Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anvendelse af fluorescerende Skud Arrays for Vurdering af T-celle respons Published: June 19, 2014 doi: 10.3791/51627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Summary

Muligheden for at overvåge T-cellereaktioner i detaljer in vivo er vigtig for udviklingen af vores forståelse af immunresponset. Her beskriver vi brug af fluorescerende target arrays (FTA) i en in vivo T-celle analyse, der vurderer> 250 parametre samtidigt ved flowcytometri.

Abstract

Muligheden for at overvåge T-cellereaktioner in vivo er vigtig for udviklingen af vores forståelse af immunresponset og udformningen af immunterapi. Her beskriver vi brug af fluorescerende target array (FTA) teknologi, som udnytter vitale farvestoffer såsom carboxyfluorescein succinimidylesteren (CFSE), violet laser overgearet farvestoffer (CellTrace Violet: CTV) og rød laser overgearet farvestoffer (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) til kombinatorisk label mus lymfocytter til> 250 skelnelige fluorescerende celleklynger. Celleklynger i disse frihandelsaftaler kan pulset med major histocompatibility (MHC) klasse I-og MHC klasse II-bindende peptider og derved fungere som målceller for CD8 + og CD4 + T-celler. Disse FTA celler forbliver levedygtige og fuldt funktionel, og kan derfor administreres i mus for at muliggøre vurdering af CD8 + T-celle-medieret drab af FTA target-celler og CD4 + T-celle-mediterede HELp af FTA B celle målceller i realtid in vivo ved flowcytometri. Da> 250 målceller kan vurderes på en gang, at teknikken tillader overvågning af T-celle responser mod flere antigen epitoper på flere koncentrationer og i flere gentagelser. Som sådan kan teknikken måle T-celle-responser på både kvantitative (fx den kumulative størrelse af reaktionen) og en kvalitativ (f.eks. Funktionelle aviditet og epitop-krydsreaktivitet af reaktionen) niveau. Heri beskriver vi, hvordan disse frihandelsaftaler er konstrueret og giver et eksempel på, hvordan de kan anvendes til at vurdere T-celle-responser induceret af en rekombinant poxvirus vaccine.

Introduction

T-celler spiller en central rolle i adaptiv immunreaktion og er ofte målrettet til manipulation i immunterapi. CD4 +-effektor-T-celler reagerer på fremmed antigen ved at udskille cytokiner, der regulerer mange aspekter af immunitet, og kan også direkte hjælper B-celler til at fremstille antistoffer. CD8 +-cytotoksiske T-celler (CTL'er) kan også svare på fremmed antigen ved at udskille cytokiner såvel som at spille en central rolle i direkte at dræbe celler, der udtrykker et fremmed antigen. Den grundlæggende interaktion, der initierer disse T-celle-effektorfunktioner involverer interaktionen af ​​T-cellereceptoren (TCR) med fremmede peptider vises på MHC-molekyler på overfladen af ​​celler. CD4 + T-celler genkender peptider vises på MHC klasse II-molekyler på antigenpræsenterende celler og CD8 +-T-celler genkender peptider vises på MHC-klasse-I-molekyler, som typisk vises på mikrobe-inficerede celler.

Forat vurdere den rolle T-celler spiller i et immunrespons, er det vigtigt, at deres effektorfunktioner måles ved pålidelige og følsomme teknikker. Almindelige metoder til T vurdering celle respons omfatter; MHC class-I/II/peptide tetramer reaktivitet; cytokinproduktion af ELISPOT og intracellulær cytokin-farvning; og dræbe kapaciteten med 51Cr-frigivelse assays. Disse assays er imidlertid typisk udføres ex vivo med in vitro-stimulering eller give begrænset indsigt i T-cellefunktion. Ideelt, når man måler T-celle responser det ville være gavnligt at vurdere dem i situ, in vivo som de opstår, uden manipulation af T-celler for at undgå ændringer i funktionelle parametre, der kan opstå ved in vitro-stimulering. Nogle af de mest almindeligt anvendte in vivo T-celle funktionelle assays er baseret på måling af CTL-medieret drab af målceller pulset med MHC klasse I-bindende peptider, der er opført i vivovia deres opdagelse gennem fluorescerende mærkning med vitale farvestoffer, såsom CFSE. Mens disse typer af analyser kan overvåge CTL-medieret drab på mål, når de sker in vivo, har de tidligere haft en forholdsvis begrænset kapacitet til at vurdere drab på flere mål, som giver forskellige koncentrationer og forskellige typer af peptid-epitoper, som er nødvendige for, at de kvalitative parametre som funktionelle grådighed og epitop variant krydsreaktivitet skal vurderes. Disse analyser heller ikke give nogen oplysninger om CD4 + T-celle-medierede responser.

For at overvinde mange af de begrænsninger med nuværende metoder til at vurdere T-celle responser, vi har for nylig udviklet en multiplex assay baseret på fluorescerende target arrays (FTA), som giver overvågning af T-celle responser mod> 250 målceller samtidigt i et dyr ved flowcytometri 1, 2. Frihandelsaftaler består af lymfocytter mærket med sevterale koncentrationer og kombinationer af vitale farvestoffer som CFSE, CTV og CPD tillader> 250 celle klynger af unikke fluorescens, der skal genereres. Da disse celler forbliver levedygtige og fuldt funktionel, kan de injiceres i dyr for at tillade overvågning af deres interaktion med effektor T-celler in vivo 3. For eksempel kan FTA celleklynger pulseres med MHC klasse I-bindende peptider til at muliggøre vurdering af antigen-specifik CTL-medieret drab af målceller 1. Desuden kan FTA celleklynger også pulset med MHC-klasse-II-bindende peptider, tillader vurdering af antigen-specifik T hjælper celle (T H)-aktivitet ved at vurdere aktivering (ved vurdering af aktivering markører, såsom CD69, CD44 og / eller CD62L) af B-celler i FTA bærer beslægtet peptid 2. Da mere end 250 mål kan detekteres samtidigt, er det muligt at måle CTL-og T H reaktioner mod mange mål celleklynger pulset med numerous peptider i forskellige koncentrationer og inddragelse af mange gentagelser. Frihandelsaftalen analysen giver derfor et hidtil uset niveau af T-celle effektor respons vurdering in vivo.

