Summary
Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.
Abstract
De zebravis is een belangrijk model voor de cel-en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie begrijpen. Echter, moleculaire strategieën reverse genetics dienst nog niet voldoende ontwikkeld om genfunctie in regeneratie of weefsel homeostase in larvale stadia na de zebravis embryogenese beoordelen en verscheidene weefsels in het zebravis larven zijn moeilijk te richten. Intraventriculaire injectie van genspecifieke morfolino een alternatieve werkwijze voor de huidige onmogelijkheid om genomisch doel zebravis genen in een tijdelijk geregelde wijze naar deze fasen. Deze methode zorgt voor volledige dispersie en daaropvolgende verwerking van de morfolino in verschillende weefsels in het lichaam, waaronder structuren die voorheen onmogelijk te bereiken als die in de larvale staartvin een structuur vaak gebruikt om niet-invasief onderzoek weefselregeneratie waren. Verschillende genen tijdens de larvale finfold regeneratie geactiveerd worden ook presentatiet in regenererende volwassen gewervelde weefsels, zodat de larve is een bruikbaar model voor regeneratie begrijpen bij volwassenen. Deze morfolino dispersie methode maakt een snelle en gemakkelijke identificatie van genen die vereist zijn voor de regeneratie van larvale weefsels en andere fysiologische verschijnselen reguleren weefsel homeostase na embryogenese. Daarom deze levering methode een nog nodig strategie voor tijdelijke controle van de evaluatie van genfunctie na embryogenese.
Introduction
Regeneratie van organen en appendages is van fundamenteel belang voor de overleving en fitness; hebben echter een aantal gewervelde dieren, inclusief de mens regeneratieve vermogens beperkt. Terwijl verschillende diermodellen bestaan die uitgebreide regeneratieve capaciteit hebben, omgekeerde genetische technieken om gen-functie te beoordelen tijdens orgel en aanhangsel regeneratie blijven zeer beperkt of niet aanwezig. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig om de moleculaire biologie van regeneratie ontleden in deze modelorganismen.
De zebravis is een goed uitgewerkt model voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie 1, niet alleen vanwege de belangrijke mogelijkheid om meerdere organen, weefsels en appendages regenereren, maar ook omdat een aantal transgene vis lijnen bestaan om cellen te volgen en Gene overexpressie constructen 2, 3. Echter remming gen larvale zebravis grotendeels beperkt tot de overexpression van dominant-negatieve constructen, die niet voor alle genen van belang of waarvan transgen product gain-of-function effecten die niet weergeven endogene activiteit van het gen te verwerven. Aldus wordt een alternatieve methode om specifiek verwijderen genexpressie door knockout of knockdown nodig om deze problemen te overwinnen.
Gen-specifieke sturing met TALENS bestaat als een reverse genetische middel om genfunctie knockout; Maar dit knockout strategie is zeer vaak beperkt tot functionele evaluaties tijdens vroege embryogenese omdat basisvereisten van het gen voorkomen verdere progressie van de embryonale ontwikkeling. Zo bestuderen later verschijnselen zoals regeneratie of orgaan homeostase na ontwikkeling met behulp van TALENS uitgesloten 4, 5. Daarom is een alternatieve strategie voor de verwijdering gen nodig die genfunctie richt na de vroege ontwikkeling gen eisen volledig gevormd organen en structuren beoordelen. Morfolino injectie is effectief gebleken in het richten genen in een aantal volwassen organen en de volwassen regenereren vin 6-8 zijn, maar deze methoden elektroporatie en vele interne organen zijn moeilijk te electroporate hetzij als gevolg van hun locatie of vanwege hun gevoeligheid voor elektrische verstoring. Bovendien zijn sommige weefsels in de larve zijn moeilijk direct te injecteren, omdat directe injectie de structurele integriteit kan verstoren of omdat hun omvang is beperkt. De staartvin van de larve is een dergelijke structuur, omdat directe injectie in de finfold niet mogelijk. Dus een alternatief voor elektroporatie en directe injectie noodzakelijk om genen te richten in weefsels die ofwel te klein om te injecteren of kan niet worden geëlektroporeerd.
