قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub> و</sub>) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال
Summary
يمكن قياس الاسموزي معامل نفاذية المياه (P و) من خلايا تساعد على فهم الآليات التنظيمية من aquaporins (AQPs). P و في تقرير كروية protoplasts الخلية النباتية المعروضة هنا ينطوي protoplasts العزلة والتحليل العددي من معدل الأولي للحجم التغيير نتيجة تحديا الاسموزي أثناء مستمر نضح حمام.
Abstract
دراسة آليات التنظيم AQP أمر حاسم لفهم العلاقات المائية في كل من الخلوية والمستويات مصنع كامل. المقدمة هنا هو طريقة بسيطة وفعالة جدا لتحديد ناضح معامل نفاذية المياه (P و) في protoplasts النبات، المعمول بها في المبدأ أيضا على خلايا كروية أخرى مثل الضفدع البويضات. الخطوة الأولى للمقايسة هي عزل protoplasts من الأنسجة النباتية من الاهتمام من قبل الهضم الأنزيمي في غرفة مع محلول متساوي التوتر المناسب. تتكون الخطوة الثانية من التحدي فحص الاسموزي: وتقدم protoplasts ثبتوا على الجزء السفلي من الغرفة إلى نضح انطلاق مستمر مع حل متساوي التوتر ويليه حل منخفض التوتر. تورم الخلية الفيديو المسجلة. في الخطوة الثالثة، تتم معالجة الصور حاليا أن تسفر التغييرات في الحجم، ويرتبط على مدار الساعة من التغييرات في الحجم مع مسار الوقت للتغيير في osmolaاألمن للغرفة نضح المتوسطة، وذلك باستخدام منحنى الإجراء المناسب مكتوبة في Matlab (في 'PfFit ")، لانتاج P و.
Introduction
امتصاص المياه وتدفقها عبر الأغشية الخلوية هو الشرط الأساسي لوجود محطة في كل من الخلوية والمستويات مصنع كامل. على المستوى الخلوي، aquaporins (AQPs) تلعب دورا رئيسيا في تنظيم الاسموزي معامل نفاذية المياه (P و) من غشاء الخلية 1-3.
حتى الآن، وقد استخدمت عدة طرق في قياس P و الذاتية البروتوبلازم من الأعضاء النباتية المختلفة (أي الجذور، وورقة، البشرة الداخلية وغيرها، التي استعرضتها تشاومونت وآخرون. 4). إحدى الطرق لقياس P و هو لفضح protoplasts إلى التحدي ناضح ورصد معدل الأولي للتغيير حجمه (أي.، المنحدر من المرحلة الخطية الأولى للتغيير الحجم). وصفت طريقتين مختلفتين في السابق على أساس هذا النهج، سواء على أساس تبادل لحظية من الحلول. يتكون أول واحد من immobilizجي في البروتوبلازم مع micropipette شفط والتبديل تدفق الحل 5 والثاني واحد من نقل البروتوبلازم من حل واحد إلى آخر باستخدام micropipette 6. هذه شفط micropipette وmicropipette طرق نقل، والتي تتيح الحصول على الصور في بداية جدا من تبادل حل سريع (لالتقاط المرحلة الخطية الأولى من تغيير الحجم)، من المرجح أن تنطوي على الاجهاد البدني لprotoplasts وتتطلب معدات متخصصة وخبراء المجهرية.
الطريقة الموصوفة هنا يقلل من اضطراب في الخلايا، لا ينطوي على أي المجهرية ويسمح اشتقاق P و عندما نضح حمام ليست لحظية.
بعد الهضم الأنزيمي، وprotoplasts، مغمورة في محلول متساوي التوتر، وثبتوا على الجزء السفلي من الزجاج ساترة من زجاج شبكي (الملقب سيت أو المقوى) غرفة من تهمة التفاعل. ثم، خلال نضح حمام مستمر،يتم مسح حل متساوي التوتر بعيدا عن حل منخفض التوتر توليد تحديا hypoosmotic إلى protoplasts. تورم في البروتوبلازم هو الفيديو المسجل وبعد ذلك، من خلال الجمع بين المعلومات حول مدار الساعة من نضح حمام وبالطبع الوقت من تورم الخلية، ويتم تحديد بواسطة P و معالجة الصور والإجراءات المناسب منحنى.
مزايا هذه الطريقة هي أن التجربة هي فعالة جدا، أي أنه من الممكن لمراقبة بضع خلايا في وقت واحد في فحص واحد، وأنه لا يحتاج إلى معدات خاصة أو مهارات معينة المجهرية. العديد من التطبيقات لهذه الطريقة ممكنة. على سبيل المثال، تحديد P و الأم من مجموعة متنوعة من الخلايا من الأنسجة والنباتات المختلفة، مثل ورقة وخلايا غمد حزمة من أوراق نبات الأرابيدوبسيس 7 والذرة ورقة ورقة أو خلايا قشرة الجذر 8-10 أو تعليق الخلايا المستزرعة 11،12. كما تعهدعلى ذلك، فمن الممكن لتحديد P و من الخلايا الحيوانية كروية مثل خلايا البويضة 11. مثال آخر ينطوي فحص النشاط AQP بواسطة التعبير عابرة من الجينات الخاصة بهم في protoplasts (أو أي جينات أخرى والتي قد تؤثر عليهم، مثل تحركات جينات) وتحديد مساهمتها في P و. على سبيل المثال، التعبير عن الطماطم AQP SlTIP2، 2 في protoplasts ورقة نبات الأرابيدوبسيس بواسطة PEG التحول وعزم SlTIP2؛ P 2 ذات الصلة و 13. أخيرا، فحص تأثير على P و من جزيئات مختلفة / المواد (الأدوية والهرمونات وغيرها) إضافة إلى حلول يمكن أيضا أن تدرس، على سبيل المثال من مانع AQP HgCl 2 7.
يصف البروتوكول بعد عزل protoplasts خلايا نبات الأرابيدوبسيس ورقة وعزم على P و.
Protocol
Representative Results
Discussion
الموصوفة هنا هو إجراء بسيط وفعال جدا لقياس و P من protoplasts النباتية المعزولة، المعمول بها في المبدأ أيضا على خلايا كروية أخرى، على سبيل المثال، البويضات الضفدع 11. وتستند هذه الطريقة على قياس P و ردا على التحدي الاسموزي إلى الخلية. على النقيض من الط?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الصندوق الوطني البلجيكي للفاي Scienti ج أبحاث (FNRS)، والفلمنكي الجذب البولنديين برنامج البلجيكي سياسة العلوم و"COMMUNAUTÉ الفرنسية دو بلجيك-تطبيقات للأبحاث Concertées" لFC، من القدس مؤسسة العلوم اسرائيل ( ISF) لMM (المنحة # 1311-1312)، وNM (المنحة # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
