Summary
Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.
Abstract
Zebra balığı hücre ve organ ve apendiks yenilenme moleküler biyolojisini anlamak için önemli bir modeldir. Ancak, ters genetik istihdam moleküler stratejiler henüz yeterince Zebrafish embriyogenezin sonra larva dönemlerinde rejenerasyon veya doku homeostazisindeki gen fonksiyonunu değerlendirmek için geliştirilmiş değil, ve Zebra balığı larva içinde çeşitli dokuları hedeflemek için zordur. Gene özgü morpholinos intraventriküler enjeksiyonlar genomik bu aşamalarda, bir zamansal olarak kontrollü bir şekilde zebra balığı genlerin hedef mevcut yetersizlik için alternatif bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önce bu tür larva kuyruk kanadı, genellikle, invaziv olmayan doku yenilenmesini aratmak için kullanılan bir yapı gibi ulaşmak mümkün olmayan yapılar dahil olmak üzere, vücutta çeşitli dokular içine tam dağılım ve morfolino sonraki dahil edilmesine imkan verir. Larva finfold rejenerasyon sırasında aktive edilen çeşitli genler de Presen ediliryetişkin omurgalı doku yenileyici t, yani larva erişkinlerde rejenerasyon anlamak için bir modeldir. Bu yöntem, morfolino dağılım larva doku tamiri gibi embriyojenez sonra doku homeostazını düzenleyen diğer fizyolojik olayları için gerekli genlerin hızlı ve kolay tanımlanması için gereklidir. Bu nedenle, bu dağıtım yöntemi embriyojenez sonra gen fonksiyonunun değerlendirilmesi için zamansal kontrol için şu anda ihtiyaç strateji sağlar.
Introduction
Organ ve ekleri rejenerasyon yaşam ve spor için temelde önemli olan; Ancak, insan dahil birçok omurgalı rejeneratif yetenekleri sınırlıdır. Çeşitli hayvan modellerde kapsamlı rejeneratif kapasiteye sahip olduğunu mevcut olmakla birlikte, organ ve apendiks rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu değerlendirmek için genetik teknikler ters çok sınırlı ya da varolmayan kalır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar bu model organizmaların yenilenme moleküler biyoloji incelemek gerekmektedir.
Zebra balığı birkaç transgenik balık hatları hücreleri izlemek için var, çünkü hücre ve nedeniyle önemli çoklu organ, doku ve uzantıları yeniden yeteneği, ama aynı zamanda değil tek organ ve apendiksinde rejenerasyon 1, moleküler biyoloji anlamak için iyi kurulmuş bir modeldir ve genini aşırı ifade eden 2, 3, oluşturur. Bununla birlikte, larva Zebrafish gen inhibisyonu esas olarak overexpre sınırlıdırolan transgen ürünü genin endojen aktivitesi yansıtmamaktadır kazanç fonksiyon-etkilerini elde etmek için her ilgi genleri ya da mevcut değildir dominant-negatif yapılar, salgılanması. Bu nedenle, özel olarak nakavt veya demonte gen ifadesini ortadan kaldırmak için alternatif bir yöntem, bu sorunların üstesinden gelmek için gereklidir.
TALENS gen fonksiyonu nakavt için ters genetik aracı olarak kullanan mevcut gen hedefleme özgü; genin ilk gereksinimleri embriyonik gelişimin ilerleyişi önlemek çünkü ancak, bu nakavt strateji, çok sık erken embriyonik dönemde fonksiyonel değerlendirmelere sınırlıdır. Dolayısıyla, bu tür Talens kullanarak geliştirme sonra rejenerasyon veya organ homeostasisin sonraları olayları inceleyerek, 5 4 engellenir. Bu nedenle, alternatif bir gen çıkarma stratejisi tamamen oluşmuş organ ve yapıların gen gereksinimlerini değerlendirmek için erken gelişme sonrası gen işlevini hedefleyen ihtiyaç duyulmaktadır. Morfolino enjeksiyon birkaç yetişkin organlarında genleri hedef ve yetişkin fin 6-8 rejenere etkili olduğu gösterilmiştir, ancak bu yöntemler elektroporasyon gerektiren ve çok iç organları nedeniyle konuma veya dolayı elektrik duyarlılıklarına ya electroporate zordur bozulması. Doğrudan enjeksiyon yapısal bütünlüğünü bozabilir, çünkü ya da boyut sınırlayıcı olduğu için Dahası, larva bazı dokular doğrudan enjekte etmek zordur. Finfold içine direkt enjeksiyon mümkün değil çünkü larva kuyruk yüzgeci, böyle bir yapıdır. Bu nedenle, elektroporasyon ve direkt enjeksiyon için alternatif ya da enjekte etmek için çok küçük ya da elektroporasyona edilemez dokularda genlerin hedeflenmesi için gerekli idi.
Larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında belirli genlerin işlevini inhibe etmek ve hedef amacıyla, mevcut morfolino sağlayan teknolojiler değiştirilmiş olan birGeç-aşamalı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyon sırasında gen fonksiyonu ssessment. Bu yöntem, bir arada Endo-Porter transfeksiyon reaktifi 10, fluorescein-etiketli morpholinos intraventriküler teslim 9 kullanmaktadır. Bir kez ventriküle, morfolino-Endo-Porter karışımı hızla damar yoluyla larva yayılır ve hedef önceden imkansız olmuştur dokuları girer. Bu enjeksiyon yöntemi özel dokularda genlerin hedeflenmesi için modifiye edilebilir ve büyük ihtimalle halen gen fonksiyonu inhibe etmek için ters genetik yöntemler eksikliği diğer hayvan modelleri olarak uygulanabilir. Böylece, hemen larva aşamasında genel organı homeostasis ve rejenerasyon sırasında gen işlevini incelemek için geniş bir yelpazede kullanım potansiyeli ile hızlı ve kolay bir yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cam İğneler hazırlanması (Şekil 1)
- Enjeksiyon iğneleri (Şekil 1A) hazırlamak için bir 0.75 mm çapa sahip bir cam kılcal kullanın.
- Bir iğne çektirmenin içine cam kılcal yerleştirin ve aşağıdaki parametre ile iğneyi çekin: ısıtma çevrimi değeri: 463; döngüsü değerini çekerek: 230; hız: 150 ms; süresi: 150 msn (Şekil 1B).
- Bir mikrometre mercek ile Stereoskop altında 20 mikron çaplı bir iğne üretmek için saatçi cımbızla çekti cam kılcal kırın.
- Iğne keskinleştirmek ve 20 mikron eğimi (Şekil 1C ve 1D) üretmek için, ıslatılmış kauçuk çıkrık ile bir torna kullanın. Not: Sharp, eğimli iğneler ventrikül içine yerleştirilmesi kolaylaştıracak ve böylece doku hasarı en aza indirmek ve kas delikli iğnenin (Şekiller 1 E-G) çıkarılmasından sonra yeniden mühürlemek için izin verir.
2. PreparMorfolino Çözüm ation
- 7.5 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 'de liyofilize morfolino çözülmesiyle morfolino stoku hazırlayın. [Detaylar için üreticinin talimatlarına (Malzemeler tablo) bakın].
- 3.5 mM ve 0.5 mM morfolino Endo-Porter nihai konsantrasyonu için 2.8 ul Endo-Porter stok çözeltisi (1 mM) (Malzemeler tabloya bakınız) 2.5 ul morfolino stok çözeltisi (7.5 mM) karıştırılarak morfolino enjeksiyon çözeltisi hazırlayın.
3.. Morfolino enjeksiyon preparasyonu (Şekil 2)
- 10 ul Microloader pipet ucu ile bir mikropipet kullanılarak, bu çözeltinin 5 ul kesik cam iğne yerleştirin.
- Pnömatik pico pompanın (Şekil 2A-C) bağlı mikromanipülatör iğne tutucuya cam iğne takın.
- Sonraki mikroskop iğne tutucu yerleştirin iğne sadece ihtiyaçları böylecelarva (Şekil 2A), kardiyak ventrikül içine eklemek için bir düzlemsel yönde taşınacak.
