Omvendt Genetisk Morpholino tilnærming ved hjelp av Cardiac Ventrikulær Injection å transfektere Flere Vanskelig-til-målet vev i sebrafisk Larva

Summary

En tilpasningsdyktig omvendt genetisk metode for sebrafisk for å vurdere gen-funksjon under senere stadier av utvikling og fysiologiske homeostase som vev regenerering bruke intraventrikulære injeksjoner av gen-spesifikke Morpholinos.

Abstract

Sebrafisk er en viktig modell for å forstå celle-og molekylærbiologi av orgel og vedheng regenerering. Men molekylære strategier for å ansette revers genetikk ennå ikke er tilstrekkelig utviklet for å vurdere gen-funksjon i regenerering eller vev homeostase under larvestadier etter sebrafisk embryogenese, og flere vev i sebrafisk larve er vanskelig å målrette. Intraventrikulære injeksjoner av gen-spesifikke Morpholinos tilbyr en alternativ metode for den aktuelle manglende evne til å genomically målrette sebrafisk gener i en tidsmessig styrt måte på disse stadier. Denne metode tillater fullstendig dispersjon og etterfølgende inkorporering av morpholino i forskjellige vev i hele kroppen, inkludert strukturer som tidligere var umulig å nå for eksempel de som er i larvehalefinnen, en struktur som ofte brukes for å undersøke ikke-invasivt regenerering av vev. Flere gener aktiveres under larve finfold regenerering blir også present ved regenerering av voksen virveldyr vev, slik at larven er en nyttig modell for å forstå regenerering hos voksne. Dette morfolinogruppe spredning metoden gir mulighet for rask og enkel identifisering av gener som kreves for regenerering av larve vev samt andre fysiologiske fenomener som regulerer vev homeostase etter embryogenesis. Derfor gir denne leveringsmetoden en dag nødvendig strategi for temporal kontroll til evalueringen av gen-funksjon etter embryogenesis.

Introduction

Regenerering av organer og lemmer er fundamentalt viktig for overlevelse og kondisjon; Imidlertid har flere virveldyr inkludert mennesket begrenset regenerative egenskaper. Mens flere dyremodeller eksisterer som har omfattende evne til reproduksjon, reversere genetiske teknikker for å vurdere gen-funksjon under orgel og vedheng regenerering er fortsatt svært begrenset eller ikke-eksisterende. Derfor er nye tilnærminger er nødvendig for å dissekere molekylærbiologi av regenerering i disse modellorganismer.

Sebrafisk er en godt etablert modell for å forstå cellen og molekylærbiologi av orgel og vedheng regenerering ^en, ikke bare på grunn av sin betydelige evne til å regenerere flere organer, vev og vedheng, men også fordi flere transgene fiskelinjer eksisterer for å spore celler og til økt ekspresjon av genet konstruerer ^{to, tre.} Det er imidlertid gene-hemming i larvesebrafisk hovedsakelig begrenset til overexpression av dominerende-negative konstruksjoner, som ikke er tilgjengelig for alle gener av interesse eller hvis transgenet produktet kan erverve gevinst-av-funksjon effekter som ikke gjenspeiler den endogene aktiviteten til genet. Således, er en alternativ metode til å spesifikt å fjerne gen-ekspresjon ved utstansing eller knockdown som trengs for å overkomme disse problemene.

Gene-spesifikk målgruppe ved hjelp Talens eksisterer som en omvendt genetiske midler til knockout gen-funksjon; Dette er imidlertid knockout strategi svært ofte begrenset til funksjonelle vurderinger under tidlig embryogenese, fordi innledende krav genet forhindre ytterligere progresjon av embryonal utvikling. Dermed studere senere fenomener som regenerering eller organ homeostase etter utvikling ved hjelp Talens er utelukket ^{fire, fem.} Derfor er en alternativ genet fjerning strategi nødvendig som er rettet mot gen-funksjon etter tidlig utvikling for å vurdere genet krav i fullt dannet organer og strukturer. Morfolino injeksjon har vist seg å være effektiv i målretting gener i noen få voksen organer og den voksne regenererende finnen ^6-8, men disse fremgangsmåter krever elektroporering og mange indre organer er vanskelige å electroporate enten på grunn av deres plassering eller på grunn av deres følsomhet for elektriske avbrudd. Videre har en del vev i larven er vanskelige å injisere direkte, fordi direkte injeksjon kan forstyrre deres strukturelle integritet eller på grunn av sin størrelse er begrensende. Den halefinnen av larven er en slik struktur, for direkte injeksjon inn i finfold er ikke mulig. Det ble således oppnådd et alternativ til elektroporering og direkte injeksjon er nødvendig for å målrette gener i vev som enten er for små til å injisere eller ikke kan electroporated.

