Summary
طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.
Abstract
الزرد هو نموذج مهم لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم التجدد. ومع ذلك، استراتيجيات لتوظيف الجزيئية وعلم الوراثة العكسية لم يتم تطويرها بشكل كاف لتقييم وظيفة الجين في تجديد أو توازن الأنسجة أثناء مراحل اليرقات بعد مرحلة التطور الجنيني الزرد، والعديد من الأنسجة داخل اليرقة الزرد يصعب استهدافها. الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة تقدم طريقة بديلة لعدم القدرة الحالية لاستهداف genomically الجينات الزرد في الطريقة التي تسيطر عليها مؤقتا في هذه المراحل. يسمح هذا الأسلوب لتشتت كاملة والتأسيس لاحقة من morpholino في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك الهياكل التي كانت في السابق من المستحيل التوصل إلى مثل تلك الموجودة في الزعنفة الذيلية اليرقات، بنية غالبا ما تستخدم للبحث noninvasively تجديد الأنسجة. وحاضرا أيضا العديد من الجينات تفعيلها خلال اليرقات finfold التجديدر في تجديد الأنسجة الفقاريات الكبار، وبالتالي فإن اليرقة هو نموذجا مفيدا لفهم التجديد في البالغين. يسمح هذا الأسلوب morpholino التشتت لتحديد سريعة وسهلة من الجينات المطلوبة لتجديد أنسجة اليرقات وكذلك الظواهر الفسيولوجية الأخرى التي تنظم توازن الأنسجة بعد مرحلة التطور الجنيني. لذلك، يوفر هذا الأسلوب تسليم استراتيجية حاجة حاليا للسيطرة الزمني لتقييم وظيفة الجين بعد مرحلة التطور الجنيني.
Introduction
تجديد الأجهزة والزوائد المهم بشكل أساسي من أجل البقاء واللياقة البدنية؛ ومع ذلك، العديد من الفقاريات بما في ذلك رجل حدت قدرات التجدد. بينما توجد العديد من النماذج الحيوانية التي لديها القدرة على التجدد واسعة، عكس التقنيات الوراثية لتقييم وظيفة الجين خلال الجهاز وأطرافهم التجديد تبقى محدودة جدا أو غير موجودة. لذا، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتشريح البيولوجيا الجزيئية للتجديد في هذه الكائنات الطراز.
الزرد هو نموذج راسخة لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم تجديد 1، وليس فقط بسبب قدرة كبيرة لتجديد أجهزة متعددة والأنسجة والزوائد، ولكن أيضا لأن العديد من خطوط الأسماك المعدلة وراثيا موجودة لتعقب الخلايا و لoverexpress الجينات يبني 2، 3. ومع ذلك، وتثبيط الجينات في الزرد اليرقات يقتصر أساسا إلى overexpression من بنيات المهيمنة على السلبية، والتي ليست متاحة لجميع الجينات في المصالح أو التي يمكن الحصول على مكاسب من وظيفة الآثار التي لا تعكس النشاط الذاتية من الجين المنتج التحوير. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة بديلة لإزالة تحديدا التعبير الجيني بالضربة القاضية أو ضربة قاضية للتغلب على هذه القضايا.
الجينات المحددة التي تستهدف استخدام TALENS موجود كوسيلة الوراثية العكسية لبالضربة القاضية وظيفة الجين؛ ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية هو خروج المغلوب محدودة جدا في كثير من الأحيان إلى عمليات تقييم وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، لأن الاحتياجات الأولية من الجين منع المزيد من التقدم من التطور الجنيني. وبالتالي، دراسة الظواهر في وقت لاحق مثل تجديد أو توازن الجهاز بعد التطوير باستخدام TALENS تنتفي صفة 4، 5. وبالتالي، هناك حاجة إلى الجين استراتيجية إزالة البديلة التي تستهدف وظيفة الجين بعد التنمية في وقت مبكر لتقييم متطلبات الجينات في الأجهزة والهياكل تشكيلها بالكامل. وقد تبين Morpholino الحقن لتكون فعالة في استهداف الجينات في عدد قليل من أجهزة الكبار والكبار تجديد زعنفة 6-8، ولكن هذه الأساليب تتطلب التثقيب الكهربائي والعديد من الأعضاء الداخلية يصعب ل electroporate إما بسبب موقعها أو بسبب حساسيتها للالكهربائية انقطاع. علاوة على ذلك، بعض الأنسجة في يرقة يصعب حقن مباشر، وذلك لأن الحقن المباشر قد يعطل السلامة الهيكلية أو بسبب حجمها يحد. الزعنفة الذيلية لليرقة واحدة من هذه البنية، لأن الحقن المباشر في finfold غير ممكن. وبالتالي، هناك حاجة إلى بديل لالتثقيب الكهربائي والحقن المباشر لاستهداف الجينات في الأنسجة التي إما أن تكون صغيرة جدا لحقن أو لا يمكن electroporated.