Her beskriver vi i detaljer opbygningen af en frihandelsaftale og vise, hvordan de kan anvendes til at vurdere T-celle responser in vivo. Fremgangsmåden beskriver konstruktionen af ​​en FTA består af 252 skelnelige celleklynger ved brug af tre vitale farvestoffer, der består af 6 gentagelser af 42 celleklynger pulset med MHC klasse I og II-bindende peptider. Mærkningen af 42 celleklynger forekommer i 10 ml konisk bund rør, og det er nyttigt at lægge disse ud i et rør rack som vist i tabel 1. Kan denne metode korrigeret for mindre antal mærkbar klynger som krævet ved at reducere mængden af mærkning hvert farvestof udført 1.

Vi fremhæver nytten af ​​analysen ved at vise, hvordan den kan måle responses genereret af rekombinant kopper-virus vaccination mod flere epitoper i en lille kohorte af mus. Dette viser, hvordan FTA Assayet kan anvendes til at måle kumulative responser og funktionel aviditet gennem henholdsvis anvendelse af arealet under kurven (AUC) vurderinger og måling af effektiv peptid koncentration, der kræves for at generere halve maksimale responser (EC 50).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Mus, der anvendes i henhold til denne protokol blev håndteret i henhold til retningslinjerne fra Australian National University dyreforsøg Ethics Committee og mus blev aflivet ved cervikal dislokation.

1. Dye og Peptid Fremstilling

  1. Dye forberedelse
    Bemærk: Farvestoffer fortyndet ved forskellige koncentrationer for at tillade mærkning af celler ved diskrete fluorescensintensiteter. CFSE bruges på syv koncentrationer foretaget via 3,5-fold seriefortyndinger, og CTV og CPD bruges på seks forskellige koncentrationer foretaget via 3,7-fold seriefortyndinger (se tabel 2-4). De stamkoncentrationer farvestoffer anført i tabel 2-4 vil blive anvendt til at mærke målceller på de endelige farvestofkoncentrationer er anført i tabel 2-4. Farvestoffer reagerer ved udsættelse for vandig opløsning. Det er derfor vigtigt, at hætteglas ækvilibreres til RT forud for åbningen for at minimere eksponeringen af ​​farvestoffer til at kondens.
    1. CFSE
      Bemærk: CFSE er købt som carboxyfluorescein diacetate succinimidylesteren (CFDA, SE, MW 557,47), typisk ved 25 mg / hætteglas.
      1. Resuspender 25 mg CFSE i 4,48 ml DMSO til opnåelse af en 10 mM stamopløsning.
      2. Serielt fortynde CFSE: Tilføj 35 ul 10 mM CFSE lager i 87,5 ul DMSO og gentage dette med fortyndet stamopløsning at give hvert farvestof koncentration i tabel 3.
    2. CTV
      Bemærk: CTV købes typisk i pakninger med 9 hætteglas, som hver kan rekonstitueres med 10 pi DMSO til at generere en 10 mM opløsning af farvestoffet.
      1. Opløs og samle alle 9 hætteglas CTV med 90 pi DMSO for at give en 10 mM løsning.
      2. Serielt fortynde CTV: Tilføj 11 ul 10 mM CTV lager i 29,7 ul DMSO og gentage dette med fortyndet stamopløsning at give hvert farvestof koncentration i tabel 2.
    3. CPD
      Bemærk: CPD (MW 792,6) er typiskly købt som 0,5 mg / hætteglas.
      1. Resuspender 0,5 mg CPD i 63 ml DMSO for at få en 10 mM løsning.
      2. Serielt fortynde CPD: Tilføj 11 ul 10 mM CPD lager i 29,7 ul DMSO og gentage dette med fortyndet stamopløsning at give hvert farvestof koncentration i tabel 4.
        Bemærk: Dye lagre kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder og kan optøs og genfryses adskillige gange uden betydeligt tab af funktion.
  2. Peptidpræparat
    Bemærk: MHC klasse I-bindende peptider er generelt bruges til at pulsere målceller ved 6 forskellige koncentrationer fremstillet ved anvendelse af 10 gange fortyndinger fra en startkoncentration på 1 uM (tabel 5). MHC klasse II-bindende peptider er generelt bruges til at pulsere målceller ved 6 forskellige koncentrationer fremstillet ved anvendelse af tre ganges fortyndinger fra en startkoncentration på 400 pM (tabel 5). Hvert peptid foretages på 2x slutkoncentrationen i PBS sådan that hver peptidkoncentration har et minimum volumen på 250 ul. Peptid lagre kan fremstilles før FTA konstruktion og opbevaret ved -20 ° C uden betydelig tab af funktion.
    1. Forberedelse lager MHC klasse I-bindende peptider
    2. Forbered den højeste koncentration af hvert peptid epitop 2 pM stamopløsninger (2x 1 uM)
    3. Serielt fortyndet MHC klasse-I-bindende peptider: tilføj 44,4 ul 2 pM peptid stamopløsning i 400 pi PBS. Gentag dette med fortyndet stamopløsning at give hver peptidkoncentration i tabel 5..
    4. Forberedelse lager MHC klasse II-bindende peptider
    5. Forbered den højeste koncentration af hver peptidepitop til 800 pM stamopløsninger (2x 400 uM).
    6. Serielt fortyndet MHC klasse II-bindende peptider: Tilsæt 150 ul 800 pM peptid opløsningen i 300 pi PBS. Gentag dette med fortyndet stamopløsning til opnåelse hvert peptid koncentration i tabel 5.