For å målrette og inhibere funksjonen av spesifikke gener i løpet av regenereringen av larvehalefinnen, har vi modifiserte eksisterende morfolino teknologier tillater enssessment av gen-funksjon under halefinnen regenerering i sen-iscenesatt larve. Denne metoden benytter intraventrikulært levering ⁹ av fluoriscerende-merket Morpholinos sammen med Endo-Porter transfeksjon reagens ^10. En gang i ventrikkelen, sprer morfolino-Endo-Porter blandingen raskt gjennom larven via blodkar og går inn vev som tidligere har vært umulig å målrette. Denne injeksjonsmetoden kan modifiseres for å målrette gener i spesifikke vev, og muligens kan anvendes i andre dyremodeller som i dag mangler reverse genetiske metoder for å hemme genfunksjon. Dermed tilbyr en rask og enkel metode med potensial for bredt spekter bruk til umiddelbart studere gen-funksjon under generell organ homeostase og regenerering på larvestadiet.

Protocol

1.. Fremstilling av glasset nåler (figur 1)

1. Bruk glasskapillærer med en 0,75 mm diameter for å forberede injeksjonsnåler (Figur 1a).
2. Plasser glass kapillær inn en nål avtrekker og trekk nålen med følgende parameter: oppvarming syklus verdi: 463; trekke syklus verdi: 230; hastighet: 150 ms; tid: 150 msek (Figur 1b).
3. Bryt trukket glass kapillær med urmaker pinsett for å produsere en 20 mikrometer i diameter nål under et stereoskop med en mikrometer okular.
4. Bruk en dreiebenk med en fuktet gummi rokk å skjerpe nålen og produsere en 20 mikrometer skrå (Tall 1C og 1D). Merk: Sharp, skrå nåler forbedre enkel innsetting i ventrikkel og dermed minimalisere skade på vev og tillate den perforerte muskelen til å forsegle etter fjerning av kanylen (figurene 1E-G).

2. FORBEREDELSERasjon av Morpholino Solution

1. Klargjør morpholino lager ved å oppløse det lyofiliserte morpholino i 1x fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) til en endelig konsentrasjon på 7,5 mM. [Se produsentens instruksjoner for detaljer (Materialer tabell)].
2. Klargjør morpholino injeksjonsoppløsningen ved å blande 2,5 mL morfolino stamløsning (7,5 mM) med 2,8 mL Endo-Porter-stamoppløsning (1 mM) (se Materialer tabell) i en sluttkonsentrasjon på 3,5 mM og 0,5 mM morfolino Endo-Porter.

Tre. Klargjøring av Morpholino Injection (figur 2)

1. Legg den skrå glass nål med 5 mL av denne løsningen ved hjelp av en mikropipette med en 10 mL microloader pipettespissen.
2. Sett glasset nål inn i nålholderen av mikromanipulator som er koblet til den pneumatiske pico pumpe (figurene 2A-C).
3. Plasser nålholderen ved siden av mikroskopet, slik at nålen kun behovå bli flyttet i ett plan retning for å sette det inn i hjerte ventrikkel i larve (Figur 2A).
4. Juster vinkelen for injeksjoner på rundt 45 °.
5. Sett microinjector verdier som følger: hold press: 20 pounds per kvadrattomme (psi); utstøting trykk: 15 psi; 100 msek spekter av gating, periode verdi på 1,9 (tilsvarer 10,9 msek).
6. Smelte agarose i 1 x PBS ved hjelp av en standard mikrobølgeovn for å produsere 20 ml av en 1,5% (w / v) gel. Hell smeltet gel inn i en 10 cm petriskål. Plasser en rillet injeksjon form i den varme agarose, slik at når herdet, vil agarose ha furer hvori bedøvet larven vil bli plassert ¹¹ (figurene 2D og 2E).