- Yaklaşık 45 ° enjeksiyonlar için açısını ayarlayın.
- Tutma basıncı aşağıdaki gibidir: mikroenjektör değerlerini ayarlayın inç kare (psi) başına 20 £; ejeksiyon basıncı: 15 psi; Kapılanamaması 100 msn aralığı 1.9 dönemi değeri (10.9 msn karşılık gelir).
- % 1.5 ile 20 ml (w / v) jeli oluşturmak için standart bir mikrodalga kullanılarak 1 x PBS içinde agaroz eritin. , 10 cm Petri kabı içine erimiş jel dökün. Sertleştikten sonra, agaroz sedasyon larva 11 (Şekil 2D ve 2E) yerleştirileceği oluklar içinde olacak, böylece sıcak bir yivli agaroz enjeksiyon formu yerleştirin.
4. Enjeksiyonları (Şekil 3)
- 20 mg / L tricaine (L-Etil-m-amino-benzoat-metan sülfonat) onlar dokunmak yanıt vermemesine kadar akvaryum suyu 100 ml larva anestezisi.
- Plastik bir Pasteur pipett kullanınventral yan oluk (Şekil 3A) dikey agaroz duvara bakacak şekilde e dikkatle ıslak agaroz kalıbın bir oluğuna sedasyon larva aktarmak için kullanılır.
- Ventrikül uzak enjeksiyon iğnesi (Şekil 3A) bakacak şekilde stereomikroskop altında agaroz plakası yerleştirin.
- Kalbin karıncık içine eklemek için iğne indirin. Sadece 1-2 mikron çok derin iğne (Şekil 3B ve 3C) takmamaya özen ventrikül içine iğne takın.
- Iğne takıldıktan sonra, kalbin (Şekil 3D ve 3E) temizlenmesini sağlamak için aralıklarla bekleyen, 4-6 bakliyat, çözümün her sağlayan 3 nl ile ventrikül içine morfolino çözüm enjekte.
- Enjeksiyondan sonra, iğne (ekleme düzlemine paralel) kaldırmak ve daha sonra dikkatli bir şekilde E3 orta BAC dolu plastik bir Pasteur pipeti kullanarak larva aktarmataze E3 ortamı içeren bir Petri kabı içine k.
- Enjekte edilen larva aktarırken iğnenin kurumasını önlemek için 1x PBS içeren bir petri kabı içine iğne yerleştirin.
- Tekrar 4,1-4,6 deney süresince her 12-24 saat adımları tekrarlayın. Not: enjeksiyon Yinelenen hücrelerdeki morfolino alımını ve bakım sağlar.
5. Enjeksiyonları Analizleri (Şekil 4)
- Onlar dokunmak yanıt vermemesine kadar 20 mg / L tricaine akvaryum su 100 ml balık anestezisi.
- Düz ıslak% 1.5 üzerinde yanal olarak larva yerleştirin E3 ortam maddesi ile kaplanmış (ağ / hac) agaroz.
- Aydınlık ve floresan görüntüleme ile stereomikroskopta kullanarak görüntü larva. Not: larvalar şeffaf olduğu için, floresein-etiketli morfolino doğrudan enjeksiyondan sonra hayvan boyunca kan damarlarında floresan yeşili gibi görünür olmalıdır. Bu floresan ayrıca aşağıdaki diğer vaskülarize doku içine dağılacaktır15 dakika (Şekil 4A-4C).
Rejeneratif kıbet 6. Değerlendirilmesi
- Fiji Resim J özgür yazılım (http://fiji.sc/Fiji) kullanılarak çekilen görüntüleri değerlendirmek. Rejenerasyon araştırmak için, kontrol ve morfolinodur enjekte larva oluştu rejeneratif büyüme miktarını belirlemek için hat-izleme aracını kullanın.
- Görüntüleri kalibre etmek için, sürükleyerek ve ana Fiji penceresinin içine dosyayı bırakarak Fiji orijinal görüntü dosyalarından birini açın.