من أجل استهداف وتمنع وظيفة جينات معينة خلال تجديد الزعنفة الذيلية اليرقات، ونحن قد عدلت التقنيات morpholino القائمة السماح لssessment من خلال تجديد وظيفة الجين الزعنفة الذيلية في وقت متأخر من مراحل اليرقة. هذا الأسلوب يعمل داخل البطيني تسليم 9 من بين فلوريسئين الموسومة morpholinos جنبا إلى جنب مع إندو بورتر ترنسفكأيشن الكاشف 10. مرة واحدة في البطين، خليط morpholino-إندو بورتر ينتشر بسرعة في جميع انحاء اليرقة عن طريق الأوعية الدموية ويدخل الأنسجة التي كان من المستحيل سابقا لاستهداف. هذه الطريقة حقن يجوز تعديل لاستهداف الجينات في أنسجة معينة وربما الى حد بعيد يمكن تطبيقها في النماذج الحيوانية الأخرى التي تفتقر حاليا أساليب الوراثية العكسية لتثبيط وظيفة الجينات. وبالتالي، فإنه يوفر طريقة سريعة وسهلة مع إمكانية استخدام مجموعة واسعة لدراسة وظيفة الجين على الفور خلال توازن الجهاز عامة والتجديد في مراحل اليرقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الإبر الزجاج (الشكل 1)
- استخدام الزجاج الشعيرات الدموية مع 0.75 مم لإعداد الإبر الحقن (الشكل 1A).
- وضع الزجاج الشعرية في مجتذب الإبرة وسحب الإبرة مع المعلمة التالية: قيمة دورة التدفئة: 463؛ سحب قيمة دورة: 230؛ السرعة: 150 ميللي ثانية؛ الوقت: 150 ميللي ثانية (الشكل 1B).
- كسر الزجاج الشعرية سحبت مع ملاقط ساعاتي لإنتاج إبرة قطرها 20 ميكرومتر تحت المجسام مع العدسة ميكرون.
- استخدام مخرطة مع المبللة عجلة الغزل المطاط لشحذ الإبرة وتنتج 20 ميكرون شطبة (أرقام 1C و1D). ملاحظة: شارب، والإبر مشطوف تحسين سهولة الإدراج في البطين، وبالتالي التقليل من الأضرار التي لحقت الأنسجة والعضلات مثقبة تسمح لختم بعد إزالة الإبرة (أرقام 1E-G).
2. Preparأوجه من الحل Morpholino
- إعداد الأسهم morpholino عن طريق إذابة morpholino مجفف بالتجميد في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى تركيز النهائي من 7.5 ملم. [راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل (الجدول مواد)].
- إعداد الحل الحقن morpholino عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر حل الأسهم morpholino (7.5 ملم) مع 2.8 ميكرولتر إندو بورتر محلول المخزون (1 ملم) (انظر الجدول مواد) لتركيز النهائي من 3.5 ملم و 0.5 ملم morpholino إندو بورتر.
3. إعداد حقن Morpholino (الشكل 2)
- تحميل إبرة الزجاج مشطوف مع 5 ميكرولتر من هذا الحل باستخدام micropipette مع 10 ميكرولتر ماصة microloader طرف.
- ادخال الإبرة الزجاج في ماسك الإبرة من مياداة مجهرية متصلة مضخة هوائية بيكو (أرقام 2A-C).