2.. FTA Forberedelse

Bemærk: Proceduren nedenfor skitserer opbygningen af en frihandelsaftale består af celler pulset med 7 forskellige peptidepitoper ved 6 forskellige koncentrationer (dvs. 42 celleklynger.) Gentagen 6 gange for at generere 252 mærkbar celleklynger. Inden for hver gentagelse, en celle klynge ikke pulset med nogen epitop (Nil), indgår som en kontrol. Det er nyttigt for frihandelsaftaler at have en CD45 allotype forskel fra værtsdyr for at give deres diskrimination fra recipientceller ved antistof-mærkning på tidspunktet for analysen. Ellers frihandelsaftaler kan mærkes med andre farvestoffer, såsom PKH-26 til dette formål (der er beskrevet i trin 2.6). Typisk er forberedelse procedure frihandelsaftalen udføres fra start til slut i løbet af et møde.

  1. Etiket 42, 10 ml konisk bund plastrør 1-42 (som i tabel 1 for eksempel).
  2. Fremstilling af celler
    1. Isoler milt og / eller lymphnodes fra mus. Forbered enkelt celle suspension fra væv ved mæskning gennem en 70 um gransket sigte med en 5 ml sprøjte stempel og tælle celler ved hjælp af et hæmocytometer.
    2. Resuspender lymfocytter ved op til 200 x 10 6 celler / ml i 11,5 ml Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI eller tilsvarende) indeholdende 5% føtalt kalveserum (FCS). Bemærk: Det er vigtigt at anvende en buffer med højt indhold amin for at minimere farvestof toksicitet for celler 3..
  3. CTV mærkning
    Bemærk: Celler oprindeligt mærket med 6 koncentrationer af CTV.
    1. Grundigt opblande cellerne ved at vende røret flere gange. Tilføj 1,9 ml cellesuspension til 6 af de 10 ml rør mærket 37-42, tager sig den øverste halvdel af rørene ikke at våd.
    2. At mærke cellerne med CTV, skal du fjerne hætten og lægge røret vandret.
    3. Tilføj 83 pi PBS i den ikke befugtede del på toppen af røret, og til dette tilsættes 17 pi lager CTV (se tabelle 2, for hvilke der er tildelt stamopløsning til hvilket rør). Bemærk: En ikke befugtet rør er vigtigt at forhindre cellesuspension bevægelse og for tidlig blanding af celleopløsningen med farveopløsning.
    4. Sæt låg på røret og blandes cellesuspensionen med farvestoffet hurtigt og grundigt ved hvirvelbehandling.
    5. Gentag trin 2.3.2-2.3.4 for stamopløsninger af CTV i de udpegede rør, der er beskrevet i tabel 2.
    6. Cellerne inkuberes i mindst 5 minutter ved stuetemperatur (20 ° C).
  4. CFSE mærkning
    1. Efter CTV mærkning, tilsættes 5 ml RPMI indeholdende 5% FCS til hvert rør og grundigt opblande cellerne ved hvirvelblanding.
      1. Fra rør 37 overføres 1 ml cellesuspension til rør 31, 25, 19, 13, 7 og 1.
      2. Fra rør 38 overføres 1 ml cellesuspension til rør 32, 26, 20, 14, 8 og 2.
      3. Fra rør 39 overføres 1 ml cellesuspension til rør 33, 27, 21, 15, 9 og 3.
      4. Fra rør 40 overføres 1 ml cellesuspension til rør 34, 28, 22, 16, 10, og 4.
      5. Fra rør 41 overføres 1 ml cellesuspension til rør 35, 29, 23, 17, 11 og 5..
      6. Fra rør 42 overføres 1 ml cellesuspension til rør 36, 30, 24, 18, 12 og 6
        Bemærk: Pas på ikke at den øverste halvdel af rørene under trin 2.4.1.1-2.4.1.6 våd.
    2. At mærke cellerne med CFSE fjerne hætten og lægge røret vandret.
    3. Tilføj 103 ml PBS i den ikke befugtede del på toppen af røret, og til dette tilsættes 7 ml lager CFSE (se tabel 3 som er overdraget til hvilket rør stamopløsning).
    4. Sæt låg på røret og blandes cellesuspensionen med farvestoffet hurtigt og grundigt ved hvirvelbehandling.
    5. Gør trin 2.4.2-2.4.4 for stamopløsninger af CFSE i de udpegede rør, der er beskrevet i tabel 3.
    6. Cellerne inkuberes i mindst 5 minutter ved stuetemperatur (20 ° C).
    7. Vask cellerne: celle suspension fortyndes med 9 ml 20 ° CRPMI indeholdende 5% FCS, sediment ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 20 ° C og fjerne supernatanter ved aspiration med transfer pipette.
  5. Peptid pulserende og cellevask
    Bemærk: Efter at cellerne er blevet mærket med CTV og CFSE, er de pulset med MHC klasse I og / eller MHC klasse II-bindende peptider (udarbejdet i 1.2). En af de cellepopulationer må heller ikke pulseret med peptid (f.eks. Nil i tabel 1) og anvendes som en negativ kontrol for beregning af T-celle responser.
    1. Peptid pulserende
      1. Resuspender celler i et samlet volumen på 250 ul RPMI indeholdende 5% FCS. Bemærk: Typisk 50 pi cellesuspension tilbage efter aspiration af supernatanten ved afslutningen af ​​trin 2.4.7, derfor tilsættes 200 pi medium til cellepellet.
      2. Tilføj 250 pi forhånd forberedte peptid lagre (som i tabel 5) på passende betegnet rør (som i tabel 1) og være sure til at omfatte en kontrol rør PBS tilsættes alene uden peptid som en Nil kontrol.