- Aşağıdaki tüm görüntüler için ölçeğini ayarlamak için, ana menüde "Analiz" gidin.
- "Set ölçekte" menüsünü tıklatın Açılır.
- Bu pencerede, onay kutusunu tıklatarak "Küresel" seçeneğini açın.
- Şimdi sürükle ve bırak (adım 6.1) tekrar rejeneratif büyüme miktarını ölçmek için görüntüyü açın.
- Araç çubuğunda "serbest seçimler" aracını seçin.
- Ölçülecek alanı (Fi kuşatmakdeerlerini 4J-4L).
- Ctrl + M. Bu kare piksel çevrili alanın değerini gösteren yeni bir "Sonuçlar" penceresi açılacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(Şekil 3A) dorsal yaklaştı keskin, eğimli enjeksiyon iğnesi kolayca Zebra balığı larva kalp ventrikül yerleştirilir. Kalp iğne (Şekil 3B ve 3C) varlığına rağmen devam eder ve pompalama kan akışı muhafaza edilmektedir. Dikkatli enjeksiyonları kalp (Şekil 3E) içine morfolino enjeksiyonu rağmen ventrikül veya kalp kasılmaları (Şekil 3D) morfolojisini bozmayacak.
Birkaç dakika içinde, morfolino-Endo-Porter solüsyonu damar (Şekil 4A ve 4B) ile vücuda dağıtır. Morfolino daha sonra, en az 12 saat veya floresan (Şekil 4C) için gözlenen daha finfold ve beyin gibi çeşitli dokularda damar sisteminden dağıtılır.
Bu yaklaşımda, biz th distal ucu kaldırmae finfold, omurilik, distal gövde kas, distal Notokordun ve pigment hücreleri (Şekil 4D ve 4H) distal ucu; bütün bunlar nedeniyle özellikle kompakt (kas) doğrudan enjeksiyon yoluyla hedef zor olan, küçük boyutlu (omurilik ve notokord) ve inceliği (finfold), ancak bu içindeki floresan tarafından görülen seri ventriküler enjeksiyonlar, sonra morfolinoyu dahil görünür dokuların (Şekil 4E) enjeksiyon yapılmamış hayvanlarda (Şekil 4F ve 4G) ile karşılaştırıldığında. Bu yüzden, bu yöntem, nispeten kolay tek tek zor olan hedef dokulara morfolino teslim teşvik eder ve bu da bir kez rejenerasyon fin çeşitli dokularda gen işlevinin değerlendirilmesine olanak tanımaktadır. Rejenerasyon ilgili spesifik genlerin önemini değerlendirmek için, bir cerrahi kısmen Incorp tüm dokuları çıkarıldığı, larva kuyruk yüzgeci (Şekil 4H) kesmiş morfolino (Şekil 4i) eklenebilecektir. Larva finfold bir kaç gün sonrası amputasyon (DPA) (Şekil 4J) içindeki yapısını yeniler. Morfolino hedefleme rejenerasyon (yayınlanmamış veriler) için gerekli olan bir geni (Şekil 4J) ve uyumsuzluk morfolino kontrol (Şekil 4 L) enjeksiyon yapılmamış kıyasla tedirgin yenilenmesi tepki (Şekil 4 K) ile sonuçlanır. Rejeneratif akıbet bu morfolinodur deneylerin toplam etkisi, rejenere dokuları izleme ve alanları (Şekil 4J-4L) karşılaştırarak kamuya açık Fiji programlarında 12 standart morfometrik araçlarını kullanarak ölçülebilir. Bu nedenle, bu gen hedeflemesi yöntem olup, rejenerasyon işleminde genlerin önemini test etmek için hızlı ve nispeten kolay bir deney sağlar.
5fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Enjeksiyon için cam kılcal iğneler Şekil 1.. Hazırlanması. Çekme (üstte) ve daha önce A) Cam kılcal boru) altında (iğne çekti. B) İğne çekerek aparat. C) Torna beveling ve cam iğne bileme. İğne dürbün ile görülüyor. D) torna, ıslatılmış kauçuk iplik disktir. İğne yavaşça disk üzerine indirilir. E) Netleştirilmiş iğne artık (20 um olan kısa bir eğim olması gerekir) larva kalp içine iğnenin tüm ucunu için gerekli olan alanı en aza indirmek için) 20 um (geniş daha iğne ucu. G) bileme sonra eğimin şeklini gösteren iğne ucu şematik görünümü gösteren ventrikül. F) Yüksek büyütmeli görüntü.
s/ftp_upload/51595/51595fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2,. Enjeksiyon tertibatı kurmak. A) zebra balığı larvası içine morfolino püskürtülmesi için tam cihaz. B) enjeksiyonu enjeksiyonları kullanılmıştır. D) Form pres için pnömatik basıncı düzenler. C) pico pompa sırasında iğne yerleşimini kontrol etmek için Standı Enjeksiyon için larva stabilize etmek için kullanılan agaroz kalıp oluşturmak için. E) Agaroz kalıp.
Balık larva Şekil 3.. Enjeksiyon. Kalp ventrikül içine) zebra balığı larvası ile ilgili olarak iğne yerleştirilmesi. B) yerleştirilmesi. C) iğne morfolino Floresan ancak ventrikülde yok önce Injecti. D) aydınlık görüntü cam iğne ve larva ventrikül kalp ventrikül içine floresan morfolino. E) enjeksiyon arasındaki boyut ilişkiyi gösterir. Ölçek çubukları 100 mikron eşit.
Balık boyunca morfolino Şekil 4.. Dispersiyon. A) Zebrafish 3 günlük larva. B) Floresans fluorescein-etiketli gövde damar finfold (ff) de dahil olmak üzere hayvan boyunca morfolino, (v) 5 dakika sonrası ventriküler enjeksiyonu. C) Dağılım boyunca morfolino, beyin (b) daha büyük olarak . larva morfolinodan enjeksiyonlar larva kuyruk yüzgeci ve bagajda her 12 saat D) Dokular sonra:. Notokordun (n), spinal kord (sc), pigment (p), ve finfold (ff) E) morfolinoyu DağınıkBirkaç dakika finfold. F) uninjected larva gövde ve kuyruk yüzgecinin aydınlık görüntü de dahil olmak üzere larva gövde dokulara enjeksiyondan sonra. Kesikli çizgi yeşil (ok başları) otoflüoresanı gösteren GFP filtresi ile görüntülü muhtemel amputasyon düzlemi. G) uninjected fin gösterir. Floresan yapıların şekli, bu dendritik hücreler pigment Notokordun, kas ve spinal kord ile cerrahi kesilmiş larva kuyruk yüzgeci. H) aydınlık görüntü olduğunu göstermektedir. I) güdük dokularda dağılımını gösteren bir morfolino Floresan görüntüsü. Kasına Morfolino birleşme, spinal kord, Notokordun ve finfold. J) vahşi tip larva kaudal finfold yapılarını Rejenere. Siyah hat miktar analizi için yeniden doku yenilenme. K) Morfolino-aracılı inhibisyonu izler. Siyah çizgi izleme açıkça azaltılmış rejenerasyon yeniden vurgulamaktadırmorfolinodur knockdown. L) uninjected larva (J) de benzer bir rejenerasyon tepkisini gösteren bir uyumsuzluk kontrol morfolinodan enjekte larva kaudal finfold Rejenere sonra yanıt alınamaması. Ölçek çubukları 100 mikron eşit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraventriküler enjeksiyon Embriyogenez sırasında gen fonksiyonlarını etkilemeden gelişim veya vücut homeostasis ileriki aşamalarında gen fonksiyon testi için hızlı ve güvenilir bir değerlendirme yöntemi sağlar. Bu tekniğin başarı sağlamak için, bir dört kritik noktaların farkında olmalıdır: iğneden 1) iğne boyutu, 2) kurutma, 3) hacmini minimize ve sedasyon çözeltide 4) minimal maruz kalma süresi. Çok büyük iğneler ventrikül zarar ve aşırı kanamaya neden olurken çok küçük iğneler, sık sık yapışmasına neden olacaktır. 