- وضع حامل إبرة بجانب المجهر بحيث الإبرة الاحتياجات فقطيمكن نقلها في اتجاه واحد إلى مستو أدخله في البطين في القلب من اليرقة (الشكل 2A).
- ضبط زاوية للحقن بنحو 45 درجة.
- تعيين قيم microinjector على النحو التالي: عقد الضغط: 20 £ لكل بوصة مربعة (رطل)؛ طرد الضغط: 15 رطل؛ 100 ميللي ثانية مجموعة من تبوب، قيمة الفترة من 1.9 (10.9 ميللي ثانية يناظر).
- تذوب الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X باستخدام الميكروويف القياسية لإنتاج 20 مل من 1.5٪ (ث / ت) هلام. صب جل ذاب في طبق بتري 10 سم. وضع شكل حقن مخدد في الاغاروز دافئ حتى أنه بمجرد صلابة، فإن الاغاروز يكون الأخاديد التي سيتم وضعها اليرقة مخدرا 11 (2D و 2E أرقام).
4. حقن (الشكل 3)
- تخدير اليرقات في 100 مل من الماء الحوض مع 20 ملغ / لتر تريكين (L-إيثيل-M-الأمينية بنزوات الميثان سلفونات) حتى يتوقف عن الاستجابة للمس.
- استخدام البلاستيك باستور pipettه لنقل بعناية اليرقة مخدرا في أخدود من العفن الرطب الاغاروز بحيث الجانب البطني تواجه ضد الجدار الاغاروز العمودي للأخدود (الشكل 3A).
- وضع لوحة الاغاروز تحت stereomicroscope بحيث البطين تواجه بعيدا عن إبرة الحقن (الشكل 3A).
- خفض الإبرة إلى أدخله في البطين في القلب. ادخال الإبرة فقط 1-2 ميكرون إلى البطين مع الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا (أرقام 3B و 3C).
- مرة واحدة يتم إدخال الإبرة، وضخ الحل morpholino إلى البطين مع 4-6 والبقول، وتقديم كل NL 3 من الحل، مع انتظار فترات السماح المقاصة من القلب (أرقام 3D و 3E).
- بعد الحقن، وإزالة الإبرة (موازية لطائرة من الإدراج) ومن ثم نقل بعناية اليرقة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مملوءة E3 المتوسطة البكالورياك في طبق بتري تحتوي المتوسطة E3 الطازجة.
- وضع إبرة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمنع جفاف الإبرة عند نقل اليرقة حقن.
- كرر الخطوات من 4،1-4،6 كل 12-24 ساعة لمدة التجربة. ملاحظة: تكرار الحقن يضمن امتصاص وصيانة morpholino في الخلايا.
5. تحليلات حقن (الشكل 4)
- تخدير الأسماك في 100 مل من الماء الحوض مع 20 ملغ / لتر تريكين حتى يتوقف عن الاستجابة للمس.
- وضع اليرقة أفقيا على شقة الرطب 1.5٪ (ث / ت) لوحة الاغاروز مغطاة E3 المتوسطة.
- اليرقات الصورة باستخدام stereomicroscope مع brightfield والتصوير مضان. ملاحظة: كما أن اليرقات شفافة، ينبغي أن يكون morpholino فلوريسئين الموسومة مرئية كما الفلورية الخضراء في الأوعية الدموية في جميع أنحاء الحيوان مباشرة بعد الحقن. وهذا مضان مزيد من تفريق إلى الأنسجة عن طريق أوعية دموية15 دقيقة (أرقام 4A-4C).
6. تقييم التجديدي ثمرة
- تقييم الصور الملتقطة باستخدام فيجي صورة J البرمجيات الحرة (http://fiji.sc/Fiji). للتحقيق في التجديد، واستخدام أداة تتبع خط لتحديد مقدار النمو التجديدي الذي طرأ على السيطرة وحقن morpholino اليرقة.
- لمعايرة الصور، فتح أحد ملفات الصور الأصلية في فيجي عن طريق سحب وإسقاط الملفات في إطار فيجي الرئيسي.
- لتعيين نطاق لجميع الصور التالية، انتقل إلى "تحليل" في القائمة الرئيسية.
- في القائمة المنسدلة انقر على "نطاق محدد".