      3. Bland cellesuspensioner med en vortex. Bemærk: Det er vigtigt, at hvert peptid epitop og hvert peptid koncentration er tildelt et enkelt rør, og det angives klart baseret på den forventede fluorescens af cellerne i dette rør, idet fluorescens signatur af denne klynge vil definere dette peptid (som i tabel 1 for eksempel).
      4. Inkuberes cellerne ved 37 ° C i 1 time.
    2. Cellevask
      1. Der tilsættes 5 ml iskold (4 ° C) RPMI indeholdende 5% FCS til cellesuspensionen og resuspender cellerne ved at vende røret. Underlag forsigtigt cellesuspensionen med 3 ml iskold (4 ° C) FCS.
      2. Sedimentere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Brug langsom acceleration og bremsning at sikre grænsefladen FCS og cellesuspensionen opløsning holdes.
      3. Aspirer forsigtigt det RPMI og derefterFCS med en overførsel pipette, forlader de vaskede cellepelletter uforstyrret. Bemærk: Anvendelse af et FCS underlag at vaske cellerne med til at sikre så meget peptid opløsningen fjernes fra cellerne som muligt, og derved begrænse eksponering af cellepopulationer til flere frie peptider når celler puljet.
      4. Vask cellerne igen: Resuspender cellepellets i 10 ml 4 ° C RPMI indeholdende 5% FCS. Sedimentere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Hæld supernatanter.
      5. Pool alle cellepopulationer sammen til et enkelt rør med en pipette med 6 ml 4 ° C RPMI indeholdende 5% FCS. Sediment poolet cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Aspirer fra supernatanten med en overførsel pipette.
  6. CPD Cell mærkning
    Bemærk: På dette tidspunkt seks intra assay replikater kan genereres ved hjælp af mærkning peptidpulserede celler med 6 forskellige koncentrationer af byggevaredirektivet.
    1. Tilføj 11.4 ml 20 ° CRPMI indeholdende 5% FCS den poolede cellepellet og resuspender grundigt med en pipette.
    2. Tilføj 1,9 ml cellesuspension til 6, 10 ml rør mærket AF, tager sig den øverste halvdel af rørene ikke at våd.
    3. At mærke cellerne med CPD fjerne hætten og lægge røret vandret.
    4. Tilføj 92 pi PBS i den ikke befugtede del på toppen af røret, og denne tilføjelse lager CPD (se tabel 4 for den mængde stamopløsning tildelt til hvert rør).
    5. Sæt låg på røret og blandes cellesuspensionen med farvestoffet hurtigt og grundigt ved hvirvelbehandling.
    6. . Må trin 2.6.3-2.6.5 for stamopløsninger af CPD i de udpegede rør, der er beskrevet i tabel 4. Bemærk: I modsætning til CFSE og CTV koncentrationen CPD mærkning ikke præcist lineært relateret til den resulterende fluorescens intensiteten af mærkede celler, og så mærkningen koncentration anvendes til at opnå ækvidistante fluorescerende toppe af flere mærkede befolkninger har væretbestemmes empirisk (se tabel 4).
    7. Cellerne inkuberes i mindst 5 minutter ved stuetemperatur (20 ° C).
    8. Vask cellerne to gange: Resuspender cellerne til 10 ml med 20 ° C RPMI indeholdende 5% FCS. Sedimentere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 20 ° C. Aspirer fra supernatanten med en overførsel pipette. Gentag.
    9. Pool alle celler sammen til en enkelt rør ved hjælp af 8 ml 4 ° C RPMI indeholdende 5% FCS med en pipette. Sediment poolet cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C og aspireres supernatanten med transfer pipette.
  7. (Valgfri) PKH-26 Cell mærkning
    Bemærk: Hvis frihandelsaftaler ikke kan konstrueres med celler, der udtrykker en CD45 allotypisk forskel vært mus, kan de blive mærket med PKH-26 for at tillade deres diskrimination recipientceller.
    1. Tilføj 2,9 ml 20 ° C PBS til de sammenfattede cellepellet og resuspender grundigt med en pipette.
    2. Tilføj cellesuspension til et nejn fugtet 10 ml rør, der tager sig den øverste halvdel af røret ikke at våd.
    3. Fjern hætten og lægge røret vandret.
    4. Tilføj 58 ul fortyndingsmiddel C (i PKH-26 dye kit) til den ikke befugtede del på toppen af ​​røret, og til dette tilsættes 42 ul 1 mM stamopløsning PKH-26.
    5. Sæt låg på røret og blandes celle løsning med farvestoffet grundigt ved hvirvelbehandling.
    6. Cellerne inkuberes i mindst 10 minutter ved stuetemperatur (20 ° C).
    7. Vask cellerne to gange: Resuspender cellerne til 10 ml med 20 ° C RPMI indeholdende 5% FCS. Sedimentere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 20 ° C. Aspirer fra supernatanten med en overførsel pipette. Gentag.
  8. Injektion frihandelsaftaler i værtsdyr
    Bemærk: For at måle T-cellereaktioner in vivo, er frihandelsaftaler injiceres i dyr, der har en aktiv immunrespons og efterladt in situ i op til 24 timer. Det er afgørende, at frihandelsaftaler også injiceres i et naivt dyr som en negativ kontrol.
    1. Tæl og resuspender cellerne ved 2,5 x 10 8 celler pr ml i PBS. Injicer 200 pi celler intravenøst ​​i værten mus, herunder et naivt dyr som kontrol.

