Summary
一个适应性强的反向遗传学方法，斑马鱼在后来的发展和生理平衡，如使用基因特异性吗啉脑室注射组织再生的阶段来评估基因的功能。
Abstract
斑马鱼是了解细胞和器官和附肢再生的分子生物学研究的重要模式。然而，分子的策略采用反向遗传学还没有得到充分的研究，以评估在斑马鱼胚胎发生后幼虫阶段再生或组织稳态的基因功能，而斑马鱼幼体中的多个组织是困难的目标。的基因特异性吗啉脑室注射对当前不能在这些阶段中，以基因组靶基因斑马鱼在时间上控制的方式提供另一种方法。此方法允许完全分散和吗啉代的后续掺入到整个身体的各种组织，包括在以前是不可能达到如那些在幼虫尾鳍，经常用于非侵入性地研究的组织再生的结构的结构。在幼虫finfold再生激活一些基因也PRESEN吨再生成年脊椎动物组织中，所以幼虫是一个有用的模型，以了解再生的成年人。这啉分散法允许快速和容易识别所需的幼虫组织的再生，以及其他生理现象后，胚胎发育调控组织稳态的基因。因此，该发送方法提供了一种目前所需要的策略临时控制到胚胎后，基因功能的评价。
Introduction
器官和附肢再生的生存和健康极其重要;然而，一些脊椎动物包括人类有限的再生能力。虽然一些动物模型中存在有大量的再生能力，反向遗传技术的器官和附肢再生过程中，评估基因的功能仍十分有限或不存在。因此，需要采取新方式来剖析再生的分子生物学在这些模式生物。
斑马鱼是一种行之有效的模式对于了解细胞和器官和附肢再生的，不仅是因为再生多个器官，组织和附属物其显著的能力，而且也为1，分子生物学，因为几个转基因鱼系的存在是为了追踪细胞和以过表达基因构建体2，3。然而，在斑马鱼幼鱼基因抑制主要限于overexpre裂变的显性负性结构，这并不适用于所有感兴趣的基因或转基因，其产物可以获取功能获得的效果是不反映基因的内源活性。因此，另一种方法，通过基因敲除或敲除专门去除基因的表达是需要克服这些问题。
基因特异性使用TALENS存在作为反向遗传学手段敲除基因的功能定位;然而，这淘汰赛策略是非常频繁局限于功能评估在早期胚胎发育，因为基因的初步要求预防胚胎发育的进一步发展。因此，学习后的现象，如使用TALENS发展后再生或器官的动态平衡被排除4，5。因此，另一种基因去除的策略是必要的，早期的发展目标后，基因的功能，以评估完全形成器官和结构基因的要求。 吗啉注射已被证明是有效的靶向基因在几个成年器官和成年再生鳍6-8，但是这些方法都需要电穿孔和许多内部器官都难以电穿孔或者由于它们的位置或由于其电气灵敏度中断。此外，在一些幼虫组织是难以直接注入，由于直接喷射可能会破坏其结构的完整性，或者因为它们的大小被限制。幼虫的尾鳍就是这样的一个结构，因为直接注射到finfold是不可能的。因此，另一种电穿孔和直接注射是需要的靶基因在组织中，要么太小注入或不能被电穿孔。
为了幼虫尾鳍的再生过程中对目标和抑制特定基因的功能，我们已经修改现有啉技术允许一个基因功能的过程中下旬上演幼虫尾鳍再生ssessment。这种方法采用荧光素标记的吗啉脑室交付9用Endo-Porter的转染试剂10在一起。一旦进入心室，吗啉代的Endo-波特混合物迅速传遍整个幼虫通过脉管系统，并进入到先前已不可能对靶组织。这种注射方法可以被修改以靶基因在特定组织和很可能可以在目前缺乏的反向遗传学方法来抑制基因的功能的其他动物模型中被应用。因此，它提供了一个快速简便的方法与范围广泛的使用过程中在幼虫期一般器官平衡和再生，立即研究基因功能的潜力。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1（图1）的玻璃针的下游
- 用玻璃毛细管，直径0.75毫米以制备注射针头（ 图1A）。
- 将玻璃毛细管进针车夫和拉针使用以下参数：加热循环值：463;拉动周期值：230;速度：150毫秒;时间：150毫秒（ 图1B）。
- 打破与制表师用镊子拉玻璃毛细管，产生下用测微目镜一个立体镜20微米直径的针。
- 使用车床用湿润的橡胶纺车，是加强针，并产生一个20微米的伞（ 图1C和1D）。注意：夏普，斜面针改善易于插入到心室，从而最大限度地减少对组织的损害，并允许在穿孔的肌肉切除针（ 图1E-G）之后重新密封。