20 um tavsiye edilir olsa da, iğne birden fazla beşte ventriküler odasının büyüklüğü asla. İkinci kritik nokta kurumasını ve tıkanmasını iğne tutmaktır. Oturaklı, transfer ve pozisyon larva için iğne ve kaçınılmaz sık duraklamalar küçük boyutlu iğne ucunda morfolino kurumasına ve iğne tıkanmasına izin vermek için yeterli zaman sağlayabilir. Önlemek içinBu, tek bir 1x PBS Petri kabındaki iğne batırmak. Üçüncü bir kritik nokta, bir hacim ile çok yüksek ventrikül şişkinlik en aza indirmektir. Dozaj iğne boyutuna ile sınırlıdır sonra enjeksiyon sayısını artırmak her zaman hacminin artırılması için tercih edilir: daha büyük hacimler kalbine streç yaralanmalara neden olabilir. Dördüncü kritik nokta sedasyon ölçüde. Sedasyon zaman işlem için gereken zaman uzunluğuna dayanmaktadır. Bu oldukça sağlam ve oldukça kolay bir canlandırma, çünkü larva, sedasyon çözelti içinde kalabilir ve birkaç dakika sedasyon kalır. Ancak, anestezi çok uzun balık muhafaza toparlanmaya zarar edecek ya da çok kısa onları enjeksiyon sırasında canlandırmak için neden olacaktır. Bu nedenle, tek tek, 4 dakikalık bir süre içinde enjekte edebilir larva olan sayıda sakinleştirici gerekir.
Bu geçerli yöntemin bir sınırlama morfolino dokusundaki gen fonksiyonu hedef olmamasıdırÖzgü bir şekilde. İki farklı modifikasyonlar doku spesifikliği sağlayabilir: bir değişiklik kafesli morpholinos kullanmaktır. Konfokal mikroskop lazer ışığı ile aktive edilmesinin ardından, bu morpholinos bunların gen hedefi inhibe eden, bu zamana eş odaklı maruz morfolino aktiviteye zamansal ve uzamsal kontrolü sağlayabilir. Kafesli morpholinos tek hücreli embriyonun içine enjeksiyondan sonra erken gelişimi sırasında genlerin hedeflenmesi için kullanılmıştır. Tek hücreli aşamada teslim embriyojenez sırasında hedef genlere çalışır iken, morfolino konsantrasyonu olasılığı nedeniyle gelişme larva aşamasında 13 ilerledikçe ardışık hücre bölünmesi sayısına daha sonra larva aşamasında çok düşük olacaktır. Bir tek hücre aşamasında enjekte morfolino miktarı da 13-15 toksisite ile sınırlanmıştır. İkinci olası bir değişiklik, doğrudan bir boyut ve görüntüleme izin zaman incelenecek organ veya doku bir morfolino enjekte etmektir. Zebra balığı larva şeffaf olduğundan, görüntüleme mosonlar geliştirdik sonra iç organları t bir problem olmamalı. Floresein etiketli morpholinos bu protokol ile çalışmak; Bu nedenle, floresan morfolino dağılımını ve dokuya özel lokalizasyon izlemek için kullanılabilir. Doku hücrelerine fluoresein etiketli morfolino dahil edilmesi bu nedenle başka bir değişiklik, hedef dokuya direkt olarak daha az miktarlarda enjekte ile Endo-Porter tepkin uzamsal dağılımını sınırlayıcı olacaktır, Endo-Porter reaktifinin varlığını gerektirir. Böylece, uzaysal çözünürlüğü bu teknik ile mümkün olmalıdır.
Doku kullanılarak gelişiminin sonraki evrelerinde veya bazı dokularda gen işlevinin analizi sağlar ısı şok ya da tamoksifen ile indüklenebilir promotörler ile dokuya özel promoterlerin birleştirerek eksojen gen sentezlenmesinin zamansal ve uzamsal kontrol temin eden transgenik aşırı ekspresyonu, yöntem vardır Belirli hızlandırıcılar, 16-19. Bu transge içerirendojen geni outcompete bir ürün yaratmak için tasarlanmış dominant-negatif yapıların nic ifadesidir. Bir transgen, bir gen içine entegre ve genin endojen fonksiyonu 21, 22 bozan zaman kazancı fonksiyon-20 ya da etkilerini elde eden bir transgen ürününün aşırı ifade seviyelerini üretir, bu strateji, portatif hedef dışı etkilerine karşı hassastır. Morpholinos da hedef dışı etkiler üretebilir birlikte, bir tane daha kolay kontrol eden ve içinde farklı dizileri hedeflemek birden antisens morpholinos kullanarak, hedef mRNA bağlanmaz benzer ancak biraz değiştirilmiş hedef sekansları ile uyumsuz kontrol morpholinos kullanarak bu etkileri sınırlamak mRNA, aynı ve farklı morfolino konsantrasyonlarının 13-15 test edilmesi. Ayrıca, morpholinos üretilen ve çok daha hızlı ve daha ucuz, tasarımı yetiştirme ve farklı dominant-negatif transgenik çizgiler test göre test edilebilir. Bu nedenle, inmorpholinos arasında traventricular enjeksiyonu dominant-negatif transgenesis mümkün olmadığında, gelişiminin sonraki aşamalarında genleri demonte yararlı bir araç sağlar. Dominant-negatif bir transgenik strateji mümkün olduğunda, ventrikül içi enjeksiyon morfolino Süreksprese olan dominant-negatif transgenin özgünlüğünü teyit etmek için alternatif bir yaklaşımdır.
Bu embriyojenez 13, 15 boyunca gen demonte bunları kullanarak zaman olduğu gibi, farklı morpholinos arasında etkili konsantrasyonları, değişebilir olasıdır. Bu çalışmada hedef gen için, 3,5 mM 'den daha düşük dozlarda rejenerasyon üzerinde bir etkisi gözlemlenmemiştir, ve spesifik olmayan etkiler uyuşmazlığı gözlenmemiştir, bu morfolino konsantrasyonu ile kontrol eder.
İntraventriküler enjeksiyon etkinliği Penet ile sınırlı olduğunda, gerçek zamanlı olarak bütün hayvan sistemi içinde aktivite ve etkinliğini değerlendirmek için, küçük moleküllerin dağılımı sağlar:deri ya da sindirim sistemi yoluyla ya da mevcut bileşiğin miktarda tayın. Bunlar, doğrudan enjeksiyonu ile hedef edilemeyen finfold için olduğu gibi aynı zamanda, dokuların hedefleme sağlar. Bu yöntem, larva aşamasında fin rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu incelemek için bir araç sağlamak değil sadece. Morfolino mezenkimal hücreler ve epidermisi içeren larva finfold entegre olduğundan, aynı zamanda yara iyileşmesi veya cilt kanseri oluşum sürecinde rol oynayan genlerin rolünü araştırmak için uygun bir teknik sağlayabilir. Birlikte Endo-Porter ile morfolino Enjeksiyon ayrıca cerrahi ve saydam yetişkin zebra balığı hatları için uygun olan mevcut yetişkin Zebrafish organ ya da doku, hedef uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntem zebrabalıkları ile sınırlı değildir; ventrikül içi enjeksiyon ile dağıtım modelleri, özellikle de etkili çekinik gen yöntemler eksikliği, hem de diğer omurgalı modellerinde kullanılabilirAyrıca, rejenerasyon çalışmaları için önemlidir modeller Xenopus, Axolotl ve ölçüsüne, gibi.
Bu nedenle, Zebrafish intraventriküler enjeksiyon geçici olarak birden fazla hedef dokulara nispeten hızlı bir protokol ile gen sentezlenmesinin kontrol edilmesi için olanağı sunar ve bu yöntemin çok yönlü fonksiyonel transgenesis eksikliği ya da diğer organizmalar yanı sıra zebra balığı transjenik ile kullanım için sağlar: gen nakavt stratejileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenen, biz teknik destek için Ayele Tsedeke Taddese teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information at www.gene-tools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming/Brown needle puller | Sutter | More information at www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