3.. Flowcytometri

  1. 18-24 timer efter FTA injektion høst blod eller milt (eller andre væv af interesse) fra værten mus.
  2. Forbered enkelt celle suspension fra væv ved mæskning gennem en 70 um gransket sigte med en 5 ml sprøjte stemplet.
  3. Resuspender celler på op til 65 x 10 6 celler / ml i PBS indeholdende 0,1% BSA.
  4. Doser 100 ul alikvoter af cellesuspension i brønde i en mikrotiterplade for antistof mærkning.
  5. Label celler med fluorokromkonjugerede mærkede antistoffer og fluorescerende levedygtighed prober med spektralt kompatibel fluorescens til CFSE, CTV og byggevaredirektivet. Bemærk: Antistoffer mod B-celle-markører, såsom B220 og aktivering markører, såsom CD69 er afgørende at måle celleaktivering B, hvis ved hjælp af FTEn til at måle T H-celle-responser 2. Medtag et antistof til CD45.1 og / eller CD45.2 hvis frihandelsaftaler og vært mus har en CD45 allotypiske forskel.
  6. Tilsæt 100 pi 2x stamopløsning af antistoffer / levedygtighed farvestoffer (i PBS indeholdende 0,1% BSA) til 100 ul alikvoter af celler, bland godt og inkuber på is (4 ° C) i 30 min.
  7. Vask cellerne: Sediment celler ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten. Resuspender celler i 200 pi PBS indeholdende 0,1% BSA, sediment cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten.
  8. Resuspender celler i et totalt volumen på 400 ul PBS indeholdende 0,1% BSA, filtrer celler gennem en 70 um mesh og analysere ved flowcytometri på et flowcytometer stand til at detektere de relevante fluorescerende farvestoffer og konjugater. Saml op til 3 x 10 6 lymfocyt arrangementer for at løse hver FTA celle klynge og få nok celler til statistiskcal analyse. Bemærk: Sørg for alle de typiske kontroller (som enlige farvede kontroller) til flowcytometri er beskæftiget. Typisk CFSE kræver excitation fra en blå laser kilde (typisk ved 488 nm) og påvisning med band pass filtre centreret over 520 nm; CTV kræver excitation fra en violet laser kilde (typisk ved 405 nm) og påvisning med band pass filtre centreret over 450 nm; og CPD kræver excitation fra en rød laser kilde (typisk ved 633 nm eller 640 nm) og påvisning med band pass filtre centreret over 670 nm.

4.. Dataanalyse

  1. Analyser flowcytometri data ved hjælp af standard flowcytometri software (se repræsentativt resultat for et eksempel på den type gating strategi beskæftigede).
  2. For% specifik drab, beregne antallet af celler i hver FTA celle klynge pulset med MHC klasse-I-bindende peptider og FTA klynger, der ikke var peptidpulserede ("Nil"), og ved hjælp af følgende formel til at beregne% Specifik Killing.
    % Specifik Killing Formula
    Bemærk: I ovenstående formel "primet" henviser til målene fra dyr, der menes at have en immunrespons mod målpeptideme, "naiv" henviser til målene fra naive dyr, "peptid" henviser til mål, pulset med peptider og "intet" refererer til målene ikke pulseret med eventuelle peptider.
  3. For celle aktivering B som et mål for T H aktivitet, beregne det geometriske gennemsnit fluorescensintensitet (GMFI) af CD69-antistof fluorescens på FTA B-celler pulset med MHC klasse II-bindende peptider i "primet" dyr og fra denne trække GMFI af CD69-ekspression på de tilsvarende FTA B-celler i "naive" dyr for at give et mål for T-H-aktivitet.
  4. Fra de statistikker, der genereres i trin 4.2 og 4.3, skal du brugematematisk regneark software som GraphPad Prism til at beregne andre kvantitative og kvalitative parametre som areal under kurven og EC 50 (en grundig beskrivelse af, hvordan disse beregninger er udført for AUC kan findes på
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm og for EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et eksempel på anvendelsen af ​​FTA assayet blev en BALB / c-mus immuniseret med rekombinant vacciniavirus (VV), der udtrykker HIV-I-epitoper (VV-HIV) og reaktioner på HIV-I CTL-epitoper, Gag, Gag mut, env og Pol VV CTL epitoper F2L og F2L mut og HIV-I T H-celle-epitop, Gag Th (som beskrevet i 2), blev vurderet ved hjælp af en 252 parameter FTA-assay (figur 1B). Epitop varianter af Gag (Gag mut) og F2L (F2L mut) ikke udtrykkes i VV-HIV vektor og derfor respons mod disse epitoper er reflekterende af epitop variant krydsreaktiv T-celle responser. Naive mus blev også injiceret med FTA som en negativ kontrol. Frihandelsaftalen blev diskrimineret fra host museceller ved PKH-26 mærkning og FTA B-celler diskrimineret af B220 antistoffarvning via flowcytometri (figur 1A og 1B). Hver af de 6 intra animalske replikater var gated baseret på CPD fluorescens (figur 1C (figur 1D). % Specifik Drab på hver gentagelse blev vurderet ved at sammenligne FTA klynge celledød i primet dyr i forhold til tilsvarende FTA klynger i naive dyr (figur 1D). T H aktivitet blev vurderet ved at sammenligne FTA B-celle opregulering af CD69 i primet dyr i forhold til tilsvarende FTA B-celle klynger i naive dyr (Figur 1E).

