Summary
监测体内详细的T细胞应答的能力，对于我们的免疫应答的理解的发展非常重要。在这里，我们描述了评估同时采用流式细胞仪> 250参数体内 T细胞检测使用荧光目标阵列（自由贸易协定）的。
Abstract
监测T细胞应答在体内的功能是对我们的免疫应答的理解的发展和免疫疗法的设计很重要。在这里，我们描述了使用的荧光目标阵列（FTA）技术，它利用活体染料，如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），紫激光激发的染料（CellTrace紫罗兰：CTV）和红色激光激发的染料（细胞增殖染料eFluor 670：CPD ）以组合性标签小鼠淋巴细胞为> 250分辨荧光细胞簇。这些自由贸易协定内细胞团可以是脉冲与主要组织相容性复合体（MHC）I类和MHC II类结合肽，从而作为靶细胞对CD8分别+和CD4 + T细胞。这些FTA细胞保持存活，功能齐全的，并且因此可以被施用到小鼠体内，以允许的CD8 + T细胞介导的杀伤FTA靶细胞和CD4 + T细胞预谋HEL的评估FTA B细胞的靶细胞的对实时体内通过流式细胞术。因为> 250靶细胞可以一次进行评估，该技术允许对多个抗原表位的T细胞应答的若干浓度和在多次重复的监控。因此，该技术可以在两个定量（ 如累积响应的幅度）和定性（ 例如 ，功能性抗体亲抗原性和响应的表位的交叉反应性）水平测量T细胞应答。本文中，我们描述了如何将这些自由贸易协定的构造，并给予他们如何可以应用于评估诱导的重组痘病毒疫苗的T细胞反应的例子。
Introduction
T细胞发挥的适应性免疫应答的核心作用，并且通常针对操作在免疫治疗。通过分泌细胞因子，调节免疫力的许多方面，也可以直接帮助B细胞制造抗体外来抗原的CD4 +效应T细胞反应。 CD8 +细胞毒性T细胞（CTL）还可以以外来抗原通过分泌细胞因子以及打在直接杀伤细胞中表达外来抗原核心作用作出响应。发起这些T细胞的效应子功能的基本相互作用涉及T细胞受体（TCR）与细胞表面上显示的MHC分子外来肽的相互作用。 CD4 + T细胞识别的抗原呈递细胞和CD8 + T细胞的MHC-II类分子的肽显示的认识上是通常显示在微生物感染细胞的MHC-I类分子的肽显示。
为了以评估的作用的T细胞在免疫反应中发挥，其效应子功能是通过可靠和灵敏的技术来测量它是必不可少的。 T细胞反应评估常用的方法包括; MHC class-I/II/peptide四聚体反应;细胞因子的产生通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色;并通过51 Cr释放测定杀伤能力。这些测定法，但是，通常是进行先体外后体内与体外刺激，或提供有限的洞察T细胞的功能。理想的情况下，测量T细胞应答时，将所发生的，与无处理的T细胞，从而避免通过体外刺激，可能会发生变化的功能参数是有利的，以评估它们的原位 ， 在体内 。一些最常用的体内 T细胞功能测定法中使用是基于测量的CTL介导的杀伤脉冲与I类MHC结合肽的靶细胞，所列举的体内通过他们的检测通过与重要的染料如CFSE荧光标记。虽然这些类型的测定可以监视的CTL介导的杀伤的目标时，它们发生在体内 ，他们以前有一个相对有限的能力来评估杀灭的多个目标呈现不同浓度和不同类型的肽表位，这是必需的，以允许定性参数，例如作为功能性抗体亲抗原性和特异性表位变体的交叉反应性进行评估。这些检测也没有提供对CD4 + T细胞介导的反应的任何信息。
为了克服许多与用于评估的T细胞反应当前方法的局限，我们最近开发了一种基于荧光的目标阵列（自由贸易协定），它同时允许T细胞反应的监测对> 250靶细胞在一个动物由多重检测流式细胞仪1，2。自由贸易协定是由淋巴细胞标记的SEV像CFSE，CTV和CPD活体染料允许产生独特的荧光> 250细胞团ERAL浓度和组合。由于这些细胞保持活力和功能齐全的，它们可以被注射到动物，让监控它们的相互作用与效应性T细胞在体内3。例如，在FTA细胞簇可与MHC I类结合肽进行脉冲，让抗原特异性的CTL介导的杀死靶细胞1的评估。另外，在FTA细胞团，也可与MHC II类结合肽脉冲，使抗原特异性T辅助细胞（T H）通过评估活化（通过激活标记物如CD69，CD44和/或评估活动的评估CD62L的自由贸易协定中的B细胞轴承同源肽2）。因为超过250个目标可以同时检测，也可以对测量脉冲具有n个多靶细胞簇的CTL和T H的反应umerous肽在不同浓度及加入许多重复的。因此，自由贸易区法提供的体内 T细胞效应反应评估了前所未有的水平。