Om richten en remmen de functie van specifieke genen tijdens de regeneratie van de larvale staartvin, hebben wij bestaande technologieën morfolino gemodificeerd zodat het eenEOORDELING van gen-functie tijdens staartvin regeneratie in late-geënsceneerde larve. Deze methode maakt gebruik van intraventriculaire aflevering 9 van fluoresceïne-gelabeld morpholinos samen met Endo-Porter transfectiereagens 10. Eenmaal in het ventrikel, de morfolino-Endo-Porter mengsel verspreidt zich snel gedurende de larve via de vasculatuur en gaat weefsels die voorheen onmogelijk te richten zijn. Deze injectie werkwijze kan worden gemodificeerd om genen te richten op specifieke weefsels en mogelijk kan ook in diermodellen die nog onvoldoende omgekeerde genetische methoden om genfunctie te remmen worden toegepast. Zo, het biedt een snelle en eenvoudige methode met het potentieel voor brede waaier gebruik onmiddellijk te bestuderen gen-functie tijdens algemene orgel homeostase en regeneratie bij larvale stadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Glass Naalden (figuur 1)
- Gebruik glazen capillairen met een 0,75 mm diameter injectienaalden (Figuur 1A) te bereiden.
- Plaats de glazen capillair in een naald trekker en trek de naald met de volgende parameter: verwarming cyclus waarde: 463; trekken cyclus waarde: 230; snelheid: 150 msec; tijd: 150 msec (Figuur 1B).
- Breek het getrokken glas capillair met horlogemaker pincet om een 20 micrometer diameter naald produceren onder een stereoscoop met een micrometer oculair.
- Gebruik een draaibank met een natgemaakte rubber spinnewiel om de naald te scherpen en produceren een 20 urn afschuining (figuren 1C en 1D). Opmerking: Sharp, schuine naalden verbeteren het gemak van inbrengen in de hartkamer en daarmee het minimaliseren van de schade aan het weefsel en laat de geperforeerde spier sluit na verwijdering van de naald (fig. 1E-G).
2. Preparatie van de morfolino oplossing
- Bereid de morfolino voorraad door oplossen van het gelyofiliseerde morfolino in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 7,5 mM. [Zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie (Materialen tabel)].
- Bereid de morfolino injectieoplossing door menging 2,5 ul morfolino voorraadoplossing (7,5 mM) 2,8 pl Endo-Porter voorraadoplossing (1 mM) (zie Materialen tabel) voor een uiteindelijke concentratie van 3,5 mM en 0,5 mM morfolino Endo-Porter.
3. Bereiding van de morfolino injectie (figuur 2)
- Laad de schuine glazen naald met 5 ul van deze oplossing met behulp van een micropipet met een 10 ul microloader pipet tip.
- Plaats de glazen naald in de naald houder van de micromanipulator verbonden met de pneumatische pico pomp (Figuren 2A-C).
- Plaats de naald houder naast de microscoop zodat de naald alleen behoeftenin een vlakke richting te verplaatsen om het in de ventrikel van de larve (Figuur 2A).
- Pas de hoek van de injecties rond de 45 °.
- Stel de microinjector waarden als volgt: hold druk: £ 20 per vierkante inch (psi); uitwerpen druk: 15 psi; 100 msec bereik van gating, periode-waarde van 1,9 (komt overeen met 10,9 msec).
- Smelt agarose in 1x PBS met een standaard magnetron tot 20 ml van een 1,5% (w / v) gel produceren. Giet gesmolten gel in een 10 cm Petrischaal. Plaats een gegroefde injectie vorm in de warme agarose zodat eenmaal verhard, zal de agarose groeven waarin de gesedeerd larve 11 (figuren 2D en 2E) zal worden geplaatst hebben.
4. Injecties (figuur 3)
- Verdoven larve in 100 ml aquarium water met 20 mg / L tricaïne (L-Ethyl-m-amino-benzoaat-methaansulfonaat) tot ze niet meer reageert op aanraking.
- Gebruik een plastic Pasteur pipette om de verdoofd larve voorzichtig over in een groef van de natte agarose mal zodat de buikzijde is gericht tegen de verticale agarose wand van de groef (figuur 3A).
- Plaats de agarose plaat onder de stereomicroscoop zodat het ventrikel niet gericht is op de injectienaald (figuur 3A).