2。Prepar吗啉溶液的振动性
- 通过溶解在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的冻干的吗啉代，以7.5毫米的最终浓度制备的吗啉代库存。 [参见制造商的说明资料（材料表）]。
- 通过混合2.5微升啉原液（7.5毫摩尔）与2.8微升的Endo-Porter的储备溶液（1毫摩尔）（见材料表）为3.5毫啉和0.5mM的Endo-Porter的终浓度制备的吗啉注射溶液。
3，吗啉注射液的制备（图2）
- 加载斜角玻璃针与5微升该溶液的使用微量用10微升微加载枪头。
- 插入玻璃针插入连接于气动微微泵（ 图2A-C）的微操作的持针器。
- 将针保持器旁边的显微镜，使针只需要在一个平面方向上移动，以将其插入幼虫（ 图2A）的心室。
- 调整角度为注射剂在45°左右。
- 将微量值如下：保压压力：20磅每平方英寸（psi）;喷射压力：15磅;门的100毫秒范围，1.9周期值（对应于10.9毫秒）。
- 使用标准的微波，产生20ml的1.5％（重量/体积）的凝胶在1×PBS中熔化琼脂糖。倒入熔化的凝胶放入一个10cm培养皿。放置槽注入的形式进入温暖的琼脂糖这样一旦硬化，琼脂糖将有沟，其中镇静幼虫将放在11（ 图2D和2E）。
4，注射剂（图3）
- 麻醉幼虫在100毫升水族箱的水与20 mg / L的三卡因（1 - 乙基-M-氨基苯甲酸酯甲磺酸酯），直到他们停止响应触摸。
- 用塑料巴斯德pipett以e为镇静幼虫小心转移到湿琼脂糖模具的凹槽，以使腹侧面朝靠在凹槽（ 图3A）的垂直琼脂糖壁。
- 将琼脂糖板的立体显微镜下，使心室背向注射针（ 图3A）。
- 降低针以将其插入到心脏心室。将针头只有1-2微米入脑室，注意不要插入针太深（ 图3B和3C）。
- 一旦将针插入时，吗啉溶液与4-6个脉冲，每个提供3 NL溶液注入脑室，与等待时间间隔，以允许心脏（ 图3D和3E）的清除。
- 注射后，取出针（平行插入的平面），然后小心地用塑料巴斯德吸管充满E3媒体BAC转幼虫K表到含有新鲜的E3媒体的培养皿。
- 将针头插入含有1x PBS的培养皿中，以防止针的干燥输送所注入的幼虫时。
- 重复步骤4.1-4.6每12-24小时进行的实验的持续时间。注意：重复注射，确保在细胞中的吗啉代基的吸收和维修。
5，注射的分析（图4）
- 在100毫升的水族箱的水与20 mg / L的三卡因麻醉的鱼，直到他们停止响应触摸。
- 将幼虫横向放置在平坦的湿的1.5％（重量/体积）的琼脂糖板覆盖E3介质。
- 使用带有明和荧光成像立体显微镜图像幼虫。注：由于幼虫是透明的，荧光素标记的吗啉代应该是荧光绿色的血管遍布直接注射后动物可见。此荧光将进一步分散到血管组织中15分钟（ 图4A-4C）。
再生向外长出6。评估
- 使用斐济图片Ĵ免费软件（http://fiji.sc/Fiji）评估拍摄的图像。为了研究再生，使用线追踪工具来确定再生的增长发生在控制和吗啉注射幼虫的数量。
- 要校正的图像，打开通过拖放文件到主窗口斐济在斐济的原始图像文件之一。
- 要设置刻度以下所有图片，请在主菜单中的“分析”。
- 在下拉菜单中点击“设置比例”。
- 在这个窗口中，打开通过单击复选框“环球”选项。
- 现在打开通过拖放（参见步骤6.1）再次测量再生生长量的图像。
- 请在工具栏上的“写意选择”工具。
- 包围要测量的区域（ 连接gures 4J-4L）。
- 按Ctrl + M。这将打开一个新的“结果”窗口显示在正方形像素的包围区域的价值。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
锋利，斜面注射针很容易放置在斑马鱼幼虫的心室背侧接触（ 图3A）时 。的心脏继续泵送和血流维持尽管针（ 图3B和3C）的存在。小心打针不扰乱心室或心脏收缩（ 图3D），尽管注射吗啉代入心脏（ 图3E）的形态。
在几分钟内，吗啉代的Endo-波特溶液通过脉管系统（ 图4A和4B）分布在整个身体。吗啉，然后从血管分布到不同的组织中，如finfold和大脑至少12小时或更多的从荧光（ 图4C）的观察。