在这里，我们详细描述了自贸区的建设和展示如何将它们应用到评估在体内的 T细胞反应。该过程描述通过使用三个重要的染料，包括6重复脉冲与MHC I类和II-结合肽42细胞团组成的252分辨细胞簇一个自贸区的建设。 42细胞簇标记出现在10ml锥形底管，它是有帮助的，如表1中所示来放置这些在一个试管架上。该方法可用于更小的数字可辨别的集群根据需要通过降低标记的量来调节各染料进行1。
我们强调检测的实用程序，通过展示它如何衡量RESPONS通过重组痘病毒接种在一个小队列小鼠的多个表位产生的ES。这显示了自由贸易协定法可用于通过，测量累计反应和功能分别亲和力，曲线下面积（AUC）评估和产生半数最大反应（EC 50）所需的有效肽浓度测量的使用面积。
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Protocol
注：此协议下使用小鼠据澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会的小鼠的指导方针和处理颈椎脱位处死。
1，染料和肽制剂
- 染料的制备
注：染料被预稀释的不同浓度，以允许细胞在离散荧光强度标记。 CFSE是用在通过3.5倍连续稀释制成浓度7，和CTV和CPD用于在6个不同的浓度，通过3.7倍连续稀释制成（ 见表2-4）。股票的浓度在表2-4中列出的染料将被用来在表2-4中列出的最终染料浓度来标记靶细胞。染料在暴露于水溶液中反应。因此，重要的是小瓶平衡至室温开口，以减少染料的接触缩合之前。- CFSE
注意：CFSE被购买作为二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA，SE;分子量557.47），通常在25毫克/瓶。- 悬浮CFSE 25毫克在4.48毫升DMSO中，得到10mM的储备溶液。
- 连续稀释CFSE加入35微升10mM的CFSE库存到87.5微升的DMSO中，并用稀释的贮存液重复此给每个染料的浓度在表3中 。
- CTV
注意：CTV在9小瓶，每一个都可以与10微升的DMSO中复溶，以产生染料的10mM的溶液包通常购买。- 重组，集中CTV的所有9小瓶90微升的DMSO给一个10毫米的解决方案。
- 连续稀释CTV加入11微升10mM的CTV库存到29.7微升的DMSO中，并用稀释的贮存液重复此给每个染料浓度在表2中 。
- 持续专业发展
注：CPD（MW 792.6）是典型的LY购买的0.5毫克/瓶。- 63毫升DMSO中得到一个10毫米重悬浮液0.5毫克的CPD。
- 连续稀释CPD：加入11微升10毫CPD股票为29.7微升DMSO中，用稀释的原液重复此给每个染料浓度见表4。
注意：上述的染料股可以存储在-20℃下数个月，无功能显著损失可以解冻和再冷冻数次。
- CFSE
- 肽制剂
注意：MHC I类结合肽通常用于脉冲的靶细胞在6个不同的浓度，用10倍稀释液从1μM的（ 表5）的起始浓度进行。 MHC II类结合肽通常用于脉冲的靶细胞在6个不同浓度，使用3倍稀释度从400μM（ 表5）的起始浓度进行。每个肽是由在PBS这样的临屋区的2倍终浓度吨每肽浓度为250微升的最小容积。肽的股票可以事先向FTA建设来制备并储存于-20℃下无功能显著损失。- 准备股票的MHC I类结合肽
- 准备每个肽抗原表位的最高浓度为2微米的储备液（2×1微米）
- 连续稀释的MHC I类结合肽：加入44.4微升2微米肽原液为400微升PBS。重复此用稀原液，得到每种肽的浓度在表5中 。
- 准备股票的MHC-II结合肽