- Zet de naald om te plaatsen in de hartkamer. Steek de naald slechts 1-2 micrometer in het ventrikel het verzorgen van de naald te diep (Figuren 3B en 3C) niet in te voegen.
- Zodra de naald wordt ingebracht, injecteer de morfolino oplossing in het ventrikel met 4-6 pulsen, leveren elk 3 nl van de oplossing, met wachten intervallen tot vereffening van het hart (figuren 3D en 3E) mogelijk te maken.
- Na injectie, verwijder de naald (evenwijdig aan het vlak van insertion) en vervolgens de larve zorgvuldig over te dragen met behulp van een plastic Pasteur pipet gevuld met E3 medium back in een petrischaal met vers medium E3.
- Plaats de naald in een petrischaal met 1x PBS om het drogen van de naald bij het overbrengen van de geïnjecteerde larve voorkomen.
- Herhaal stap 4.1-4.6 elke 12-24 uur gedurende de duur van het experiment. Opmerking: Herhaling van de injecties zorgt de opname en het onderhoud van de morfolino in cellen.
5. Analyses van injecties (figuur 4)
- Verdoven van de vissen in 100 ml aquarium water met 20 mg / L tricaïne totdat ze niet meer reageert op aanraking.
- Plaats de larve lateraal op een vlakke natte 1,5% (w / v) agarose plaat bedekt met E3 medium.
- Afbeelding larven met behulp van een stereomicroscoop met helderveld en fluorescentie beeldvorming. Opmerking: Als de larven transparant dient de fluoresceïne gelabeld morfolino zichtbaar fluorescent groen in het bloedvat door het dier direct na injectie. Deze fluorescentie zal verder verspreiden in de gevasculariseerde weefsels door15 min (Figuren 4A-4C).
6. Beoordeling van Regeneratieve uitgroei
- Beoordelen gemaakte opnamen met behulp van Fiji Afbeelding J vrije software (http://fiji.sc/Fiji). Voor het onderzoeken van de regeneratie, gebruik maken van de lijn tracing tool om het bedrag van regeneratieve groei die heeft plaatsgevonden op de controle en-morfolino geïnjecteerd larve bepalen.
- Om afbeeldingen te kalibreren, opent een van de originele beeldbestanden in Fiji door te slepen en het bestand in de belangrijkste Fiji venster.
- Om de schaal voor alle volgende beelden ingesteld, gaat u naar "Analyze" in het hoofdmenu.
- In het drop-down menu, klik op "Set schaal".
- In dit venster, zet de 'Global' optie door te klikken op het vakje.
- Open nu de afbeelding om het bedrag van de regeneratieve groei weer meten met slepen en neerzetten (zie stap 6.1).
- Kies de "vrije hand selecties" tool in de werkbalk.
- Omcirkel het gebied dat moet worden gemeten (Figuren 4J-4L).
- Druk op Ctrl + M. Dit zal een nieuw venster "resultaten" van de waarde van het omcirkelde gebied in vierkante pixels openen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De scherpe, schuine injectienaald wordt gemakkelijk geplaatst in de cardiale ventrikel van de zebravis larve wanneer dorsally benaderd (figuur 3A). Het hart blijft pompen en de bloedstroom wordt gehandhaafd ondanks de aanwezigheid van de naald (Figuren 3B en 3C). Voorzichtig injecties niet de morfologie van de hartkamer of cardiale samentrekkingen (figuur 3D) ondanks de injectie van morfolino naar het hart (Figuur 3E) verstoren.
Binnen minuten, de morfolino-Endo-Porter oplossing verspreidt door het lichaam via het vaatstelsel (Figuren 4A en 4B). De morfolino wordt vervolgens verdeeld door de vasculatuur in verschillende weefsels zoals de hersenen finfold en ten minste 12 uur of meer gezien vanuit de fluorescentie (Figuur 4C).