4.. Injeksjoner (Figur 3)

1. Anesthetize larve i 100 ml av akvariet vann med 20 mg / L Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoat-methansulfonat) før de slutter å reagere på berøring.
2. Bruk en plast Pasteur pipette å nøye overføre bedøvet larve inn i et spor i den våte agarose formen, slik at den ventrale side er vendt mot den vertikale agarose veggen av sporet (figur 3A).
3. Plasser agarose plate under stereomikroskopet slik at ventrikkelen vender bort fra injeksjonsnålen (figur 3A).
4. Senk nålen for å sette det inn i hjertet ventrikkel. Sett nålen bare 1-2 mikrometer i ventrikkelen tar seg ikke å sette nålen for dypt (Tall 3B og 3C).
5. Når nålen er satt inn, injisere morpholino løsningen inn i ventrikkelen med 4-6 pulser, som hver leverer tre nl av løsningen, med ventet intervaller for å tillate rensing av hjertet (figurene 3D og 3E).
6. Etter injeksjon, fjernes kanylen (parallelt med planet for innsetting) og deretter forsiktig overføre larven ved hjelp av en Pasteur-pipette av plast fylt med E3 bac mediumk inn i en petriskål inneholdende fersk E3 medium.
7. Plasser nålen inn i en petriskål inneholdende 1 x PBS for å hindre uttørking av nålen ved overføring av den injiserte larve.
8. Gjenta trinn 04.01 til 04.06 hver 12-24 timer for varigheten av forsøket. Merk: Gjentatte injeksjoner sikrer opptak og vedlikehold av morpholino i celler.

5. Analyser av injeksjoner (figur 4)

1. Anesthetize fisken i 100 ml av akvariet vann med 20 mg / L Tricaine før de slutter å reagere på berøring.
2. Plasser larve sideveis på en flat våt 1,5% (w / v) agarose-plate dekket med E3 medium.
3. Bilde larver ved hjelp av en stereo med lysfelt og fluorescens bildebehandling. Merk: Ettersom larvene er gjennomsiktige, bør fluorescein-merket morpholino være synlig som fluorescerende grønne i blodårene i hele dyret rett etter injeksjon. Dette fluorescens vil ytterligere spre inn i vascularized vev ved15 min (figurene 4A-4C).

6. Vurdering av regenerativ utvekst

1. Vurdere bildene ved hjelp av Fiji Bilde J fri programvare (http://fiji.sc/Fiji). For å undersøke regenerering Bruk linje-sporing verktøyet for å bestemme mengden av regenerativ veksten som har skjedd på kontroll og morfolino-injisert larve.
2. For å kalibrere bilder åpner en av de opprinnelige bildefilene i Fiji ved å dra og slippe filen inn i hoved Fiji vinduet.
3. Hvis du vil angi skalaen for alle følgende bilder, gå til "Analyze" i hovedmenyen.
4. I rullegardinmenyen, klikk på "Set skala".
5. I dette vinduet, skru på "Global" alternativet ved å klikke i boksen.
6. Nå åpner bildet for å måle mengden av regenerativ vekst igjen ved å dra og slipp (se trinn 6.1).
7. Velg "frihånd valg"-verktøyet på verktøylinjen.
8. Omslutte det område som skal måles (Figurer 4J-4L).
9. Trykk Ctrl + M. Dette vil åpne et nytt "Resultater" vindu som viser verdien av det innsirklede område i hakepunkter.

Representative Results

Den skarpe, avfaset injeksjonsnål er lett plasseres i den kardiale ventrikkel av sebrafisk larve når nærmet dorsalt (figur 3A). Hjertet fortsetter å pumpe, og blodstrømmen opprettholdes til tross for tilstedeværelsen av nålen (figurene 3B og 3C). Grundige injeksjoner ikke forstyrre morfologi av ventrikkel-eller kardiale kontraksjoner (figur 3D) til tross for injeksjon av morpholino inn i hjertet (figur 3E).

I løpet av minutter, fordeler morfolino-Endo-Porter-løsning i hele kroppen via vaskulaturen (figurene 4A og 4B). Den morfolino blir så fordelt fra vaskulaturen inn i forskjellige vev som finfold og hjernen i minst 12 timer eller mer, som observert fra fluorescens (figur 4C).