- 准备每个表位肽的浓度最高为800微米的储备液（2×400微米）。
- 连续稀释的MHC-II结合肽：加入150μl的800微米肽溶液为300微升PBS。重复此用稀原液，得到每种肽的浓度在表5中
2。FTA准备
注意：下面的步骤概述包括细胞6种不同浓度（ 即 42细胞团。）反复6次，以产生252可辨别的细胞簇脉冲具有7种不同的抗原表位肽的自贸区的建设。在每个重复，没有脉冲与任何表位（无）的细胞群，包括作为对照。它是有利于自由贸易协定具有CD45同种异型差异从宿主动物，以允许从受体细胞的鉴别由抗体标记，在分析的时间。否则自由贸易协定可以带有其它染料如PKH-26用于此目的（在步骤2.6中所述）。通常情况下，自由贸易协定的准备过程，从开始进行时一口气完成。
- 标签42，将10毫升的锥形底的塑料管1-42（如表1中的例子）。
- 细胞的制备
- 分离脾和/或鲤鱼门公园hnodes从小鼠。通过一个70微米的糖化制备自组织单细胞悬液细孔筛用5毫升注射器柱塞，并用血细胞计数器计数细胞。
- 重悬细胞于高达200×10 6个细胞/ 11.5毫升罗切斯特公园纪念研究所1640（RPMI，或等同物）含有5％胎牛血清（FCS）的毫升。注：使用一个缓冲高胺含量为染料的毒性最小化到细胞3是很重要的。
- CTV标签
注：细胞最初标记为6的浓度CTV的。- 彻底颠倒离心管几次重悬细胞。加1.9毫升细胞悬液至6 10 ml离心管标记为37-42的，小心不要弄湿管的上半部分。
- 与CTV标记细胞，取出管帽和水平打下管。
- 加入83微升PBS，以在管上方的非接液部分，并把它添加17微升股票CTV的（见表乐2的量原液被分配给该管）。注意：非润湿的管是很重要的，以防止与染料溶液的细胞悬浮液的运动和细胞溶液的过早混合。
- 盖上管和涡旋快速彻底混合细胞悬液，用染料。
- 重复步骤2.3.2-2.3.4为CTV在表2中说明的指定管中的储备溶液。
- 孵育细胞至少5分钟在室温（20℃）。
- CFSE标记
- 视标记后，加入5 ml RPMI的含5％FCS，每管和由涡旋令其充分悬浮细胞。
- 从管37传送1 ml的细胞悬液，以管31，25，19，13，07和1。
- 从管38传送1 ml的细胞悬液，以管32，26，20，14，08和2。
- 从管39传送1 ml的细胞悬液至离心管，33，27，21，15，09和3中。
- 从管40传送1 ml细胞的悬浮液至管34，28，22，16，10，和4。
- 从管41传送1 ml的细胞悬液的试管35，29，23，17，11，和5。
- 从管42传送1 ml的细胞悬液，以管36，30，24，18，12，和6
注意：小心不要在步骤2.4.1.1-2.4.1.6湿管的上半部分。
- 为了用CFSE标记细胞，取出管帽和水平打下管。
- 加103毫升的PBS中，以在所述管上方的非润湿的部分，并把它添加7毫升库存CFSE（ 参见表3的量原液被分配给该管）。
- 盖上管和涡旋快速彻底混合细胞悬液，用染料。
- 做在表3中说明的指定管为原液的CFSE的步骤2.4.2-2.4.4。
- 孵育细胞至少5分钟在室温（20℃）。
- 洗涤细胞：稀释细胞悬液，用9ml 20℃RPMI含5％FCS，沉淀通过离心分离，在300×g离心10分钟，在20℃，通过抽吸去除上清液用移液管。
- 视标记后，加入5 ml RPMI的含5％FCS，每管和由涡旋令其充分悬浮细胞。
- 肽脉冲和细胞清洗
注意：在细胞已被标记为CTV和CFSE，它们是脉冲与MHC I类和/或类MHC-II分子结合肽（在1.2的方法制备）。一个细胞群，也不得用肽（ 例如 ，无在表1中）的脉冲，并用作阴性对照的T细胞应答的计算。- 肽脉冲
- 将细胞再悬浮于250微升的RPMI含5％FCS的总体积。注意：通常将50μl细胞悬浮液保持在上清液在步骤2.4.7的端部的抽吸之后，因此添加200μl的培养基对细胞沉淀。
- 加入250μl的预先制备的肽库（如表5中），以适当地指定管（如表1），并河畔e来包括PBS的对照管单独加入而不肽作为一个零控制。
- 混合的细胞悬浮液用旋涡。注意：每种肽的表位，每个肽浓度被分配给单个管和关键是此记录清楚的基础上，细胞在该管的预期荧光，由于该群集的荧光签名将限定该肽（如表1例如）。
- 孵育的细胞，在37℃下反应1小时。
- 细胞洗涤
- 加入5 ml冰冷的含5％FCS的细胞悬浮液和悬浮细胞通过反相管（4℃）的RPMI。仔细底图细胞悬液用3毫升冰冷（4℃）FCS的。
- 通过离心在4℃下沉淀细胞，在300×g离心10分钟使用慢加速和制动，以确保FCS的接口和细胞悬浮液的溶液被维持。
- 小心吸过的RPMI然后用移液管在FCS，而使洗涤细胞沉淀不受干扰。注意：使用一个FCS底图洗细胞，有助于确保尽可能多的肽溶液被从细胞尽可能地除去，从而限制细胞群体暴露于多种游离肽时，细胞被汇集。
- 再次洗涤细胞：重悬细胞沉淀物在含5％FCS加入10ml 4℃RPMI中。通过离心在4℃下沉淀细胞，在300×g离心10分钟倒出上清液。
- 池中的所有细胞群汇集成使用含5％FCS6毫升4℃RPMI吸管单管。沉淀池的细胞通过离心分离，在300×g离心10分钟，在4℃下抽吸去除上清液用移液管。
- 肽脉冲
- CPD细胞标记
注意：此时6内重复测定可通过标签肽脉冲的细胞会产生6种不同浓度的持续专业发展。- 添加11.4毫升20℃含5％FCS的汇集细胞沉淀重悬彻底用移液管的RPMI。
- 加1.9毫升细胞悬液至6，10 ml离心管标记为AF，小心不要弄湿管的上半部分。
- 与CPD标记细胞，取出管帽和水平打下管。
- 加入92微升PBS，以在管上方的非接液部分，并为此增加股票持续专业发展（ 见表4原液分配给每个管的数量）。
- 盖上管和涡旋快速彻底混合细胞悬液，用染料。
- 。千万步骤2.6.3-2.6.5的持续专业发展的在表4中所述的指定管股票的解决方案注：与CFSE和CTV，防贪处标示浓度不能精确线性相关标记的细胞所产生的荧光强度，所以用来获得几个标记种群的等距荧光峰的标记浓度一直凭经验确定（ 见表4）。
- 孵育细胞至少5分钟在室温（20℃）。
- 用含5％FCS 20℃的RPMI重悬细胞至10 ml：洗涤细胞两次。通过离心分离，在20℃下沉淀的细胞在300×g离心10分钟抽吸去除上清液用移液管。重复。
- 池的所有单元汇集成使用含5％FCS的用移液管8毫升4℃RPMI单个管。沉淀池的细胞通过离心分离，在300×g离心10分钟，在4℃下，吸离上清液用移液管。
- （可选）PKH-26细胞标记
注意：如果自由贸易协定不能与细胞表达CD45的一个异型差异来承载小鼠构建，它们可以被标记为与PKH-26，以允许从受体细胞的鉴别。- 加2.9毫升20℃PBS中汇集的细胞沉淀并用移液管重悬浮彻底。
- 加入细胞悬液，以无Ñ润湿10毫升管，小心不要弄湿管的上半部分。
- 取下管盖和水平打下管。
- 加入58微升稀释液C（在PKH-26染料套件），以在管上方的非接液部分，并把它添加42微升的1毫米的股票PKH-26。
- 盖上管，彻底涡旋混匀细胞溶液与染料。
- 孵育细胞至少10分钟，在室温（20℃）。
- 用含5％FCS 20℃的RPMI重悬细胞至10 ml：洗涤细胞两次。通过离心分离，在20℃下沉淀的细胞在300×g离心10分钟抽吸去除上清液用移液管。重复。
- 自由贸易协定注入到宿主动物
注意：为了测量在体内的T细胞应答，自由贸易协定被注入到具有一个活跃的免疫反应，并留在原地长达24小时的动物。至关重要的是，该自由贸易协定也被注入到一个幼稚的动物作为阴性对照。- 计数和重悬的细胞以每毫升2.5×10 8个细胞于PBS中。注入200微升细胞静脉注射到宿主小鼠，其中包括一个天真的动物作为对照。
3，流式细胞仪
- 自由贸易协定后注射收获血液或脾（或其他感兴趣的组织）从主机小鼠18-24小时。
- 通过一个70微米的糖化制备单细胞悬液，从组织细孔筛用5毫升注射器的柱塞。
- 重悬的细胞在含有0.1％BSA的PBS中达到65×10 6个细胞/ ml。
- 免除细胞悬液100μL分装成一个微量滴定板抗体标记的水井。
- 标记细胞荧光标记的抗体和荧光探针的可行性与频谱兼容荧光CFSE，CTV和CPD。注：抗体对B细胞标记，如B220和活化标记物，如CD69是必不可少的，如果使用FT测量B细胞活化一种测量T H细胞反应2。包括抗体CD45.1和/或CD45.2如果自由贸易协定和主机的小鼠有CD45异型差异。
- 加入100μl的抗体/活力染料2倍原液（PBS中含0.1％BSA）对细胞的100微升等分拌匀，在冰上孵育（4℃）30分钟。
- 离心300×g离心5分钟，在4℃下沉积的细胞，取出上清液：洗涤细胞。通过离心重悬细胞于200μl的PBS中含有0.1％BSA，沉积物的细胞在300×g离心5分钟，在4℃，并除去上清液。
- 将细胞再悬浮在400微升PBS中含有0.1％BSA，过滤器单元通过一个70微米的筛网，并通过流式细胞术在流式细胞仪能够检测有关的荧光染料共轭物和分析的总体积。收集到3×10 6细胞的活动，以解决每个FTA细胞群，并获得足够的细胞进行统计学卡尔分析。注意：确保所有典型的控件（如单染对照组）进行流式细胞就业。通常情况下，CFSE需要激励来自蓝色激光源（通常为488 nm）和检测与集中在520 nm的带通滤波器;视需要激励从紫激光源（通常在405 nm）和检测与集中在450 nm的带通滤波器;和CPD需要激励从红色激光光源（通常为633纳米或640纳米）和检测与集中在670 nm的带通滤波器。
4，数据分析
- 分析流式细胞仪用标准的流式细胞术软件数据（见代表性的结果为门控策略中使用的类型的一个例子）。
- 为％特异性杀伤，计算细胞的脉冲与MHC I类结合肽和FTA簇的未肽脉冲（“无”），每个FTA细胞簇的数目，并使用以下公式来计算％比杀害。
％比杀害
注意：在上述公式中“底漆”，是指从目标被认为具有针对靶肽的免疫应答的动物，“幼稚”是指从幼稚的动物对象，“肽”是指脉冲与肽和“无”目标是指未用任何肽冲激的目标。 - 对B细胞活化的T H活性的量度，计算对脉冲与在“底漆”的动物的MHC-II结合肽并从该相减的GMFI FTA B细胞的CD69抗体荧光的几何平均荧光强度（GMFI）在相应的自贸区B细胞在“天真”的动物给的T H活性的测量值CD69的表达。
- 从在步骤4.2和4.3，使用生成的统计信息数学的电子表格软件如的GraphPad棱镜计算其他定量和定性参数，如根据曲线和EC 50区（在深入介绍如何将这些计算的AUC执行可以在这里找到
http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm，以及EC 50：http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index。 HTM？reg_the_ec50.htm）。
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Representative Results
由于使用了FTA测定的一个例子，一个BALB / c小鼠进行免疫接种的重组牛痘病毒（VV）的表达HIV-I表位（VV-HIV）和响应的HIV-CTL表位，加格，加格MUT，的env和聚合物，该VV CTL表位F2L和F2L MUT和HIV-T H细胞表位，加格钍（如2所述）通过使用252参数FTA测定法（ 图1B）进行评估。加格（GAG MUT）和F2L（F2L MUT）的表位变异并不表示在VV-HIV载体，因此对这些表位的反应是反射性的表位变异交叉反应性T细胞反应。幼稚小鼠也注入与FTA作为阴性对照。在FTA从宿主小鼠细胞PKH-26标记和FTA B细胞通过流式细胞术（ 图1A和1B）由B220抗体染色鉴别区分。根据CPD荧光（ 图1C各6动物内重复被选通图1D）的各种浓度的FTA目标。每个重复的％比杀戮是由相对于相应的FTA集群天真的动物（ 图1D）引物的动物比较自由贸易区集群的细胞死亡评估。 T H活性是通过在相对 于对应的FTA B细胞簇在幼稚的动物（ 图1E）引发的动物比较，CD69的FTA B细胞上调评估。
从这样的分析，VV-HIV感染产生对免疫VV抗原决定簇F2L强烈的CTL反应，用脉冲与0.001毫米以上的脾脏（ 图2A）被删除的表位的自贸区的靶细胞的100％。也有人对F2L的变体形式，F2L MUT，具有脉冲与0.01毫米或更从脾脏被移除的表位的FTA靶细胞的100％产生强烈的反应。自F2L MUT是不存在于感染的病毒，这表明反应的表位变体的交叉反应性应答。也有反对的目标表达了艾滋病病毒的Gag抗原决定簇产生一个相对温和的反应和对这种抗原决定簇，艾滋病毒的Gag MUT的变异形式有轻微的交叉反应性反应。似乎有产生艾滋病毒聚合酶和HIV包膜CTL表位可以忽略不计的回应。
除了CTL反应，表明自贸区为例分析还测量了T H的反应通过评估自贸区的激活B细胞表达的HIV的MHC-II结合表位艾滋病病毒的Gag钍（ 图2B）的。这表明抗原特异性B细胞活化发生在催芽动物暗示新一代的HIV Gag的钍特异性T H细胞的效应。
T细胞应答强度，这些措施可以概括为每个表位（ 图2C）的MEA下生成曲线值（AUC）面积SURES响应的累积幅值。
除了抗原特异性和抗原表位变体的交叉反应性应答的大小，在FTA测定允许进行功能性亲合力测量。例如，用于脉冲，得到半最大响应（EC 50）所需的FTA靶细胞的有效的肽浓度，示出了在CTL效应（ 图2D）。这显示功能亲和力的抗原决定簇F2L MUT，艾滋病毒Gag和Gag的病毒MUT，分别为约10，100和4000倍降低，分别比产生的主要VV表位F2L反应。
表1的 252自由贸易区的一个复制包括在6微分脉冲与7种不同的抗原表位肽42个样本/管的252参数的自贸区。典型布局布局吨浓度和包括联合国脉冲（无）样品。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 管数 | 体积（μl） | 染料行程（mm CTV） | 最终浓度（μM） |
| 37 | 0 | 0 | 0 |
| 38 | 17 | 0.053 | 0.451 |
| 39 | 17 | 0.197 | 1.48 |
| 40 | 17 | 0.73 | 6.21 |
| 41 | 17 | 2.7 | 23 |
| 42 | 17 | 10 | 85 |
表2中视股票用于标记细胞。体积上市CTV库存用于标记在2ml细胞，得到最终的标签的染料浓度。
| 管数 | 体积（μl） | 染料行程（mm CFSE） | 最终浓度（μM） |
| 37 - 42 | 0 | 0 | 0 |
| 31 - 36 | 7 | 0.022 | 0.139 |
| 25 - 30 | 7 | 0.078 | 0.492 |
| 19 - 24 | 7 | 0.23 | 1.45 |
| 13 - 18 | 7 | 0.82 | 5.17 |
| 7 - 12 | 7 | 2.9 | 18.3 |
| 1 - 6 | 7 | 10 | 63.1 |
表3。CFSE股用于标记细胞。音量上市股票CFSE我们编辑标注在1.11毫升细胞，得到最终的标签染料浓度。
| 管数 | 体积（μl） | 染料行程（mm CPD） | 最终浓度（μM） |
| 一 | 0 | 0 | 0 |
| 乙 | 4 | 0.053 | 0.106 |
| Ç | 6.3 | 0.197 | 0.62 |
| ð | 7.5 | 0.73 | 2.74 |
| Ë | 7.3 | 2.7 | 9.86 |
| F | 7.7 | 10 | 38.5 |
表4。CPD股用于标记细胞。体积用于标记细胞在2ml，得到最终贴标机上市CPD股票的克染料浓度。
| 肽浓度（μM） | |||||||
| MHC I类结合肽 | 0 | 0.00002 | 0.0002 | 0.002 | 0.012 | 0.2 | 2 |
| MHC II类结合肽 | 0 | 3.29 | 9.88 | 29.6 | 88.9 | 266 | 800 |
表5。MHC-I类和II-结合肽股票浓度。典型的股票浓度1用来构建一个自贸区1肽表位。这些浓度的2倍用于脉冲的靶细胞的终浓度。
图1：典型的流式细胞仪自由贸易协定的分析。从脾细胞免疫BALB / c小鼠作为文本描述来构造一个252参数自由贸易协定。 FTA簇被脉冲的7个不同的病毒表位，包括MHC I类结合表位，F2L（SPYAAGYDL，一L的d-限制的牛痘病毒（VV）的表位）与6浓度（如表5中列出）; F2L MUT（SP 摹 AAGYDL，F2L的一个变种），加格（AMQMLKETI，A K D-限制性HIV Gag的抗原决定簇4），加格MUT（AMQMLKÐTI，艾滋病毒GAG 5的变种），波尔（VGPTPVNII，一个D D限制艾滋病病毒抗原表位POL 6），信封（RGPGRAFVTI，一个D D-限制性HIV包膜抗原表位7）;和对MHC II类结合肽的Gag T H（PVGEIYKRWIILGLN中，H-2 D-限制性HIV Gag的抗原表位4）。自由贸易协定进行了静脉注射。成已滴鼻6天与早期感染REC（ 英寸 ）一个BALB / c小鼠ombinant VV表达HIV抗原决定簇（VV-HIV，催芽动物）。自贸区也被注入天真的小鼠作为对照。 18小时后在体内 ，自贸区的细胞存在于脾细胞悬浮液从主机小鼠流式细胞仪分析A）典型的渐进式门控战略，以确定自贸区的细胞显示闸门淋巴细胞，汗衫及PKH-26 +细胞自由贸易协定（它也是有帮助的使用可行性像染料33258赫斯特解决活细胞，未显示）。 二）3D绘图显示所有自由贸易协定集群从幼稚主机的鼠标。C）直方图显示自贸区CPD荧光标记每个6内动物的复制D）2D绘图显示6内的动物自由贸易区B细胞的一个复制从幼稚和底漆的动物呈现的不同类型和表位的浓度。这说明不存在自由贸易协定细胞在底漆动物相对于天真的动物，揭示“杀人事件”由形成活化标志CD69在催芽动物相对幼稚的动物，从而形成了自贸区T辅助法2的基础的自贸区B细胞表达的自由贸易协定杀伤实验1 E）直方图分析的基础上的CTL。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2。自由贸易协定使体内的T细胞应答的程度和亲和力的测定。甲252参数FTA被用作在图1中描述的，以评估在感染了V V-HIV小鼠T细胞应答A）％特异性杀伤计算对于所有的CTL表位和结果从各6重所示（左图）以及手段和方式的标准误差（右图）所示B）T H响应plicates通过测量激活自贸区B细胞呈现艾滋病毒GAG的Th表位为每6个动物内重复的（评估左图）和手段和方式的标准误差（右图）计算。C）的AUC测量％特异性杀伤（a）和T辅助应答（b）项计算作为衡量累计幅度D）乳油50测量计算为％特异性杀伤数据（一）为功能亲和力的量度。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
的FTA为基础的检测的优点在于，它们允许从流动的单一宿主动物术> 250可行的和全功能的靶细胞群的判别。这提供了复杂性的一个级别一直未能前体内流式细胞仪为基础的分析。这是在上面所示的2动物实验，其中反应7不同的病毒表位，6的浓度可在6次重复同时在一个单一的动物允许将用于体内的T细胞应答所确定的参数如AUC和EC 50监视高亮。
除了 测量T细胞应答在体内 ，在FTA为基础的检测可以被修改体外 1以测量反应。这主要涉及自由贸易协定增加T细胞在培养过几个小时在体外测量响应。一个潜在的限制使用的FTA 体外为基础的检测是叔他倾向自由贸易协定内的标记细胞的标记染料转移到周围的细胞1,3。这可能导致在FTA细胞簇的分辨率降低它们的荧光变得每个群体之间不太明显。这是在相对 于体内试验在体外测定法更为明显，因为细胞在的时间在体外试验中的较长时期附近。这个损耗在FTA细胞群的分辨率可以在体外试验中通过减少FTA的培养时间与效应T细胞，并通过使用具有该有更大量的“荧光灯空间”它们之间具有更少的靶细胞群体的FTA被最小化，以便该染料转移具有更少的影响。
我们也注意到损失FTA细胞群的分辨率时，自由贸易协定被放置在体内 48小时1。这似乎是自贸区prolife内靶B细胞的结果等级，从而减少染料的荧光强度。这很可能是B细胞呈递抗原的同源抗原特异性效应CD4 + T细胞，导致B细胞刺激的结果。因此，建议当〜B细胞目标正在监测24小时或更少，该测定法的限制。
标记多个（> 96）独特的细胞团的能力荧光先前使用固定的非活菌8报道。活细胞的染色，但是，已经越来越成问题与兼容活体染料的可用性，并且只有8-12的存活细胞群以前已经9实现。生成此报告> 250独特的荧光标记的活力和功能细胞的能力，依赖于CFSE般的活体染料的性质。几个这些染料，如彩电和CPD，最近才变得可用。这些染料具有能够的特性具有高荧光强度标记细胞，也就是长寿命和低方差3。这些属性加上一个事实，即有用于标记和标记的细胞的荧光强度的色素的浓度之间的线性关系（特别是在CFSE和CTV的情况下），意味着细胞可以标示有多个（最多到7所示，可以通过流式细胞术很容易地区别各染料的）强度。此外，由于CFSE的荧光发射，CPD和CTV有最小的光谱重叠，可以将它们组合使用以标记细胞，从而使被流式细胞仪检测到> 250细胞的荧光签名。应当指出的是，为了实现细胞的可辨别的荧光签名这个数目的标签，它是重要的细胞标记被迅速执行10，11（以产生低荧光方差），并在含有合适的缓冲液游离胺3（缓冲可与这些染料浓度高，否则会发生染料的毒性）。同样重要的是自由贸易协定获得通过流式细胞仪事件荧光是错误的波动过程中进行监控（例如通过测量CFSE，中视和/或CPD荧光强度随着时间的推移）。这很重要，因为这种波动事件的荧光是由于机器引入的错误可能会导致正确的靶细胞群的定位，这反过来可能导致T细胞效应功能的最终反倾销措施错误的误解。例如流式细胞仪引入的误差可以通过确保高品质的样品制备（特别注重通过70微米的筛网过滤细胞通过大细胞聚集最小化流式细胞仪在流动的流体线路闭塞）和流式细胞仪保持在限于高标准。
在体内的T细胞应答的测量已经执行了使用活体染料如CFSE监测靶细胞死亡在体内 12多年。通常，这些实验，然而，一直只能够监控多达7-8不同的靶细胞一次13等提供了有限的能力来评估杀害的目标表达多种浓度的多个表位的那些通常需要产生一个详细的评估，参数，如T细胞应答的功能性亲合力。在这方面，四聚体解离测定可用于提供从新鲜分离的效应T细胞14-16的T细胞亲合力的量度。该技术中，然而，测量MHC / TCR结合亲合力，因此是不实用的亲和力的完全反射，它也可以依赖于免疫突触的结构变化和对T细胞信号转导元件17的状态。因此，理想情况下，功能性亲合力，需要的剂量 - 反应实验来进行。这先前使用体外技术，如51 Cr释放测定中，细胞内细胞因子染色分析18，19或ELISPOT测定20，21已经完成。这些技术，但是，通常需要的效应T细胞在体外被刺激，这可以改变人口22的整体功能性亲合力。自贸区试验，因此，提供了一个改进现有的技术，同时测量CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的剂量-反应原位 ，在对多个表位实时性，所以提供了一个有价值的除了现有的技术来测量T细胞效应子功能。我们预计，利用自贸区的技术有可能成为设计产生高品质的T细胞反应，如疫苗针对HIV-1和C型肝炎筛检免疫治疗策略宝贵
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由项目资助＃1010395（BQ与CP）和＃525431（CR）和项目资助＃455395（CP）来自澳大利亚，澳大利亚的中心为肝炎和HIV病毒学意向书的国家健康和医学研究委员会的支持2012赠款（CR和RJJ）和戈登和格莱特牧夫座基金会（BQ和CR）的资助。我们要感谢HARPREET Vohra保持和迈克尔Devoy其出色的保养JCSMR流式细胞实验室，澳大利亚癌症研究基金会生物分子资源设施，JCSMR，澳大利亚国立大学，用于多肽合成，和大卫博伊尔博士，CSIRO动物健康实验室，澳大利亚Geelong提供家长HIV疫苗的股票。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
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