In deze benadering, verwijderen we de distale tip van the finfold, het distale uiteinde van het ruggenmerg, distale stam spieren, het distale notochord en pigmentcellen (fig. 4D en 4H); die alle moeilijk specifiek te richten door directe injectie vanwege compactheid (spieren), klein formaat (ruggenmerg en notochorda) en dunheid (finfold), maar lijken de morfolino nemen na seriële ventriculaire injecties, die wordt gezien door fluorescentie binnen deze weefsels (figuur 4E) in vergelijking met niet-geïnjecteerde dieren (figuren 4F en 4G). Aldus is deze werkwijze betrekkelijk gemakkelijk bevordert de afgifte van morfolino aan weefsels moeilijk individueel gericht zijn, en maakt de beoordeling van genfunctie in diverse weefsels in de regenererende vin tegelijk. Om het belang van specifieke genen betrokken bij regeneratie beoordelen, een chirurgisch gedeeltelijk amputeert de larvale staartvin (figuur 4H), resectie alle weefsels die zijn incorp orated de morfolino (Figuur 4I). De larvale finfold regenereert de structuur binnen een paar dagen na de amputatie (dpa) (Figuur 4J). Morfolino targeting een gen dat vereist is voor regeneratie (ongepubliceerde gegevens) resulteert in een verstoorde regeneratie respons (Figuur 4K) vergeleken met niet-geïnjecteerde (Figuur 4J) en mismatch morfolino (Afbeelding 4L). Het totale effect van deze morfolino experimenten regeneratieve uitgroei kan gemeten worden met standaard morfometrische hulpmiddelen in de publiekelijk beschikbare Fiji programma 12 door het traceren van de geregenereerde weefsels en vergelijken van de gebieden (Figuren 4J-4L). Aldus Dit gen targeting werkwijze een snelle en relatief eenvoudige test om het belang van genen testen het regeneratieproces.
5fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. Bereiding van glazen capillaire naalden voor injectie. A) Glazen capillair voor het uittrekken (boven) en trok de naald (zie hieronder). B) Naald trekken apparaat. C) Draaibank voor afschuinen en slijpen van de glazen naald. De naald wordt gezien door de verrekijker. D) De draaibank is een natgemaakte rubber draaiende schijf. De naald wordt langzaam neergelaten op de schijf. E) geslepen naald moet een korte schuine rand die niet langer (20 um) dan breed (20 pm) waardoor de ruimte die nodig is om het gehele uiteinde van de naald in de larvale cardiale minimaliseren ventrikel. F) image Hogere vergroting met de punt van de naald. G) Schematische weergave van de naald met de vorm van de schuine kant na het slijpen.
s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2. Injectie inrichting opstelling. A) Volledige uitrusting voor injectie van morfolino in zebravis larven. B) Stand om de plaatsing van de naald regelen tijdens injectie. C) De pico pomp die pneumatische druk voor injecties. D) Vorm druk gebruikt regelt aan agarose mal te maken. E) Agarose mal gebruikt om larven te stabiliseren voor injectie.
Figuur 3. Injectie van vis larve. A) Plaatsing van de naald ten opzichte van de zebravis larven. B) Insertion into ventrikel. C) Fluorescentie van de morfolino in de naald, maar afwezig is in het ventrikel voor injectieop. D) image Helderveld toont de grootte verhouding tussen de glazen naald en het larvale ventrikel. E) Injectie van de fluorescerende morfolino in de hartkamer. Schaalbalken equal 100 urn.