在这种方法中，除去第的远侧尖端Ëfinfold，脊髓，末梢躯干肌肉，远端脊索和色素细胞（ 图4D和4H）的远端;所有这一切都难以通过直接注射，由于紧凑（肌肉）特异性靶向，小尺寸（脊髓和脊索）和薄（finfold），但出现的串行心室注射剂，其通过荧光内的这些看到后以加入吗啉组织（ 图4E）相比，未注射的动物（ 图4F和4G）。因此，这种方法较容易地促进输送啉的对组织，很难单独定位，并容许基因功能的评估在再生鳍几种组织一次。评估所涉及的再生特定基因的重要性，1外科部分也截断幼虫尾鳍（ 图4H），切除所有具有INCORP组织 orated啉（ 图4I）。幼虫finfold再生在几天之内截肢后（DPA）（ 图4J）其结构。吗啉目标 需要再生（未发表数据）的基因导致扰动再生反应（ 图4K）相比，未注射（ 图4J）和错配吗啉控制（ 图4L）。对再生长出这些啉实验的总效果可使用标准形态的工具通过跟踪再生组织和比较区域（ 图4J-4L）测定在公开可用的斐济方案12。因此，这个基因靶向方法提供了一种快速和相对容易的测定，以测试在再生过程中的基因的重要性。
5fig1highres.jpg“宽度=”500“/>
图1制备的玻璃毛细管针注射。 A）拉（上）和前玻璃毛细管拉针（下）B）针拉设备。C）车床的坡口和锐化的玻璃针。针是通过双筒望远镜观看。D）该车床是一种润湿橡胶旋转的光盘。将针慢慢地降低到盘E）锋利针必须有很短的斜面的长度不（20微米）比宽（20微米），以尽量减少所需的插入针的整个端插入幼虫心脏的空间心室F）更高的放大率的图象，显示了针的前端。G）的针尖表示锐化后的斜角的形状的示意图。
s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg“宽度=”500“/>
图2。喷射装置设置A）注射吗啉代入斑马鱼幼虫的完整设备。 二）展位内注射。 三）微型泵，调节供注射用。 四）形式按气压来控制放置针用于稳定幼虫注射创建琼脂糖模具E）琼脂糖模具。
图3。注射鱼幼虫。 A）相对于斑马鱼幼虫针的放置B）插入到心室。 三）荧光的针吗啉，但不存在于心室前injecti在D）明场图像显示的玻璃针和幼虫心室E）注射荧光吗啉代入心脏心室之间的大小关系。比例尺等于100微米。
图4。色散啉整个鱼。的）斑马鱼3天老幼虫B）荧光荧光素标记的吗啉代遍及全身脉管系统在整个动物啉包括finfold（FF）（v）条5分钟后心室射出。C）分散，脑（二）在老年，吗啉注射在幼虫尾鳍和躯干，每12小时四）组织后幼虫：脊索（N），脊髓（SC），颜料（p）和finfold（FF）E）分散啉几分钟后注射到幼虫主干的组织包括finfold F）的未注射的幼虫躯干和尾鳍明场图像。虚线表示准截肢平面。G）未注射鳍成像与表示绿色（箭头）的自体荧光的绿色荧光蛋白的过滤器。荧光发光结构的树突状表明，这些是色素细胞通过脊索，肌肉和脊髓外科手术截肢幼虫尾鳍H）明视场图像。Ⅰ）的荧光图像示出了在残端组织啉分布。吗啉纳入肌肉，脊髓，脊索和finfold J）再生的野生型幼虫尾finfold结构。黑线迹的再生组织进行定量分析再生K）吗啉介导的抑制。黑线追查清楚地强调了降低再生重后啉击倒。L）再生幼虫尾部finfold注射了失配控制啉呈现出类似的再生反应在未注射的幼虫（J）的响应。比例尺等于100微米。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
脑室注射提供了一个快速和可靠的评估方法，用于测试基因的功能在以后的身体内环境稳定的发展阶段，或在不影响胚胎发育过程中的基因功能。为了确保这项技术的成功，人们应该知道的四个关键点：1）针头大小，2）晒出针，3）尽量减少体积，并在镇静解4）最小的曝光时间。针太小会经常堵塞，而针是太大，会损伤脑室，引起出血过多。而20微米的建议，针不应该超过五分之一的心室腔的大小。第二个关键点是保持针头变干而堵塞。针和不可避免的频繁停顿，以稳重，转让和位置幼虫的小尺寸能提供足够的时间，让啉在针尖变干并堵塞针头。为了防止这样，人们可以将其浸入针在1x PBS中的一个培养皿。第三个关键点是由过高的音量，尽量减少心室腹胀。如果用量由针头般大小，然后限制增加注射次数总比增加容积：体积较大可引起牵拉伤到心脏。第四个关键点是镇静的程度。镇静时间是基于时间所需要的程序的长度。幼虫可留在镇静溶液，并保持镇静几分钟，因为它们是相当坚固的，而很容易地复苏。然而，过长的麻醉维持鱼会损害其恢复或过短会导致他们在注射过程中恢复。因此，人们应该沉着幼虫仅一个可以一个4分钟期间内注入的数量。