I denne tilnærmingen, fjerner vi den distale tuppen av the finfold, den distale tuppen av ryggmargen, distal trunk muskel, den distale notochord og pigmentceller (Tall 4D og 4H); som alle er vanskelige å spesifikt mål ved direkte injeksjon på grunn av kompakthet (muskel), liten størrelse (ryggmarg og ryggstreng) og tynne (finfold), men ser ut til å innlemme morpholino etter at serie-ventrikulær injeksjon, som er sett ved fluorescens i løpet av disse vev (figur 4E) sammenlignet med uninjected dyr (Tall 4F og 4G). Således, denne metoden fremmer relativt lett levering av morpholino til vev som er vanskelige å individuelt målrette, og den tillater vurdering av gen-funksjon i flere vev i regenererende finnen på en gang. For å vurdere betydningen av spesifikke gener involvert i gjenfødelse, en kirurgisk delvis amputerer larve halefinnen (figur 4H), resecting alle vev som har som omfatt pyntet den morpholino (Figur 4I). Larve finfold regenererer sin struktur i løpet av få dager etter amputasjon (NTB-DPA) (figur 4J). Morfolinogruppe målretting   et gen som er nødvendig for regenerering (upubliserte data) resulterer i en perturbert regenerering respons (fig. 4K), sammenlignet med uninjected (fig. 4J) og mismatch morfolino-kontroller (figur 4L). Den totale effekten av disse morfolino eksperimenter på regenerativ utvekst kan måles ved hjelp av standard morfometriske verktøy i de offentlig tilgjengelige Fiji programmer ¹² ved å spore de regenererte vev og sammenligne områder (Tall 4J-4L). Således gir denne gene-målrettingsmetode en rask og relativt enkel analyse for å teste betydningen av gener i regenereringsprosessen.

5fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Utarbeidelse av glass capillary nåler for injeksjon. A) Glass kapillarrør før trekke (over) og trakk nål (nedenfor). B) Needle trekke apparat. C) Dreiebenk for beveling og skjerpe glass nål. Nålen er sett gjennom kikkerten. D) Den dreiebenk er en fuktet gummi roterende plate. Nålen er langsomt senkes ned på platen. E) skjerpet Nålen må ha en kort skråkant som ikke er lenger (20 mm) enn det som er bred (20 mikrometer) for å minimalisere den plassen som trengs for å sette inn hele enden av nålen inn i larvehjerte ventrikkel. F) høyere forstørrelse som viser spissen på nålen. G) Skjematisk oversikt over nålespissen som viser formen på skrå etter sliping.

s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Injeksjonsapparat satt opp. A) Komplett apparat for injeksjon av morpholino inn sebrafisk larve. B) Stand til å styre plasseringen av nålen i løpet av injeksjonene. C) Den pico pumpe som regulerer pneumatisk trykk til injeksjon. D) Form trykk benyttes for å lage agarose formen. E) Agarose mugg som brukes til å stabilisere larve for injeksjon.

Figur 3.. Injeksjon av fiskelarve. A) plassering av nålen i forhold til sebrafisk larve. B) Innsetting i hjerte ventrikkel. C) Fluorescens av morpholino i nålen, men fraværende i ventrikkelen før Injection. D) Lysfelt bilde viser størrelsen forholdet mellom glassålen og larve ventrikkel. E) Injeksjon av fluorescerende morpholino inn i hjertet ventrikkel. Scale barer lik 100 mikrometer.