- في هذا الإطار، بدوره على "جلوبل" الخيار بالضغط على خانة الاختيار.
- الآن فتح الصورة لقياس مقدار النمو التجدد مرة أخرى عن طريق السحب والإسقاط (انظر الخطوة 6.1).
- اختيار "التحديدات مرفوعة" أداة في شريط الأدوات.
- تطويق المنطقة المراد قياسها (فايgures 4J-4L).
- اضغط على Ctrl + M. وهذا فتح جديد "نتائج" نافذة تظهر قيمة المنطقة المحاصرة في مربع بكسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم وضع حاد، مشطوف حقن الإبرة بسهولة في البطين في القلب من اليرقة الزرد عندما اقترب ظهريا (الشكل 3A). قلب يستمر الضخ ويتم الاحتفاظ تدفق الدم رغم وجود إبرة (أرقام 3B و 3C). الحقن الدقيق لا يعطل التشكل من البطين أو تقلصات القلب (الشكل 3D) على الرغم من حقن morpholino في قلب (الشكل 3E).
في غضون دقائق، والحل morpholino-إندو بورتر توزع في جميع أنحاء الجسم عبر الأوعية الدموية (أرقام 4A و 4B). ثم يتم توزيع morpholino من الأوعية الدموية إلى الأنسجة المختلفة مثل finfold والدماغ لا يقل عن 12 ساعة أو أكثر كما لوحظ من مضان (الشكل 4C).
في هذا النهج، ونحن إزالة الطرف البعيد من اله finfold، الطرف البعيد من الحبل الشوكي والعضلات الجذع البعيدة، والحبل الظهري القاصي والخلايا الصبغية (أرقام 4D و4H)؛ وكلها صعبة خصيصا لاستهداف عن طريق الحقن المباشر بسبب الاكتناز (العضلات)، صغيرة الحجم (النخاع الشوكي والحبل الظهري) وركاكة (finfold)، ولكن يبدو أن دمج morpholino بعد الحقن البطيني المسلسل، والتي ينظر إليها من قبل مضان داخل هذه الأنسجة (الشكل 4E) بالمقارنة مع الحيوانات uninjected (أرقام 4F و 4G). وبالتالي، فإن هذا الأسلوب يعزز بسهولة نسبيا تسليم morpholino إلى الأنسجة التي يصعب تستهدف بشكل فردي، وأنه يسمح تقييم وظيفة الجينات في العديد من الأنسجة في زعنفة تجديد مرة واحدة. لتقييم أهمية جينات معينة تشارك في التجديد، واحد يبتر جراحيا جزئيا الزعنفة الذيلية اليرقات (الشكل 4H)، resecting جميع الأنسجة التي لديها incorp orated في morpholino (الشكل 4I). وfinfold اليرقات تجدد بنيتها في غضون بضعة أيام آخر بتر (د ب أ) (الشكل 4J). استهداف Morpholino الجينات المطلوبة للتجديد (بيانات غير منشورة) يؤدي إلى استجابة التجدد قلق (الشكل 4K) مقارنة uninjected (الشكل 4J) والضوابط morpholino عدم تطابق (الشكل 4L). الأثر الكلي لهذه التجارب morpholino على ثمرة التجدد يمكن قياسها باستخدام أدوات كيمونسيجيا القياسية في برامج فيجي المتاحة للعموم 12 عن طريق تتبع الأنسجة المجددة وبمقارنة المناطق (أرقام 4J-4L). وبالتالي، يوفر هذا الأسلوب استهداف الجينات مقايسة سريعة وسهلة نسبيا لاختبار أهمية الجينات في عملية التجديد.
5fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1. إعداد الإبر الزجاج الشعرية للحقن. A) زجاج أنبوب شعري قبل سحب (أعلاه) وسحبت إبرة (أدناه). ب) إبرة جهاز سحب. C) مخرطة لالميلا وشحذ الإبرة الزجاج. وينظر الإبرة من خلال مناظير. D) ومخرطة هو المبللة القرص الغزل المطاط. وخفضت الإبرة ببطء على القرص. يجب أن يكون E) شحذ إبرة شطبة القصيرة التي لم يعد (20 ميكرون) مما هو واسعة (20 ميكرون) لتقليل المساحة اللازمة لإدراج نهاية كاملة من الإبرة في القلب اليرقات البطين. F) العالي تكبير الصورة تظهر غيض من الإبرة. G) عرض تخطيطي من طرف الإبرة التي تبين شكل شطبة بعد شحذ.
s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
تعيين الرقم 2. جهاز حقن ما يصل ألف) جهاز كامل لحقن morpholino في اليرقة الزرد. B) الاحتياطية للسيطرة على موضع إبرة أثناء الحقن. C) مضخة بيكو الذي ينظم الضغط الهوائية للحقن. D) نموذج الصحافة استخدامها لإنشاء قالب الاغاروز. E) العفن الاغاروز تستخدم لتحقيق الاستقرار يرقة للحقن.
الرقم 3. حقن يرقة السمك. A) موضع إبرة فيما يتعلق اليرقة الزرد. B) الإدراج في البطين في القلب. C) الإسفار من morpholino في الإبرة ولكن غائبة في البطين قبل injectiعلى. D) Brightfield صورة يوضح العلاقة بين حجم الإبرة الزجاج والبطين اليرقات. E) من حقن morpholino فلوري إلى البطين في القلب. قضبان مقياس يساوي 100 ميكرون.
الشكل 4. تشتت morpholino في جميع أنحاء الأسماك. A) الزرد لمدة 3 أيام اليرقة القديمة. ب) الإسفار من morpholino في جميع أنحاء الجسم الأوعية الدموية (الخامس) 5 دقائق آخر البطين الحقن. C) التشتت من morpholino في جميع أنحاء الحيوانية بما في ذلك finfold (وو) الموسومة فلوريسئين والدماغ (ب) في كبار السن اليرقة بعد حقن كل 12 ساعة morpholino D) مناديل في الزعنفة الذيلية اليرقات والجذع:. الحبل الظهري (ن) والحبل الشوكي (الشوري)، الصباغ (ع)، وfinfold (و و) E) تفرقوا morpholinoبعد عدة دقائق الحقن في أنسجة اليرقات الجذع بما في ذلك finfold. F) صورة Brightfield من الجذع اليرقات uninjected والزعنفة الذيلية. خط متقطع يدل على طائرة بتر المحتملين. G) زعنفة Uninjected المصورة مع مرشح GFP تظهر تألق ذاتي باللون الأخضر (السهام). شكل شجيري من الهياكل الاستشعاع يشير إلى أن هذه هي الخلايا الصبغية. H) Brightfield صورة الزعنفة الذيلية اليرقات بتر جراحيا من خلال الحبل الظهري، والعضلات والنخاع الشوكي. الأول) صورة نيون تظهر توزيع morpholino في الأنسجة جدعة. Morpholino إدماجها في العضلات، والحبل الشوكي، الحبل الظهري وfinfold. J) مجدد الهياكل finfold الذيلية البرية من نوع اليرقة. خط أسود يتتبع الأنسجة المجددة للتحليل الكمي. K) تثبيط Morpholino بوساطة من التجدد. تتبع الخط الأسود يبرز بوضوح انخفاض تجديد إعادةبعد استجابته morpholino ضربة قاضية. L) مجدد finfold الذيلية من يرقة حقن مع morpholino السيطرة عدم تطابق تظهر استجابة مماثلة كما هو الحال في تجديد يرقة uninjected (J). قضبان مقياس يساوي 100 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر حقن داخل البطيني طريقة تقييم سريع وموثوق بها لاختبار وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطور أو من التوازن الجسم دون التأثير على وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني. لضمان نجاح هذه التقنية، ينبغي للمرء أن يكون على بينة من أربع نقاط هامة: 1) حجم الإبرة، 2) التجفيف من الإبرة، 3) التقليل من حجم، و4) الحد الأدنى من التعرض الوقت في حل التخدير. سوف الإبر التي هي صغيرة جدا تسد كثير من الأحيان، بينما الإبر التي تكون كبيرة جدا سيضر البطين ويسبب النزيف. في حين أن 20 ميكرون من المستحسن، أن الإبرة أبدا أن يكون أكثر من خمس حجم غرفة البطين. وهناك نقطة حرجة الثاني هو الحفاظ على الإبرة من الجفاف وانسداد. صغر حجم الإبرة وتوقف متكررة لا مفر منه لرزين، ونقل موقف اليرقة يمكن أن توفر ما يكفي من الوقت للسماح للmorpholino في طرف الإبرة لتجف وتسد الإبرة. لمنعهذا، يمكن للمرء أن تزج إبرة في طبق بتري من برنامج تلفزيوني 1X. وهناك نقطة حرجة الثالث هو تقليل الانتفاخ من البطين بواسطة عالية جدا من الصوت. إذا كان الدواء محدود بسبب حجم الإبرة، ثم زيادة عدد الحقن الأفضل دائما لزيادة حجم: يمكن أن تسبب إصابات كميات أكبر تمتد إلى القلب. وهناك نقطة حرجة الرابع هو مدى التخدير. وتستند في الوقت تخدير على طول الفترة الزمنية اللازمة لهذا الإجراء. يمكن أن تبقى اليرقات في حل التخدير وتبقى مخدرا لعدة دقائق، لأنها قوية نوعا ما، وإنعاش بدلا بسهولة. ومع ذلك، والحفاظ على الأسماك وقتا طويلا في التخدير سوف يضعف الانتعاش أو قصيرة جدا سوف تسبب لهم لاحياء خلال الحقن. لذلك، ينبغي للمرء أن رزين فقط عدد اليرقة يمكن للمرء أن تضخ في غضون فترة 4 دقائق.
واحد الحد من هذا الأسلوب الحالي هو أن morpholino لا يستهدف وظيفة الجين في الأنسجةبطريقة محددة. يمكن تعديلين مختلفة توفر خصوصية الأنسجة: واحد التعديل هو استخدام morpholinos في قفص. بعد التنشيط بواسطة ضوء الليزر من المجهر متحد البؤر، وهذه الجينات morpholinos تمنع الهدف، ويمكن التعرض متحد البؤر توقيت ذلك توفير التحكم الزماني والمكاني للنشاط morpholino. وقد استخدمت morpholinos قفص لاستهداف الجينات خلال التنمية في وقت مبكر بعد الحقن في الجنين خلية واحدة. بينما التسليم في مرحلة وحيدة الخلية يمكن أن تعمل لاستهداف جينات خلال مرحلة التطور الجنيني، فإن تركيز morpholino المرجح أن تكون منخفضة جدا في مراحل اليرقات في وقت لاحق نظرا لعدد من الانقسامات الخلوية المتتالية كما تقدم التنمية إلى مرحلة اليرقات 13. كمية morpholino يمكن للمرء أن تضخ في مرحلة خلية واحدة يقتصر أيضا سمية 13-15. والتعديل الثاني هو ممكن لحقن morpholino مباشرة في الجهاز أو الأنسجة لدراستها عند حجم والتصوير سماح. اليرقة الزرد شفافة، لذلك موس مشاهدةر الأعضاء الداخلية بعد أن تكون قد وضعت لا ينبغي أن يكون مشكلة. وmorpholinos الموسومة فلوريسئين العمل مع هذا البروتوكول؛ وبالتالي، مضان يمكن استخدامها لتتبع توزيع وتوطين الأنسجة محددة من morpholino. إدماج morpholino فلوريسئين الموسومة إلى خلايا الأنسجة يتطلب وجود كاشف إندو بورتر، لذلك التعديل سيكون آخر للحد من التوزيع المكاني للكاشف إندو بورتر عن طريق حقن كميات أقل في ذلك مباشرة في الأنسجة المستهدفة. وبالتالي، يجب أن يكون القرار المكانية ممكن مع هذه التقنية.