这个电流方法的一个限制是，吗啉代不针对基因的功能在一个组织特异性方式。两种不同的修改可以提供组织特异性：一个修改就是用笼吗啉。激活由共聚焦显微镜激光后，这些吗啉抑制其靶基因，所以定时共聚焦曝光可以提供时间和空间的控制来吗啉活动。笼吗啉已被用于在注射后早期发育过程中对目标基因导入单细胞胚胎。而递送在单细胞阶段可以工作在胚胎发生期间的目标基因，所述吗啉的浓度很可能会太低，在以后幼虫阶段由于随着开发的进展，以幼虫期13连续细胞分裂的次数。吗啉代的一个可以注入的单细胞阶段的量也是有限的毒性13-15。第二个可能的修改是吗啉代，直接注入到被研究时的大小与成像允许的器官或组织。斑马鱼幼虫是半透明的，所以MOS观看T内部器官，他们已经开发之后不应该是一个问题。荧光素标记吗啉与本协议正常工作;因此，荧光可以被用来跟踪啉的分布和组织特异性定位。荧光素标记的吗啉代入组织细胞的掺入需要的Endo-Porter的试剂的存在下，使另一种改进是通过直接注射它在较低量的进入目标组织，以限制内切酶波特试剂的空间分布。因此，空间分辨率应尽可能使用这种技术。
有迹象表明，提供外源基因表达的时间和空间的控制相结合，组织特异性启动子与热休克或他莫昔芬诱导型启动子使基因功能的分析在以后的发展阶段，或在某些组织利用组织的转基因过表达的方法特异性启动子16-19。这包括transge旨在创造一种产品，可以outcompete内源基因显性负构造网卡的表达。这击倒策略是易受脱靶效应时的转基因产生的转基因产物，其获取功能获得的效果20，或当它集成到一个基因，破坏该基因的内源功能21，22的不成比例的表达水平。而吗啉也可以产生脱靶效应，可以更容易地控制，并通过使用失配控制吗啉与不结合靶mRNA，通过使用多个的反义吗啉代靶向内的不同序列相似但稍微改变靶序列限制这些效应同一mRNA和通过测试不同吗啉浓度13-15。此外，吗啉可以生产和测试比设计，提高和测试不同的显性负转基因株系更快，更便宜。因此，在traventricular吗啉注射液提供了一个有用的工具，基因敲除在以后的发展阶段，当显性负转基因是不可能的。当显性负转基因策略是可能的，心室内注射吗啉是一种替代的方法来确认过表达的显性失活的转基因的特异性。
它很可能是不同的吗啉之间的有效浓度会有所不同，因为它们在胚胎发育13，15中使用它们的基因敲除指南。靶向在这项研究中的基因，我们没有在剂量大于3.5毫下观察再生的效果，并且非特异性效应没有在匹配观察到与此啉浓度控制。
脑室注射允许小分子的分布，以评估在整个动物系统活动性和疗效进行实时疗效时，由penet限制配给通过皮肤或消化系统或由化合物可用数额。它也允许组织的目标时，他们无法通过直接注射进行有针对性的，因为对于finfold的情况。这种方法不仅提供了在期间幼虫阶段鳍再生研究基因功能的一种工具。由于吗啉代集成到幼虫finfold包括间充质细胞和表皮，它也可能会提供一个合适的技术研究基因，在伤口愈合或皮肤癌的发生过程中起到部分作用。吗啉的喷射一起用Endo-波特也可以应用于针对在成年斑马鱼的器官或组织，它们是适合于手术和半透明成年斑马鱼线路可用。此外，这种方法不限定于斑马鱼;脑室注射色散可以在其他脊椎动物的机型上使用为好，特别是那些模型，仍然缺乏有效的隐性基因的方法如爪蟾 ，蝾螈和蝾螈，这也是很重要的模型再生的研究。
因而，心室内注射在斑马鱼提供了时间上控制基因的表达具有相对快的协议针对多种组织的能力，以及该方法的多功能性允许其与斑马鱼的转基因株系的使用以及对于缺少功能性的转基因或其它生物基因敲除策略。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由德意志研究联合会（DFG）的支持下，我们要感谢Ayele Tsedeke Taddese寻求技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