Figuur 4. Spreiding van morfolino hele vis. A) Zebravis 3 dagen oude larven. B) Fluorescentie van fluoresceïne-gelabeld morfolino gehele lichaam vasculatuur (v) 5 minuten na ventriculaire injectie. C) Dispersie van de morfolino door het dierenrijk inclusief finfold (ff), hersenen (b) bij oudere larve na injectie van morfolino elke 12 uur D) weefsels in het larvale staartvin en romp.. notochord (n), ruggenmerg (sc), pigment (p) en finfold (ff) E) Verspreid morfolinoenkele minuten na injectie in larvale kofferbak weefsels waaronder de finfold Brightfield imago van niet-geïnjecteerde larvale romp en staartvin. F). Binnen de stippellijn geeft de aspirant-amputatie vliegtuig. G) uninjected fin afgebeeld met de GFP filter tonen autofluorescence in groen (pijlpunten). De dendritische vorm van de fluorescerende structuren suggereert dat deze zijn pigmentcellen. H) Helderveld beeld van een chirurgisch geamputeerd larvale staartvin door de notochord, spier en het ruggenmerg. I) TL-beeld toont morfolino distributie in de stomp weefsels. Morfolino opname in de spieren, het ruggenmerg, notochord en finfold. J) geregenereerde staart finfold structuren van wild-type larve. Zwarte lijn volgt de geregenereerde weefsels voor kwantificatieanalyse. K) Morfolino-gemedieerde remming van de wedergeboorte. Zwarte lijn tracing komt duidelijk de verminderde regeneratie rerespons na morfolino knockdown. L) geregenereerde staart finfold van larve geïnjecteerd met een mismatch controle morfolino toont een soortgelijke regeneratie respons als in uninjected larve (J). Schaalbalken equal 100 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De intraventriculaire injectie zorgt voor een snelle en betrouwbare beoordeling methode voor het testen van gen-functie in latere stadia van ontwikkeling of van het lichaam homeostase zonder dat de functie van een gen tijdens de embryogenese. Om het succes van deze techniek te waarborgen, moet men zich bewust zijn van de vier kritische punten: 1) met nld, 2) uitdrogen van de naald, 3) een minimaal volume en 4) minimale blootstelling tijd in de sedatie oplossing. Naalden die te klein zijn zal vaak verstoppen, terwijl de naalden die te groot zijn de ventrikel zal beschadigen en overmatig bloeden. Terwijl 20 urn wordt aanbevolen, dient de naald niet meer dan een vijfde van de grootte van de ventriculaire kamer zijn. Een tweede kritisch punt is om de naald uitdroogt en verstopping. De geringe omvang van de naald en de onvermijdelijke frequente pauzes om bezadigde, de overdracht en de positie van de larve kan voldoende tijd om de morfolino bovenaan de naald te drogen en verstoppen de naald bieden. Om te voorkomenHiervoor kan men de naald onder te dompelen in een petrischaal van 1x PBS. Een derde essentiële punt is opgeblazen gevoel van het ventrikel minimaliseren door te hoge volume. Wanneer de dosis wordt beperkt door de grootte van de naald, daarna het verhogen van het aantal injecties altijd beter om verhoging van het volume: grotere hoeveelheden kan rekken schade aan het hart. Een vierde kritisch punt is de mate van sedatie. De sedatie is gebaseerd op de lengte van de tijd die nodig is voor de procedure. Larven kunnen in de sedatie oplossing blijven en blijven verdoofd gedurende enkele minuten, want ze zijn nogal robuust en reanimeren vrij gemakkelijk. Echter, het behoud van de vis te lang in de verdoving zal zijn herstel belemmeren of te kort zal hen doen herleven tijdens de injectie. Daarom moet slechts het aantal larven dat men injecteren binnen 4 minuten periode verdoven.
Een beperking van de huidige methode is dat de morfolino genfunctie niet gericht in een weefsel-Specifieke wijze. Twee verschillende wijzigingen kunnen weefselspecificiteit bieden: Een modificatie is om gekooide morpholinos gebruiken. Na activering door middel van laserlicht van een confocale microscoop, deze morpholinos remmen hun gendoel, kan dus getimede confocale blootstelling temporele en ruimtelijke controle te verstrekken aan morfolino activiteit. Caged morpholinos zijn gebruikt om genen te richten tijdens de vroege ontwikkeling na injectie in de een-cel embryo. Terwijl bezorging eencellige stadium werken om genen te richten tijdens de embryogenese, de concentratie van de morfolino waarschijnlijk te laag zijn in latere larvestadia door het aantal opeenvolgende celdelingen de ontwikkeling vordert het larvale stadium 13. De hoeveelheid morfolino kan injecteren in de een-cel fase wordt ook beperkt door toxiciteit 13-15. Een tweede mogelijke wijziging is direct te injecteren morpholinos in het orgaan of weefsel te bestuderen wanneer de grootte en beeldvorming mogelijk te maken. De zebravis larve is doorzichtig, zodat het bekijken van most inwendige organen nadat zij hebben ontwikkeld moet geen probleem zijn. De fluoresceïne-gelabeld morpholinos werken met dit protocol; Derhalve kan fluorescentie worden gebruikt voor de distributie en weefsel-specifieke lokalisatie van het morfolino volgen. De opname van het fluoresceïne-gelabeld morfolino in weefselcellen vereist de aanwezigheid van de Endo-Porter reagens, zodat andere modificatie zou zijn om de ruimtelijke verdeling van de Endo-Porter reagens beperken door injecteren bij lagere hoeveelheden rechtstreeks in het doelweefsel. Daarom moet ruimtelijke resolutie mogelijk met deze techniek.