Figur 4. Spredning av morpholino hele fisk. A) sebrafisk 3 dagers gammel larve. B) Fluorescens av fluorescein-merket morpholino i hele kroppen vaskulaturen (v) 5 min etter ventrikulær injeksjon. C) Dispersjon av morpholino hele dyret inkludert finfold (ff), hjerne (b) i eldre larve etter injeksjoner av morpholino hver 12 timers D) vev i larvehalefinnen og bagasjerommet:.. notochord (n), ryggmarg (sc), pigment (p), og finfold (ff) E) Spredt morpholinoflere minutter etter injeksjon i larve trunk vev inkludert finfold. F) Lysfelt bilde av uninjected larvebagasjerommet og halefinnen. Stiplet linje angir den potensielle amputasjon flyet. G) uninjected fin avbildes med GFP filter som viser autofluorescence i grønt (pilspisser). Dendrittiske form av fluorescerende strukturer antyder at disse er pigmentceller. H) Lysfelt bilde av et kirurgisk amputert larvehalefinnen gjennom ryggstreng, muskel og ryggmargen. Jeg) Fluorescent bilde som viser fordelingen morpholino i stubbe vev. Morfolinogruppe innlemmelse i muskler, ryggmarg, ryggstreng og finfold. J) regenerert caudal finfold strukturer av vill-type larve. Svart linje sporer de regenererte vev for kvantifisering analyse. K) Morpholino-mediert hemming av regenerering. Svart linje tracing viser tydelig redusert regenerering reutvikling som svar etter morpholino knockdown. L) regenerert caudal finfold av larve injisert med en mismatch kontroll morfolinogruppe viser en tilsvarende regenerering respons som i uninjected larve (J). Scale barer lik 100 mikrometer.

Discussion

Den intraventrikulært injeksjon gir en rask og pålitelig vurderingsmetode for testing gen-funksjon på senere stadier av utvikling eller kropps homeostase uten å påvirke genet funksjon under embryogenesis. For å sikre suksess for denne teknikken, bør man være oppmerksom på fire kritiske punkter: 1) p, 2) uttørking av nålen, 3) redusere volumet, og 4) minimal eksponering tid i sedasjon løsning. Nåler som er for liten vil tette ofte, mens nåler som er for store vil skade ventrikkel og føre til overdreven blødning. Selv om 20 mikrometer anbefales, hvis nålen ikke være mer enn en femtedel av størrelsen på ventrikulær kammeret. Et annet kritisk punkt er å holde nålen tørker ut og tilstopping. Den lille størrelsen på nålen og den uunngåelige hyppige pauser for å sedate, overføring og posisjon larven kan gi nok tid til å la morpholino på nålespissen å tørke ut og tette nålen. For å hindredette, kan man fordype nålen i en petriskål med 1x PBS. Et tredje kritisk punkt er å minimere oppblåsthet av ventrikkelen ved for høy for en volum. Hvis doseringen er begrenset av størrelsen av nålen, og deretter øke antall injeksjoner er alltid å foretrekke å øke volumet: større mengder kan føre til strekk skade på hjertet. En fjerde kritiske punkt er graden av sedasjon. Den sedasjon tiden er basert på lengden av tiden som er nødvendig for fremgangsmåten. Larver kan forbli i sedasjon løsning og forbli bedøvet i flere minutter, fordi de er ganske robust og gjenopplive ganske enkelt. Imidlertid vil opprettholde fisken for lenge i narkose svekke dens utvinning eller for kort vil føre dem til å gjenopplive under injeksjonen. Derfor bør man bedøve bare antallet larve at man kan sprøyte i løpet av en 4 minutters periode.

En begrensning av denne aktuelle metode er at morpholino ikke er målrettet gen-funksjon i et vev-Spesifikk måte. To forskjellige modifikasjoner kan gi vevsspesifisering: En modifisering er å bruke bur Morpholinos. Etter aktivering av laserlys fra en konfokalmikroskop, disse Morpholinos hemme deres genet mål, kan så tidsbestemt confocal eksponering gi temporal og romlig kontroll til morfolinogruppe aktivitet. Bur Morpholinos har blitt brukt til å målrette gener under tidlig utvikling etter injeksjon inn i en celle-embryo. Mens arrangementet ved encellede stadium kan arbeide for å målrette gener under embryogenese, vil konsentrasjonen av morpholino sannsynligvis være for lav på senere larvestadier på grunn av antallet av suksessive celledelinger som utviklingen skrider frem til larvestadiet ^13.. Mengden morfolino kan man injisere i den en-celle-stadiet er også begrenset av toksisitet ^13-15. En annen mulig modifikasjon er å direkte injisere en morfolino inn i det organ eller vev som skal undersøkes når størrelsen og tillater avbildning. Sebrafisk larven er gjennomsiktig, så sett på MOSt indre organer etter at de har utviklet bør ikke være et problem. De fluoriscerende-merket Morpholinos jobbe med denne protokollen; derfor kan fluorescens benyttes til å spore fordeling og vev-spesifikk lokalisering av morpholino. Inkorporering av fluorescein-merket morpholino i vevsceller krever tilstedeværelse av Endo-Porter-reagens, slik at en annen modifikasjon vil være å begrense den romlige fordeling av de endo-Porter-reagens ved å injisere det ved lavere mengder direkte inn i målvevet. Således bør romlig oppløsning være mulig med denne teknikken.

