 60 sek | |
| Fusionprimer B | 0,5 | 10 | iM | Slutlig töjning | 72 ° C | 5 min | |
| Taq-polymeras | 0,5 | 2,5 U / | il |
Tabell 5. PCR-Villkor för Fusionprimer-PCR (steg 9,2). Kolumnerna 1-3 visar PCR-reagens som används för införande av sekvense adaptrar till (nr) LAM-PCR-produkter. Kolumnerna 4-6 exemplifierar PCR-program som används för Fusionprimer-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LAM-PCR-tekniken tillåter identifiering av okända DNA-sekvenser som flankerar en känd DNA-region. På grund av den höga känslighet som har uppstått genom föramplifiering av övergångarna med specifika primrar som hybridiserar i den kända DNA-sekvensen, är det möjligt att amplifiera och detektera även sällsynta övergångarna ned till enkelcellnivå. I motsats, i en polyklonal situation LAM-PCR kan förstärka tusentals olika korsningar i en enda reaktion.
Men på grund av användning av restriktionsenzymerna endast en underfraktion av integrome kan analyseras med LAM-PCR för närvaron av korsningar med varje särskilt restriktionsenzym. Således är upprepad analys av samma prov med olika enzymer rekommenderas 9. Om inga LAM-PCR-amplikoner är närvarande på gelén, troligen avståndet mellan placeringen av den kända DNA-fragment och den närmaste igenkänningsstället av den valda restriktionsenzym är för stor för att resultera i LAM-PCR-produkter9. I detta fall är andra enzymer bör användas för att förstärka förbindelsen.
nrLAM är oberoende av användningen av restriktionsenzymer, och därför representerar en värdefull metod för att uttömmande karakterisera sekvenser som flankerar en känd DNA-sekvens. Utelämna begränsning smälta från protokoll leder till förlust av specifika restriction fragment length polymorphism kännetecknar varje förstärkt korsning. Istället varje förstärkta korsning representeras av PCR-produkter av olika storlek som resulterar i ett utstryk på gelén efter elektrofores, oberoende av mångfalden av förstärkta korsningar.
Både LAM-och nrLAM-PCR-produkter är perfekt lämpade för nedströms hög genomströmning sekvensering. Hög genomströmning sekvensering av (nr) LAM-PCR-produkter och kartläggning av hämtas råa sekvenser till motsvarande genomet möjliggör karakterisera okända flankerande DNA eller identifiera den exakta lokaliseringen av vektor-genomet korsningar 30.Genom att införa streckkodssekvenser i fusionprimers flera hundra LAM-och nrLAM-PCR-produkter kan sekvenseras i en sekvenseringskörning 30.
På grund av hög känslighet, är LAM-PCR benägna att smitta om de utförs inattentively. Således är en PCR-grade miljö och särskild uppmärksamhet för att rengöra hantering av protokollet av yttersta vikt för att lyckas förstärka det okända flankerande DNA utan att förorena proverna. Därför, inklusive otransducerade iskt DNA och en vattenkontroll för varje PCR-reaktion som negativa kontroller i LAM-PCR-protokoll rekommenderas starkt. Om kontrollprover indikerar att korskontaminering skett under protokollet, kan produkterna från varje pauspunkt användas för att upprepa delar av protokollet. När band som fortfarande finns kvar, är det rekommenderat att göra alla reagens (t.ex.., Primers, dNTP, polymeraser, etc.) och upprepa (nr) LAM-PCR-protokoll med nya alikvoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1% wt/vol BSA |
| 6 M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96-well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