Fra denne analyse VV-HIV-infektion genererede kraftige CTL-responser mod den immunodominante epitop VV F2L, idet 100% af FTA målceller pulset med 0,001 mM eller mere af epitopen fjernes fra milten (Figur 2A). Der var også en kraftig reaktion genereret mod varianten af ​​F2L, F2L mut, idet 100% af FTA målceller pulset med 0,01 mM eller mere af epitopen fjernes fra milten. EftersomF2L mut ikke er til stede i det inficerende virus, er dette respons indikerer en epitop variant krydsreaktivt respons. Der var også en relativt moderat reaktion genereret mod mål, der udtrykker HIV Gag-epitop og en svag krydsreaktiv respons mod variant af denne epitop, HIV Gag mut. Der syntes at være ubetydelige respons genereres til HIV Pol og HIV Env CTL-epitoper.

Udover CTL responser, FTA eksempel analysen vist også målt T H svar ved at vurdere aktivering af FTA B-celle udtrykker HIV MHC klasse II-bindende epitop HIV Gag Th (figur 2B). Dette viste antigenspecifik B-celle-aktivering skete i primede dyr tyder generation af HIV Gag Th-specifikke T H celle effektorer.

Disse foranstaltninger af T-celle respons størrelsesorden kan sammenfattes ved at generere areal under kurve-værdierne (AUC) for hver af de epitoper (figur 2C), som MEAger den kumulative størrelse af reaktionen.

Ud over størrelsen af ​​antigen-specifikke og epitop variant krydsreaktive responser, FTA-analysen giver mulighed for funktionelle begærlighedsantistoffer målinger skal foretages. For eksempel, de effektive peptidkoncentrationer anvendes til at pulsere FTA målceller nødvendige for at give halv maksimal respons (EC 50), er vist for CTL effektorer (Figur 2D). Dette viste funktionelle aviditet til epitoper F2L Mut, HIV Gag og HIV Gag mut, var ca 10, 100 og 4.000 gange lavere, henholdsvis end svar genereret til den dominerende VV epitop F2L.

Tabel 1
Tabel 1.. Layout af en 252 parameter FTA. Typisk layout af en gengivelse af en 252 FTA består af 42 prøver / rør pulset med 7 forskellige peptidepitoper ved 6 different koncentrationer og herunder en un pulserende (Nil) prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tube nummer Volumen (ul) Dye lager (mM CTV) Endelig koncentration (uM)
37 0 0 0
38 17 0.053 0.451
39 17 0,197 1,48
40 17 0,73 6.21
41 17 2.7 23.
42 17 10 85

Tabel 2.. CTV lagre anvendes til at mærke celler. Volumen af børsnoteredeCTV materiel, der anvendes til at mærke celler i 2 ml at give den endelige mærkning farvestofkoncentrationen.

Tube nummer Volumen (ul) Dye lager (mM CFSE) Endelig koncentration (uM)
37-42 0 0 0
31 - 36 7 0.022 0.139
25-30 7 0,078 0,492
19-24 7 0,23 1.45
13-18 7 0,82 5.17
7-12 7 2.9 18.3
1 - 6 7 10 63.1

Tabel 3. CFSE lagre anvendes til at mærke celler. Volumen af børsnoterede CFSE bestand osed at mærke cellerne i 1,11 ml at give den endelige mærkning farvestofkoncentrationen.

Tube nummer Volumen (ul) Dye lager (mM CPD) Endelig koncentration (uM)
A 0 0 0
B 4. 0.053 0,106
C 6.3 0,197 0,62
D 7.5 0,73 2,74
E 7.3 2.7 9.86
F 7.7 10 38.5

Tabel 4. CPD lagre anvendes til at mærke celler. Volumen af børsnoterede CPD materiel, der anvendes til mærkning af celler i 2 ml at give den endelige labeling farvestofkoncentration.

Peptidkoncentration (uM)
MHC klasse I-bindende peptider 0 0,00002 0,0002 0.002 0.012 0.2 2
MHC klasse II-bindende peptider 0 3,29 9.88 29,6 88,9 266 800

Tabel 5.. MHC-klasse I og II-bindende peptid stamkoncentrationer. Typiske stamkoncentrationer 1 af peptid-epitoper, der anvendes til at konstruere en frihandelsaftale 1. Disse koncentrationer er 2x endelige koncentrationer anvendt til at pulsere målceller.