Er zijn transgene overexpressie methoden voor temporele en ruimtelijke controle exogene genexpressie combineert weefselspecifieke promoters met hitte-schok of tamoxifen-induceerbare promotors die de analyse van gen-functie kan in latere ontwikkelingsfase of in bepaalde weefsels met tissue specifieke promotors 16-19. Dit omvat de transgenic expressie van dominant-negatieve constructen ontworpen om een product dat het endogene gen kan verdringen maken. Dit knockdown strategie is gevoelig voor off-doeleffecten wanneer een transgen produceert onevenredig expressie van een transgene product dat gain-of-function effecten 20 of verkrijgt wanneer geïntegreerd in een gen en verstoort endogene functie van het gen 21, 22. Terwijl morpholinos ook off-target effecten kan genereren, kan men beter controleren en deze effecten te beperken door gebruik te maken mismatch controle morpholinos met soortgelijke maar iets gewijzigde doelwitsequenties dat niet het doel-mRNA binden, met behulp van meerdere antisense morpholinos dat verschillende sequenties binnen de doelgroep hetzelfde mRNA en testen van verschillende concentraties morfolino 13-15. Bovendien kan morpholinos worden geproduceerd en veel sneller en goedkoper dan het ontwerpen, het verhogen en testen van verschillende dominant-negatieve transgene lijnen getest. Daarom is de intraventricular injectie van morpholinos biedt een nuttig instrument om genen neerhalen in latere stadia van ontwikkeling, toen dominant-negatieve transgenese is niet mogelijk. Wanneer een dominant-negatieve transgene strategie is mogelijk, intraventriculaire morfolinogroep injectie is een alternatieve benadering om de specificiteit van de overexpressie dominant-negatieve transgen bevestigen.
Het is waarschijnlijk dat effectieve concentraties van verschillende morpholinos variëren, zoals wanneer gebruik voor gen knockdown tijdens embryogenese 13, 15. Voor het gen gericht in deze studie, hebben we geen invloed op regeneratie observeren bij doses lager dan 3,5 mm, en niet-specifieke effecten werden niet waargenomen bij mismatch regelt met deze morfolino concentratie.
Intraventriculaire injectie om de verdeling van kleine moleculen activiteit en werkzaamheid bij een geheel dier stelsel niet in real time als werkzaamheid beperkt door penetrantsoen door de huid of spijsvertering of de hoeveelheid verbinding beschikbaar. Ook kan de targeting van weefsels als ze niet kunnen worden gericht door directe injectie, zoals het geval is voor de finfold. Deze methode is niet alleen een hulpmiddel voor bestudering van genfunctie tijdens fin regeneratie bij larvale stadia. Aangezien de morfolino integreert in de larvale finfold omvattende mesenchymale cellen en epidermis, kan het ook een geschikte techniek om de rol van genen die deelnemen aan het proces van wondgenezing of het optreden van huidkanker onderzoeken. De injectie van morfolino met Endo-Porter kan ook worden toegepast op organen of weefsels in volwassen zebravissen, die vatbaar zijn voor chirurgie en doorschijnende volwassen zebravissen lijnen zijn gericht. Bovendien is deze methode niet beperkt tot zebravis; dispersie intraventriculaire injectie kan worden gebruikt op andere gewervelde modellen ook, vooral de modellen die nog steeds geen effectieve recessief gen methodenzoals Xenopus, Axolotl en newt, die ook belangrijk zijn modellen voor regeneratie studies.
Aldus intraventriculaire injectie in de zebravis biedt de mogelijkheid om tijdelijk besturen genexpressie met een relatief snelle protocol meerdere doelweefsels, en de veelzijdigheid van deze werkwijze maakt het gebruik van zebravis transgene lijnen en andere organismen die functionele transgenese of gebrek genknockout strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), willen we Ayele Tsedeke Taddese bedanken voor de technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