هناك طرق من overexpression المعدلة وراثيا والتي تنص على مراقبة الزمنية والمكانية للخارجية التعبير الجيني من خلال الجمع بين المروجين الأنسجة محددة مع حرارة صدمة أو المروجين-تاموكسيفين محرض والتي تمكن من تحليل وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطوير أو في أنسجة معينة باستخدام الأنسجة المروجين محددة 16-19. ويشمل هذا transgeالتعبير شركة الاستثمارات الوطنية من ثوابت المهيمنة سلبية تهدف إلى خلق المنتجات التي يمكن أن تكومبيتي الجين الذاتية. هذه الاستراتيجية ضربة قاضية هو عرضة للتأثيرات خارج الهدف عندما تنتج التحوير مستويات التعبير غير المتناسب للمنتج المعدلة وراثيا التي تستحوذ على مكاسب من وظيفة الآثار 20 أو عندما تندمج الجينات ويعطل وظيفة الجين الذاتية 21، 22. بينما morpholinos يمكن أن يولد أيضا خارج الهدف آثار، يمكن للمرء التحكم أكثر سهولة والحد من هذه الآثار باستخدام morpholinos مراقبة عدم تطابق مع تسلسل الهدف مماثلة ولكن تغير قليلا أن لا ربط مرنا المستهدفة، باستخدام morpholinos العقاقير المتعددة التي تستهدف سلاسل مختلفة داخل نفس مرنا وعن طريق اختبار تركيزات مختلفة morpholino 13-15. علاوة على ذلك، morpholinos يمكن أن تنتج وتختبر أسرع وأرخص من تصميم، ورفع واختبار مختلف خطوط المعدلة وراثيا المهيمنة سلبية. لذلك، فيحقن traventricular من morpholinos يوفر أداة مفيدة لضربة قاضية الجينات في مراحل لاحقة من التطور، عندما نقل الجينات المهيمنة سلبية غير ممكن. عندما الممكن استراتيجية المعدلة وراثيا المهيمنة على السلبية، حقن morpholino داخل البطيني هو نهج بديل لتأكيد خصوصية التحوير المهيمنة سلبية بإفراط (overexpressed).
فمن المرجح أن تركيزات فعالة بين morpholinos مختلفة سوف تختلف، كما يفعلون عند استخدامها لضربة قاضية الجين خلال مرحلة التطور الجنيني 13، 15. لهذا الجين المستهدف في هذه الدراسة، ونحن لم نلاحظ تأثير على تجديد بجرعات أقل من 3.5 ملم، ولم تراع آثار غير محددة في عدم تطابق مع هذا يتحكم تركيز morpholino.
حقن داخل البطيني يسمح لتوزيع جزيئات صغيرة لتقييم نشاط وفعالية في نظام الحيوان كله في الوقت الحقيقي عندما فعالية محدودة بسبب penetتقنين عن طريق الجلد أو الجهاز الهضمي أو عن طريق مبالغ مجمع المتاحة. كما يسمح استهداف الأنسجة عندما لا يمكن استهداف عن طريق الحقن المباشر، كما هو الحال بالنسبة لfinfold. هذه الطريقة لا توفر ليس فقط أداة لدراسة وظيفة الجين خلال تجديد الزعانف في مراحل اليرقات. منذ morpholino يدمج في finfold اليرقات تضم خلايا اللحمة المتوسطة والبشرة، قد توفر أيضا تقنية مناسبة للتحقيق في دور الجينات التي تلعب دورا في عملية التئام الجروح أو حدوث سرطان الجلد. ويمكن أيضا أن تطبق على حقن morpholino جنبا إلى جنب مع إندو بورتر لاستهداف أعضاء أو أنسجة في الزرد الكبار، والتي هي قابلة للجراحة وخطوط الزرد الكبار شفافة متوفرة. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة لا يقتصر على الزرد؛ التشتت عن طريق الحقن داخل البطيني يمكن استخدامها على نماذج الفقاريات الأخرى كذلك، وخاصة تلك النماذج التي لا تزال تفتقر إلى وسائل فعالة الجينات المتنحيةمثل الضفدع، قنفذ البحر ونيوت، والتي هي أيضا نماذج هامة للدراسات التجدد.
وبالتالي، حقن داخل البطيني في الزرد يوفر القدرة على السيطرة مؤقتا التعبير الجيني مع بروتوكول السريع نسبيا لاستهداف أنسجة متعددة، وبراعة هذا الأسلوب يسمح للاستخدام مع خطوط المعدلة وراثيا الزرد فضلا عن غيرها من الكائنات التي تفتقر نقل الجينات الوظيفية أو استراتيجيات خروج المغلوب الجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، ونحن نود أن نشكر أييلي تسيديكي Taddese للدعم التقني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