Figur 1 Fig. 1. Typisk flowcytometrianalyse af frihandelsaftaler. Splenocytter fra BALB / c-mus blev anvendt til at konstruere en 252 parameter FTA som beskrevet i teksten. FTA klynger blev pulset med 6 koncentrationer (som angivet i tabel 5) 7 forskellige virale epitoper, herunder MHC-klasse-I-bindende epitoper F2L (SPYAAGYDL, en L d-begrænset vacciniavirus (VV) epitop); F2L mut (SP G AAGYDL, en variant af F2L), Gag (AMQMLKETI, en Kd-begrænset HIV Gag epitop 4), Gag mut (AMQMLK D TI, en variant af HIV Gag 5), Pol (VGPTPVNII, en D d -begrænsede HIV-pol-epitopen 6) Env (RGPGRAFVTI, et Dd-begrænset HIV env epitop 7); og MHC-klasse-II-bindende peptid Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN en H-2 d-begrænsede HIV Gag-epitop 4). Frihandelsaftaler blev injiceret iv. i en BALB / c-mus, der var blevet inficeret intranasalt (i.) 6 dage tidligere med recombinant VV udtrykker HIV-epitoper (VV-HIV primet dyr). FTA blev også injiceret i naive mus som en kontrol. Efter 18 timer in vivo blev FTA celler til stede i splenocytsuspensioner fra værten mus analyseret ved flowcytometri. A) Typisk progressiv gating strategi til at identificere FTA celler, der viser porte for lymfocytter, slåbrokker og PKH-26 + FTA celler (det er også nyttigt at løse levende celler ved hjælp af en levedygtighed farvestof ligesom Hoechst 33258, ikke vist). B) 3D plot viser alle FTA klynger fra naive vært mus. C) Histogram plots viser FTA CPD fluorescens mærkning hver af de 6 intra dyr gentagelser. D) 2D plots viser en af ​​de 6 intra-animalsk FTA B-celle replikerer præsentere de forskellige typer og koncentrationer af epitoper fra naive og primede dyr. Dette viser fraværet af FTA-celler i primede dyr i forhold til det naive dyr, afslører "dræbe begivenheder"af CTL'er, der danner grundlag af frihandelsaftalen dræbe assay 1. E) Histogram analyse af FTA B-celle udtryk for aktivering markør CD69 i primet dyr i forhold til naive dyr, som danner grundlaget for frihandelsaftalen T-hjælper assay 2.. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Frihandelsaftaler muliggøre måling af størrelsen og aviditet T-cellereaktioner in vivo. En 252 parameter FTA blev anvendt til at vurdere T-celle-responser hos mus inficeret med VV-HIV, som beskrevet i fig. 1. A)% Specifik drab blev beregnet for alle CTL-epitoper og resultater fra hver af de 6 replicates vist (venstre panel) samt midler og standard fejl af midler (højre panel) vist. B) T H respons blev vurderet ved at måle aktivering af FTA B-celle præsentere HIV Gag Th-epitop for hver af de 6 intra dyr replikater ( venstre panel) og midler, og standardfejlen af midler (højre panel) beregnet. C) AUC målinger for% specifik drab (a), og T-hjælper reaktioner (b) blev beregnet som et mål for kumulativ størrelsesorden. d), EF 50 målinger blev beregnet for% Specifikke dræbende data (a) som et mål for funktionel aviditet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelen ved FTA-baserede analyser er, at de tillader diskrimination af> 250 levedygtige og fuldt funktionel mål cellepopulationer fra en enkelt værtsdyr ved flowcytometri. Dette giver en grad af kompleksitet til in vivo Flowcytometri baserede assays, som ikke har været muligt før. Dette fremhæves i de 2 dyreforsøg vist ovenfor, hvor reaktioner på 7 forskellige virale epitoper ved 6 koncentrationer kan overvåges i replikater af 6 samtidigt i et enkelt dyr tillader parametre såsom AUC og EC 50 skal bestemmes for T-celle responser in vivo .

Ud over at måle T-cellereaktioner in vivo, kan FTA-baserede assays modificeres til at måle responser in vitro 1. Dette væsentlige involverer tilføjelse frihandelsaftaler T-celler i kultur til at måle responser over flere timer in vitro. En mulig begrænsning til in vitro-assays under anvendelse af frihandelsaftaler er than tendens til de mærkede celler i frihandelsaftalen at overføre mærkning farvestof til omkringliggende celler 1, 3. Dette kan resultere i nedsat opløsning på FTA celleklynger som deres fluorescens bliver mindre tydelig mellem hver befolkningen. Dette er mere tydeligt i in vitro-assays sammenlignet med in vivo-analyser, fordi cellerne er i tæt nærhed til de længere perioder in vitro-analyser. Dette tab i løsningen af FTA cellepopulationer kan minimeres i in vitro-assays ved at reducere kulturen tid af frihandelsaftaler med effektor T-celler, og ved hjælp af frihandelsaftaler, der har en mindre målcellelinier populationer, der har en større mængde af "fluorescerende rum" mellem dem, så at farveoverførsel har mindre effekt.

Vi har også bemærket tab i løsningen af FTA cellepopulationer når frihandelsaftaler blev placeret in vivo for 48 timer 1. Dette synes at være resultatet af mål-B-celler i FTA proliferating og derved reducere farvestoffluorescens intensitet. Dette er sandsynligvis en følge af B-celler udgør modsvarende antigen til antigen-specifikke effektor-CD4 + T-celler, der resulterede i B-celle-stimulering. Det anbefales derfor, at analysen begrænses til ~ 24 timer eller mindre, når B-celle-mål bliver overvåget.