Det er transgene høyekspresjonsystemer metoder som gir for temporal og spatial kontroll av eksogent gen-ekspresjon ved å kombinere vevsspesifikke promotorer med varmesjokk eller tamoxifen-induserbare promotorer som muliggjør analyse av gen-funksjon på senere stadier av utviklingen eller i visse vev ved å bruke vev spesifikke arrangører ^16-19. Dette inkluderer transgenic uttrykk for dominerende-negative konstruksjoner utformet for å skape et produkt som kan utkonkurrere den endogene genet. Dette knockdown strategi er utsatt for off-target effekter når et transgen produserer uforholdsmessig uttrykk nivåer av en transgen produkt som erverver gevinst-av-funksjon effekter ²⁰ eller når det integreres i et gen og forstyrrer genets endogene funksjon ^{21, 22.} Mens Morpholinos kan også generere off-target effekter, kan man lettere kontrollere og begrense disse effektene ved å bruke mismatch kontroll Morpholinos med lignende, men ubetydelig endrede mål sekvenser som ikke binde målet mRNA, ved hjelp av flere antisens Morpholinos som er rettet mot ulike sekvenser innenfor samme mRNA og ved å teste ulike morfolino konsentrasjoner ^13-15. Videre kan Morpholinos bli produsert og testet mye raskere og billigere enn å utforme, å heve og testing av forskjellige dominant-negative transgene linjer. Derfor, itraventricular injeksjon av Morpholinos gir et nyttig verktøy for å knockdown gener på senere stadier i utviklingen, når dominant-negative transgenesis er ikke mulig. Når en dominant-negativ transgen strategi er mulig, er morfolino intraventrikulær injeksjon en alternativ tilnærming for å bekrefte spesifisiteten av overuttrykt dominant-negative transgenet.

Det er sannsynlig at effektive konsentrasjoner mellom ulike Morpholinos vil variere, slik de gjør når du bruker dem for genet knockdown under embryogenese ^{13, 15.} For genet målrettet i denne studien, gjorde vi ikke observere en effekt på foryngelse ved doser lavere enn 3,5 mm, og uspesifikke effekter ble ikke observert i mismatch styrer med dette morfolinogruppe konsentrasjon.

Intraventrikulær injeksjon gir mulighet for fordeling av små molekyler for å vurdere aktivitet og effekt på en helt animalsk system i sann tid hvor effekten er begrenset av gjennombruttrasjon gjennom huden eller i fordøyelsessystemet, eller ved mengden av forbindelsen som er tilgjengelige. Den tillater også målretting av vev når de ikke kan være målrettet ved direkte injeksjoner, slik tilfellet er for finfold. Denne metoden gir ikke bare et verktøy for å studere gen-funksjon under fin regenerering på larvestadiet. Siden morpholino integreres i larve finfold bestående mesenchymale celler og epidermis, kan det også gi en egnet teknikk for å undersøke rollen til gener som spiller en del i prosessen med sårheling eller forekomst av hudkreft. Injeksjon av morpholino sammen med Endo-Porter kan også brukes til å målrette organer eller vev i voksen sebrafisk, som er mottagelig for kirurgi og gjennomskinnelig voksen sebrafisk linjer er tilgjengelige. Videre er denne metoden ikke begrenset til sebrafisk; dispersjon av intraventrikulær injeksjon kan brukes på andre virveldyr modeller også, spesielt de modeller som mangler fortsatt effektive recessivt gen metoderslik som Xenopus, Axolotl og salamander, som også er viktige modeller for regenerering studier.

Således, intraventrikulær injeksjon i sebrafisk gir mulighet til å styre tidsmessig genekspresjon med en relativt rask protokoll for å målrette flere vev, og allsidigheten av metoden gjør det mulig for sitt bruk med sebrafisk transgene linjer samt for andre organismer som mangler funksjonell transgenesis eller genet knockout strategier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections