Summary
Введение малых молекул в развивающемся эмбрионе дрозофилы имеет большой потенциал для характеризующие биологическую активность новых соединений, наркотиков и токсинов, а также для зондирования основных путей развития. Методы, описанные здесь, наметить шаги, которые позволяют преодолеть естественные барьеры для такого подхода, расширение полезность модели дрозофилы эмбрионов.
Abstract
Drosophila эмбрион уже давно мощным лабораторная модель для выяснения молекулярно-генетических механизмов, которые управляют развитием. Легкость генетических манипуляций с этой модели вытеснил фармакологические подходы, которые широко распространен в других животных моделях и клеточных анализов. Здесь мы опишем последние достижения в протокол, который позволяет применение малых молекул в развивающиеся плодовой мушки эмбриона. Метод детали шаги для преодоления непроницаемости яичной скорлупы при сохранении жизнеспособности эмбриона. Eggshell пермеабилизации в широком диапазоне от стадии развития достигается за счет применения описанного ранее D-лимонен эмбриона проницаемости растворителя (EPS 1) и старения эмбрионов при пониженной температуре (18 ° C) до лечения. Кроме того, использование дальним красным красителем (Cy5) в качестве индикатора пермеабилизации описано, который совместим с последующих применений, включающих стандартный красный и зеленый гриппorescent красители в живых и фиксированных препаратах. Этот протокол применяется в исследованиях с использованием биологически активных соединений для исследования механизмов развития, а также для исследований, направленных на оценку тератогенным или фармакологическую активность неохарактеризованных малых молекул.
Introduction
Drosophila эмбрион продолжает оставаться одним из ведущих модель для исследования фундаментальных механизмов развития 2. Это мощная модель поддерживается широкий спектр молекулярно-генетических инструментов, которые позволяют манипуляции практически любого гена в любой момент времени и в любой развивающейся органа. Небольшой размер, быстрое развитие, а также обширные характеристика морфогенеза эмбриона дрозофилы сделать его модель выбора для генетических экранов, многие из которых раскрыты фундаментальные онтогенетических путей 3,4. Многочисленные фенотипы в зародыше дрозофилы были охарактеризованы и легко интерпретируемых, часто предоставляя средства идентификации основные молекулярные генетические механизмы, ответственные за ненормального признака.
Исторически сложилось так, недостатком модели эмбриона мухи была трудность введения небольших молекул для эмбриональных тканей. Это препятствие поставил ограничения на: 1) насING известные биологически активные малые молекулы в качестве зондов допросить механизмы развития и 2) с помощью этой сложившейся модели для оценки тератогенным или фармакологическую активность неохарактеризованных малых молекул. Как следствие, скрининг потенциал летучей эмбриона было недостаточно в характеристике активности малой молекулы.
Доставка малых молекул в летучей эмбриона может быть достигнуто с двумя способами: 1) проницаемости яичной скорлупы и 2) микроинъекции. В данной статье представлены авансы методом проницаемости, которые легко выполнить в условиях обычного Drosophila лаборатории. Следует отметить, что последние достижения в методах микроинъекций с микрофлюидики технологии также способствует способов введения соединений в эмбриона 5,6. Введение в молекулы эмбриона предотвращается восковым слоем скорлупы 7. Drosophila яичной скорлупы состоит из пяти слоев. Отнаизнанку они: желточной оболочки, восковой слой, внутренняя хорионический слой, endochorion и exochorion 8. Три внешних хориона слои могут быть удалены путем краткого всплытии эмбриона в разбавленной хлорной извести, шаг называют dechorionation. Подвергается восковой слой может затем быть нарушена под воздействием органических растворителей, таких как гептан и октан 7,9, что делает dechorionated эмбрион проницаемой, пока он остается заключен в основной желточной оболочки. Тем не менее, использование этих растворителей вводит осложнения из-за их токсичности и трудности в регулировании их решительные меры permeabilizing, оба из которых имеют сильнейшие негативные последствия для жизнеспособности эмбриона 9,10.
Способ проницаемости с использованием композиции называют эмбриона пермеабилизации растворитель (EPS) был описан ранее 1. Этот растворитель состоит из D-лимонен и растительного происхождения, поверхностно-активные вещества, которые позволяют растворитель быть misciblе с водных буферах. Низкая токсичность д-лимонен и способности разбавить растворителем в требуемой концентрации дала эффективный способ для генерации проницаемые эмбрионов с высокой жизнеспособности 1. Однако два эндогенные факторы по-прежнему приводить ограничения к применению. Во-первых, эмбрионы продемонстрировать неоднородность проницаемости после EPS лечения, даже когда осторожность, чтобы поддерживать тесные постановку развития. Во-вторых, эмбрионов старше примерно восьми часов доказали, трудно проницаемыми, в соответствии с упрочнения яичной скорлупы, которое происходит после откладки яиц 11.
Описанный здесь достижения в методе EPS, что: 1) содействие в выявлении и анализе почти одинаково проницаемыми эмбрионов, даже после фиксации и Иммуноокрашивание шаги были выполнены и 2) позволяют пермеабилизации эмбрионов на поздних развития временных точках (> 8 ч, этап 12 лет и старше). В частности, применение дальним красным красителем,Cy5 карбоновой кислоты, описано, что служит индикатором проницаемости, который сохраняется в эмбрионе во время разработки и после формальдегида фиксации. Кроме того, показано, что выращивание эмбрионов при 18 ° С сохраняет яичную скорлупу в чувствительной государства EPS, позволяя пермеабилизации поздних эмбрионов на стадии (стадий 12-16).
Эти достижения преодолеть ранее упомянутые ограничения в методологии EPS. Таким образом, эта программа будет оказывать следователям с помощью ввести небольшие молекулы, представляющие интерес для эмбриона на отдельные развития временных точках, сохраняя жизнеспособность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Fly культур, решений и эмбрионов обрабатывающих устройств
- Подготовить клетку культуру дрозофилы. Поместите 500 + спаривания мух желаемого напряжения в популяции клетку, снабженную 10 см винограда-агар пластины и пятно дрожжевого теста. Поддерживать культуру в 25 ° C Влажность контролируемой инкубатора. ПРИМЕЧАНИЕ: Кейдж культуры требуют день или два кондиционирования получить последовательные эмбриона укладки узоры. Виноградные пластины с дрожжевой пастой меняются один раз утром и один раз вечером во время выдержки.
- Подготовка EPS. Теплые решения ПАВ (кокамид DEA и этоксилированный спирт) при 37 ° С. Внесите 18 мл д-лимонен в стеклянной сцинтилляционный флакон, снабженный небольшим мешалкой. Внесите 1 мл каждый из двух поверхностно-активных веществ (5% конечная концентрация каждого) до Д-лимонен. Тщательно перемешать и снять мешалку. ПРИМЕЧАНИЕ: Это исходный раствор EPS хорошо в течение приблизительно 2 месяцев при комнатной температуре. РешениеСледует нагревали при 37 ° С и вращают, чтобы полностью растворить поверхностно-активных веществ перед использованием. EPS и D-лимонен следует хранить в стеклянной емкости, поскольку они растворится некоторые пластмассы с течением времени.
- Подготовка эмбрион dechorionation решение, инкубационных сред, краситель и решения наркотиков. Смешайте 25 мл отбеливателя с 25 мл H 2 O и место в неглубокую посуду. Подготовка модифицированный основной инкубационный среды (MBIM) и MBIM-T в соответствии с предварительного рецепта 1,12. Подготовка Шилдс и Sang M3 клеточной среде культуры и PBS в соответствии с протоколом производителя (см. список материалов). Подготовка исходного раствора пермеабилизации красителя в 10 мМ концентрации в ДМСО.
- Соберите эмбрион-обрабатывающие устройства и материалы:
- Подготовка dechorionation и корзину EPS лечения (см. рис 1А). Отрежьте 3 см раздел одноразового 50 мл полипропиленовой центрифуги / пробирку с мелкими зубьями пилы. Сделать сварочного поверхности флеш потерев раздел трубки на наждачную бумагу, приклеенныйк настольной поверхности. Weld сечение трубы, чтобы NITEX нейлоновой сетке путем расплавления край отрезка трубки над пламенем и нажав на сетке на стеклянную пластину. Дайте остыть и обрезать дополнительную сетку. ПРИМЕЧАНИЕ: отвесные бортов и днища позволяют быстрого и полного промывания от остаточного отбеливателя и EPS на соответствующих этапах. Шаги сварочные следует проводить под вытяжкой.
- Подготовка корзинку развития. Отрежьте верхнюю часть 50 мл центрифуги / пробирку заподлицо с ободом крышки. Удалить и изменить крышку путем вырезания центральное отверстие и пазы по окружности, как показано на рисунке 1b. Прикрутите крышку над сеткой и на резьбу отрезать сечению трубы и отделка дополнительный сетку. ПРИМЕЧАНИЕ: крышка содержит выемки в ободе, что разрешить диффузии с объемной среде, когда они расположены в 60 мм водохранилища блюдо (рис. 1В ').
- Подготовьте компоненты слайд камеры. Вырежьте квадрат DO мембраны, размер которых превышаетслайд камера открытие. Нанесите очень тонкий слой вакуумной смазки к внутренней кромке отверстия. Прикрепите мембрану DO в отверстие уплотнительного его против жира с фиксирующим кольцом. Обрежьте излишки DO мембрану за счет сокращения его обратно близко к фиксирующим кольцом. ПРИМЕЧАНИЕ:. Технические требования к слайд-камеры можно найти в Kiehart др. 13 Эта камера не является коммерчески доступных и требует специального изготовления с помощью механического цеха.
2. Постановка, Dechorionation и EPS Лечение эмбрионов
- Постановка эмбрионов путем приурочен коллекции. Установите свежий виноград / дрожжей пластину к лету культуры клетке в AM. Разрешить эмбрионов, которые будут установлены в течение 1 часа при 25 ° С. Сбросьте эту пластину и заменить свежим винограда / дрожжей пластины для последующего эмбриона прокладке 2 ч при 25 ° С Соберите эту пластинку и место в 18 ° С инкубатор для дальнейшей постановки развития. Примечание: 1 час развития при 25 ° С равна 2 ч. развитияпри 18 ° C. Эффект старения при 18 ° С против 25 ° С на поддержание EPS пермеабилизации в конце эмбрионов на стадии можно видеть на рисунке 2.
- Dechorionation. Аккуратно промойте эмбрионов от виноградного пластины в сетчатую корзину, используя 25 ° C водопроводной воды и кисть. Промыть избыток дрожжей от эмбрионов в корзине под слабой струей водопроводной воды. Погрузите корзину в 50% гипохлоритом натрия в течение 2 мин. Вымойте эмбрионов тщательно под струей воды из-под крана. ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно шприц раствор отбеливателя на зародышах периодически с помощью пластиковой пипетки. В то время как 2 мин, как правило, достаточно для полной dechorionation, на этот раз инкубации должны быть проверены прямого допроса и соответствующим образом скорректированы. Поддержание dechorionated эмбрионов в корзине, погруженной в водопроводной воде и немедленно перейти к шагу EPS.
- EPS Лечение
- Подготовка шесть 60-мм чашки с примерно 10 мл ФБС в каждом. Подготовить разведение EPS путем растворения 75 мкл EPS в 2,925 мл MBIM (1:40) в 50 мл стеклянном стакане с закрученной. Примечание: белая эмульсия формы из этой смеси.
- Блот избыток воды из нижней части корзины сетки с лаборатории салфеткой. Погружают корзины в разбавленных EPS в химический стакан и сразу вихревой разойтись эмбрионы в растворе EPS в нижней части корзины. Продолжить закрученного движение в течение 30 сек. ПРИМЕЧАНИЕ: EPS разведения и время экспозиции может изменяться контролировать проницаемость. Рекомендуется, чтобы оптимальные EPS разведения и время обработки быть установлено эмпирически с штаммов мух используются. Увеличение времени экспозиции 60-90 сек благоприятен для стадии 12 и более старых эмбрионов.
- Удалить корзины, промокните нейтрализуют избыточные EPS с лабораторией уничтожить. Продолжайте шести последовательных промываний в 10 мл PBS в 60 мм чашки. С помощью пластиковой пипетки осторожно шприц эмбрионов с PBS в каждую из шести стирок. Продолжать красить и шаги наркологические. ПРИМЕЧАНИЕ: EPS могут быть утилизированы в раковину.
3. Краска и лекарствами Лечение проницаемыми эмбрионов
- Краска Лечение
- Добавьте 5 мкл 10 мМ Cy5 краситель кислота * карбоновой в 1 мл MBIM-T (50 мкМ конечная концентрация) в 1,5 мл пробирке и вихревые перемешать. ПРИМЕЧАНИЕ: * Выбор красителя зависит от нисходящего анализа. Cy5 карбоновой кислоты является эффективным для последующего анализа с помощью фиксации и иммуноокрашивания. Родамина B полезен для анализа живых эмбрионов. Красный излучение родамина В, а зеленый выброс его метаболитов 1, может представлять определенные трудности с последующих применений с использованием флуоресценции. Наркотиков или токсин может быть добавлен в раствор краски, чтобы начать лечение на этой стадии, или ограничить обращение наркотиков / токсина в импульс на данном этапе. Следует проявлять осторожность в обращении и утилизации лекарств и токсинов в соответствии с MSDS и стандартов экологической безопасности.
- Трансфер эмбрионов из корзины сетки к решению красителя помощью кисти. Закройте пробирку крышкой и инвертировать несколько раз, чтобы убедиться,эмбрионы в свободное плавание, взвешенная в раствор краски. Поместите трубку на нутационное качалке в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Удалить трубку от nutator и пусть эмбрионы урегулировать. Удалить раствор красителя с тонкой пипетки и заменить 1 мл MBIM-T для мытья. Обратить трубки повторно приостанавливать эмбрионов полностью. Пусть эмбрионы решить и повторить еще три MBIM-Т стирок. Удалите все MBIM-T от окончательного полоскания и перейти к стадии инкубации.
- Инкубационный для развития эмбриона
- Трансфер эмбрионов к одному из двух палат: Корзина развитие или слайд камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Корзина развитие является предпочтительным для более длительных периодов развития, и не требуется, если последующие фиксации и Иммуноокрашивание шаги должны быть выполнены. Слайд камера является оптимальным для покадровой съемки с большим разрешением и является наиболее эффективным для коротких периодов развития (например, ранних эмбриональных событий). Drug или токсин может быть добавлен в среду в различных концентрациях и эмбриона DАЗВИТИЕ можно отслеживать в режиме реального времени с живыми эмбрионами или в конечной точке с помощью стандартного фиксацию и иммуноокрашивания протоколы.
- Развитие в корзины
- Очистите корзины развития, впрыскивая с 70% этанола, тщательно промыть деионизированной водой и промокните насухо протрите лаборатории. Подготовка 6 мл инкубационной среды с требуемой концентрации препарата или токсина. Поместите корзины развития в среде, в 60 мм блюдо заботясь, чтобы не пузырьки воздуха ловушку под основанием сетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Два СМИ широко используются: в одиночку MBIM или MBIM/M3 в 50:50, причем последний более эффективен в течение более длительных периодов развития.
- Трансфер проницаемыми эмбрионов сетка поверхность в базе корзины с кистью. Аккуратно шприц эмбрионов со средствами массовой информации из окружающего пласта. Дисперсные эмбрионов с помощью кисти, чтобы они были в монослое на сетке. ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к визуализации микроскопии и оценивать пермеабилизации и жизнеспособности характеристики пр.eparation (см. шаг 4).
- Развитие в Slide палаты
- Инверсия слайд камеру и применить небольшую полоску вакуумной смазки по периметру отверстия. Поместите 150 мкл среды с желаемым количеством препарата или токсина на поверхности DO мембраны в открытии. ПРИМЕЧАНИЕ: Два СМИ широко используются: в одиночку MBIM или MBIM/M3 в 50:50, причем последний более эффективен в течение более длительных периодов развития.
- Трансфер проницаемыми эмбрионов к падению СМИ с кистью. Дисперсные эмбрионов делает их поселиться на мембраны внутри капли.
- Осторожно применять 25 мм круговой покровное над отверстием таким образом уплощения среды. Нажмите вниз осторожно по периметру покровное для формирования уплотнения с жиром. ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к микроскопии изображений для оценки проницаемости и жизнеспособности характеристики подготовке (см. шаг 4).
4. Identiкация проницаемыми жизнеспособных эмбрионов
- Определить проницаемыми эмбрионов. Соблюдайте эмбрионов под эпифлуоресцентной с микроскопа, снабженного цифровой камеры. Получение изображений (в синей волны для определения профиля желток аутофлюоресценция) нескольких полей с помощью фиксированного микроскоп и настройки камеры.
- Определите пермеабилизации эмбрионов на основе относительной интенсивности флуоресценции. Используйте стереомикроскопа с большим рабочим расстоянием для размещения корзинку и позволить манипуляции эмбрионов. Микроскоп должен быть оснащен программируемым стадии XYZ, эпифлуоресцентной освещения и цифровой камеры. Изображение эмбрионы, заботящиеся записывать экспозиции и параметры положения этап каждого эмбриона изображение, чтобы позволить переоценку тех же эмбрионов на более позднем этапе (см. представительный результат на рисунке 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Модели поглощени красител будет варьироваться в зависимости от используемого красителя, продолжительности воздействия и эмбриона возраста. Широкий спектрпоглощения красителя через одном препарате характерно и отражает изменение в степени проницаемости.
- Определить жизнеспособных эмбрионов. После маркировки положение пермеабилизированных эмбрионов, продолжить развитие эмбриона при комнатной температуре или 25 ° С. Вернуться корзины или слайд-камеру с микроскопом. Соблюдайте под синей флуоресценции канала и приобрести имидж желтка автофлуоресценции в ранее выявленных пермеабилизированных эмбрионов. Оценка жизнеспособности в соответствии с нормальным развитием распределения желтка (см. Рэнд и др.. 1 и характерный результат, на рисунке 3). ПРИМЕЧАНИЕ: Другие морфологические особенности эмбриона, наблюдаемой с светлого микроскопии может быть использован для оценки жизнеспособности. Рекомендуется, чтобы установить уровень проницаемости, который совместим с жизнеспособностью быть определены эмпирически с каждым красителем и штамма, используемого лету.
- Оцените наркотиков или токсинов эффекты в пермеабилизированных жизнеспособных эмбрионов.
- Эмбрионы процеSSED с выше протокол готовы для ряда обычных анализов после препарата или токсина воздействия. Некоторые из различных видов анализа рассматриваются в обсуждение ниже и включают непосредственное наблюдение формообразования в живых эмбрионов, а также пост-фиксация иммуноокрашивание анализов. Оба этих подхода усиливаются использованием витальных красителей (например, GFP), которые показывают генные паттерны экспрессии и клеточной линии и профили морфологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обработки эмбрионов устройства изображены на рисунке 1 для оказания помощи в визуализации "самодельные" устройства для манипулирования в вышеуказанных протоколов. Результаты видно на рисунке 2 иллюстрируют надежную эффект воспитания эмбрионов при 18 ° С от их способности быть проницаемыми по EPS на поздних стадиях развития. Это условие применяется на стадии протокола 2.1. Эффективность красителя Cy5 карбоновой кислоты, чтобы выявить различные уровни проницаемости обычно видели в EPS обработанные эмбрионов видно на рисунке 3. Динамика развития распределения красителя в желтке также видно на рисунке 3, открывая критерий, используемый для оценки жизнеспособности , как описано в Протоколе шагу 4.2. Полезность Cy5 красителя в определении эмбриона пермеабилизации последующей обработки для токсина, формальдегида фиксации и иммунным окрашиванием иллюстрируется результате на рисунке 4.
Рисунок 1. Обработки эмбрионов устройства для метода EPS. Плоским дном корзины используется в dechorination и EPS шаги экспозиции (A, A '). Корзина разработка используется для более длительных экспозиций развития эмбриона из проницаемыми (B, B '). Слайд камера используется для коротких экспозиций развития и более высокое разрешение визуализации живых эмбрионов (C, C '. См. текст для дальнейшего описания).
Рисунок 2. Влияние старения при 18 ° С в EPS эффективности в конце эмбрионов на стадии. Эмбрионы были собраны в течение двух часов с последующим старением при 18 ° С в течение 20 часов (Панели AA ",
Рисунок 3. Включение Cy5 в проницаемых и жизнеспособных эмбрионов. Эмбрионы собирали при 25 ° С в течение 2 ч и выдерживали в течение 14 ч при 18 ° С (эквивалент 7-9 час эмбрионов при 25 ° С, стадии 12). После dechorination, EPS лечение было сделано (1:40 в MBIM в течение 1 мин) с последующей инкубацией в Cy5 красителя (50 мкм MBIM-T в течение 15 мин). Эмбрионы промывали три раза в MBIM-T и переданы в корзину развития с MBIM в резервуаре. Разработка давали рroceed в течение 8 часов при комнатной температуре. Поглощение Cy5 (красный) изображается в дальней красной канала сразу после лечения красителя и промывки (Панель А) и после 8 развития ч (панель В). Распределение желтка рассматривается автофлуоресценции в синем канале. Краска поглощение, следовательно, проницаемость, видно, чтобы отличаться от эмбриона до эмбриона. Cy5 краситель (красный) видно, чтобы локализовать желтка (синий), который становится концентрируют в просвете кишечника на этапе 16 (фиолетовый, панель B).
Рисунок 4. Определение проницаемости и метилртути эффектов в фиксированных и иммуноокрашиванию эмбрионов. Эмбрионы были собраны при 25 ° С в течение 2 ч и выдерживали в течение 14 ч при 18 ° С (эквивалент 7-9 час эмбрионов при 25 ° С, стадии 12). После dechorination, EPS лечение было сделано (1:40 в MBIM в течение 1 мин) с последующей инкубацией вCy5 краситель (50 мкМ в MBIM-T в течение 15 мин) вместе с метилртути (50 мкМ MeHg, панель В) или управления (0,1% конечная концентрация, панель А) ДМСО растворителя. Эмбрионы промывали MBIM-T и помещают в корзину развития с MBIM: M3 среда в резервуаре и выдерживали в течение дополнительных 8 часов при комнатной температуре. Эмбрионы затем фиксировали в двухфазной 4% параформальдегида-гептан подготовки по стандартному протоколу 14. Окрашивание проводили с анти-Fasciclin II (зеленый в A, B и белой в А ', В') для обозначения моторных нейронов и анти-Elav антитела (красные в A, B), чтобы маркировать все нейрон клеточных тел. Cy5 краситель раскрывается путем прямого флуоресценции, которая требует длительного воздействия в связи со снижением интенсивности флуоресценции из-за фиксации (Cy5 является псевдо-синего цвета на всех панелях). Последствия MeHg видны в неправильной паттерна и clusteкольцо из боковых органов хордотональные нейрон клеток (Elav-положительных, маркированные красным и обозначается с белыми стрелками на B по сравнению с А). Кроме того, характерной разветвление сегментарной (SN) (сплошные зеленые стрелки в А ') Видно, что сильно варьирует с MeHg воздействия (сплошные зеленые стрелки в B ") в соответствии с ранее описанной последствий MeHg на эмбриона 15. Проекция межсегментных и сегментарной нервы на их корнях видны смещаться кзади с MeHg экспозиции (открыта зеленая стрелка в В '). Примечание: Метилртуть является мощный нейротоксин. Следует проявлять осторожность, чтобы носить перчатки и защиту для глаз при работе. Утилизация должна осуществляться через институциональной объекта экологической безопасности и сервиса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный выше метод описывает средства для получения жизнеспособных эмбрионов Drosophila, которые доступны для малых лечения молекулы через широкий диапазон развития. Этот метод вводит новый и простой вывод, что старение эмбрионов при 18 ° С позволяет пермеабилизации поздних эмбрионов на стадии с той же эффективностью, как ранее видели только в эмбрионов ранних стадий. Кроме того, использование дальним красным красителем Cy5 карбоновой кислоты в качестве индикатора проницаемости доказал свою эффективность в пост-исправления приложений и не мешает с обычными красными и зелеными флуоресцентными маркерами, которые можно использовать для выявления фенотипов развития. Эти данные значительно продвинуть эффективность и полезность метода EPS.
Этот метод поддается анализу как живых, так и препаратов фиксированных эмбрионов. Использование светлое микроскопии и слайд-камеру настроить, характерные черты забьют в первой половине эмбрионального развития являются морфогенетические движения, такиеcellularization из бластодермы, головной борозды образования, germband удлинения и germband отвод 1. С GFP или RFP журналистами более конкретные конечные точки можно различить, например, ранние образцы сегментации и формирования нейронных структур в дальнейшем развитии 1. GFP и RFP отчеты также позволяют наблюдение событий развития в живой проницаемыми эмбрионов как в слайд-камеры и развития препаратов корзину. Простой метод для определения валового токсичность прикладного препарата или химического является контроль за картиной желток белка автофлуоресценции в синем канале, чтобы определить задержку или прекращение развития 1.
Методология EPS также имеет большой потенциал для расширения следственные инструменты для не-моделей насекомых, в частности комаров, который разделяет подобную архитектуру яичной скорлупы. Применение малых молекул в зародышах других видов насекомых откроет аллею investigatiот того, где стандартные генетические подходы к функциональных исследований в настоящее время нет. Эмбрионы, разработанные в корзинах могут быть обработаны для формальдегида фиксации, поэтому открытие анализы на широкий спектр иммуноокрашивания реагентов, доступных для исследований Drosophila. Тем не менее, этот шаг требует, чтобы определение пост-фикс пермеабилизации быть возможным соотнести фенотипы с эмбрионами, которые были сделаны доступными для препарата. Применение Cy5 красителя карбоновой кислоты оказалось весьма эффективным для такого подхода. Cy5 карбоновой кислоты эффективно поглощают в пермеабилизированных эмбрионов (рис. 3А). В процессе разработки Cy5 концентрируют в желтке, который в конечном счете поглощенных в просвете кишки формовочной на этапе 14, а затем (фиг.3В). После фиксации флуоресценции Cy5 заметно уменьшилась, но надежно обнаружить в кишечнике и служит в качестве маркера этих эмбрионов, которые были проницаемыми эффективно с самого начала (см. представительные RESии рис. 4). Следует отметить, что обнаружение Cy5 на этом этапе требует более длительных экспозиций камеры (например, 1-4 секунд) для обнаружения. Таким образом, забив фенотипов с рисунком иммуноокрашивания может протекать с использованием сигнала Cy5 для подтверждения подобным проницаемыми эмбрионов вместе с ткани специфических маркеров (например, нейронных специфических антител показано на рисунке 4).
Самой большой проблемой в этом методе является чувствительность жизнеспособности эмбриона в процессе пермеабилизации, то, что уже давно беспокоила предыдущие попытки развить этот метод 9,10,16. Жизнеспособность после пермеабилизации является резко зависит от возраста, и резко возрастает старше эмбрион на пермеабилизации 9. Тем не менее, как мы показали ранее, проницаемость становится все труднее с возрастом 1. В недавнем докладе сейчас демонстрирует способность проницаемыми поздно эмбрионов этап (14), повторно вызывая гепатитTane в качестве растворителя в сочетании с д-лимонен 17. Широкий полезность этого последнего способа не ясно, как только один эффект препарата характеризовался (нокодазол) и применение к более ранним эмбрионов на стадии не было описано 17. Кроме того, применение 18 ° шагом развития С описанной выше урожайности поздней стадии проницаемости и далее избегает использования токсичных органических растворителей. Следователь кто является новым для протокола EPS будут испытывать изменчивость в пермеабилизации и жизнеспособности результатов при первоначальном попыток. Действия, описанные здесь дают следователю инструменты систематически изменяться условия пермеабилизации лечения и последующих этапов инкубации для оптимизации условий для конкретных штаммов дрозофилы они работают в собственной лабораторных условиях.
Дополнительной проблемой с методом является изменчивость химического поглощения видно из эмбриона эмбриона. Эта изменчивость отражается в неоднородностиПоглощение Cy5 краситель видел у эмбрионов сразу после лечения красителя (рис. 3А). В противоположность этому, родамин краситель более быстро и равномерно рассредоточены по эмбриональных тканей, чем Cy5 красителя (рис. 2В »). Таким образом, некоторая изменчивость эмбрион к эмбриона может быть питал в распределительных свойств химической, лекарства или токсина интереса и является неотъемлемой частью метода. Где количественное определение дозы имеет решающее значение, рекомендуется, чтобы поглощение препарата или токсина интереса характеризуется через альтернативного метода анализа. Тем не менее, легкость выше протокола, а также возможность для скрининга сотни эмбрионов, позволяет следователю оценить ответы дозы и забить характерные фенотипы с небольшими инвестициями ресурсов, что делает для мощного первого подхода к характеризующих наркотиков или токсинов в этот высокоразвитой модель системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