Evnen til at mærke flere (> 96) unikke celleklynger fluorescens er blevet rapporteret tidligere ved hjælp af faste ikke-levedygtige celler 8. Den farvning af levende celler har imidlertid været mere problematisk med tilgængeligheden af kompatible vitale farvestoffer, og kun 8-12 levedygtige celler klynger er opnået tidligere 9. Evnen til at generere> 250 entydigt fluorescensmærkede levedygtige og velfungerende celler rapporteret her, bygger på egenskaberne af CFSE-lignende vitale farvestoffer. Flere af disse farvestoffer, som CTV og CPD, er først for nylig blevet tilgængelige. Disse farvestoffer har karakter af at være i stand til atmærkning af celler med et højt fluorescens-intensitet, er, at lang levetid og af lav varians 3. Disse egenskaber kombineret med det faktum, at der er et lineært forhold (især i tilfælde af CFSE og CTV) mellem koncentrationen af ​​farvestoffet anvendes til mærkning og fluorescensintensitet af de mærkede celler betyder, at celler kan være mærket med flere (op 7 vist her) intensiteterne af farvestof, der let kan skelnes ved flowcytometri. Da endvidere fluorescensemission CFSE CPD og CTV har minimal spektral overlapning, kan de anvendes i kombination til at mærke celler, således at op til> 250 fluorescerende celle signaturer påvises ved flowcytometri. Det skal bemærkes, at for at opnå mærkning af celler med dette antal skelnelige fluorescerende signatur, er det vigtigt, cellemærkning udføres hurtigt 10, 11 (for at generere lav fluorescens varians), og i en passende buffer indeholdendefrie aminer 3 (til buffer farvestof toksicitet, som ellers kan forekomme med disse farvestoffer ved høje koncentrationer). Det er også afgørende, at under erhvervelse af frihandelsaftaler ved flowcytometri at fejlagtige udsving i begivenhed fluorescens overvåges (for eksempel ved at måle CFSE, CTV og / eller CPD fluorescens intensitet over tid). Dette er vigtigt, fordi sådanne udsving i tilfælde fluorescens, der skyldes maskinen indført fejl kan resultere i fejlagtig fortolkning af korrekt målcelle klynge positionering, som til gengæld kan resultere i fejl i de endelige mål for T-celle-effektorfunktion. Sådanne flowcytometer indført fejl kan begrænses ved at sikre høj kvalitet prøver fremstilles (især opmærksom filtrering celler gennem en 70 um mesh for at minimere tilstopning af strømningstekniske linjer i flowcytometeret af store celleaggregater), og at flowcytometeret vedligeholdes til en høj standard.

Måling af T-celle responser in vivoer blevet udført i mange år ved hjælp af vitale farvestoffer, såsom CFSE at overvåge målceller død in vivo 12. Typisk disse analyser, har dog kun været i stand til at overvåge op til 7-8 forskellige target-celler på en gang 13, og så give en begrænset kapacitet til at vurdere drab af mål, der udtrykker flere koncentrationer af flere epitoper, der normalt kræves for at generere en detaljeret vurdering af parametre såsom funktionelle aviditet af T-celle responser. I denne henseende kan tetramer dissociation assays anvendes til at tilvejebringe et mål for T-celle-aviditet fra frisk isolerede effektor T-celler 14-16. Denne teknik, måler dog MHC / TCR bindende grådighed, og så er ikke en komplet afspejling af funktionel grådighed, som også kan afhænge af ændringer i strukturen af det immunologiske synapse og staten af T-celle signalering komponenter 17. Ideelt set ville derfor funktionel aviditet kræver dosis-respons-forsøg skal udføres. Deter blevet opnået tidligere ved hjælp af in vitro-teknikker, såsom 51Cr-release assay, intracellulære cytokin farvning assay 18, 19 eller ELISPOT-analyse 20, 21. Disse teknikker imidlertid ofte kræve effektor T-celler til at blive stimuleret in vitro, som kan ændre den samlede funktionelle aviditet af befolkningen 22. Frihandelsaftalen assays derfor tilbyder en forbedring i forhold til eksisterende teknikker, måling af CD4 + T-celle-og CD8 + T-celle dosis-respons in situ, i realtid mod flere epitoper samtidigt, og så yde en værdifuld tilføjelse til de eksisterende teknikker til at måle T-celle effektorfunktion. Vi forventer, at brugen af ​​FTA-teknologi kan blive værdifulde i screening immunterapi strategier designet til at generere kvalitet T-celle responser høje, såsom vacciner rettet mod HIV-1 og hepatitis C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af projekttilskud # 1010395 (BQ og KP) og # 525.431 (CR), og et program Grant # 455.395 (KP) fra Sundhed og Medical Research Council i Australien, en australsk Center for hepatitis og HIV Virologi EOI National 2012 tilskud (CR og RJJ) og en bevilling fra Gordon og Grete Bootes Foundation (BQ og CR). Vi vil gerne takke Harpreet Vohra og Michael Devoy for deres fremragende vedligeholdelse af JCSMR FACS laboratorium, den australske Cancer Research Foundation Biomolekylær Resource Facility, JCSMR, ANU, for peptid syntese, og Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien for at give de stiftende HIV-vaccine bestande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Sigma R8758
Fetal calf serum Serana FCS-500
CTV Invitrogen C34557
CFDA, SE Invitrogen C1157
CPD eBioscience 65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5 eBioscience 110730
anti-CD69 brilliant violet 605 Biolegend 104529
PKH-26 Sigma PKH26GL-1KT
Vortex Scientific Industries Inc
Centrifuge Eppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) BD Bioscience

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Tags

Immunologi Investigative Techniques T-celle respons flowcytometri Multiparameter CTL assay Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylesteren (CFSE) CellTrace Violet (CTV) Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD)
Anvendelse af fluorescerende Skud Arrays for Vurdering af T-celle respons<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K.,… More

Quah, B. J. C., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo. J. Vis. Exp. (88), e51627, doi:10.3791/51627 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter