Summary
세포의 삼투 투수 계수 (P의 F)를 측정하는 것은 아쿠아 포린의 규제 메커니즘 (AQPs)를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 제시된 구면 식물 세포 원형질체에서 P F 형 결정은 원형질체 분리 욕조와 일정한 관류 동안 삼투 도전 결과로서 부피 변화의 초기 레이트의 수치 분석을 포함한다.
Abstract
AQP 규제 메커니즘을 공부하는 것은 세포 및 전체 공장 수준 모두에서 물 관계의 이해에 매우 중요합니다. 삼투 투수 계수 식물 원형질체에서 (P에 F), 예컨대 개구리 난 모세포와 같은 다른 세포 구형도 원칙의 적용을위한 판단이 매우 간단하고 효율적인 방법이 여기에서 제시 하였다. 분석의 첫 번째 단계는 적절한 등장 성 용액 챔버로 효소 분해에 의해 관심의 식물 조직으로부터 원형질체의 분리이다. 두 번째 단계는 삼투 도전 세이로 구성 챔버의 바닥면에 고정화 된 원형질체는 저장성 용액하여 등장액으로 일정한 관류 시작하고 그 다음에 제출된다. 세포 부종 비디오 기록이다. 세 번째 단계에서, 이미지는 부피 변화를 수득 오프라인 처리되어 부피 변화의 시간 코스는 osmola의 변화의 시간 경과와 상관챔버 관류 매체의 RITY, P의 F를 산출하기 위해, matlab에 ( 'PfFit')로 작성된 커브 피팅 절차를 사용하여.
Introduction
세포막에 걸쳐 물 흡수와 흐름은 셀룰러 및 전체 공장 수준 모두에서 식물의 존재에 대한 기본적인 요구 사항입니다. 세포 수준에서, 아쿠아 포린 (AQPs)는 세포막 1-3의 삼투 투수 계수 (P의 F)의 조절에 중요한 역할을한다.
지금까지 여러 가지 방법으로 다른 식물 기관에서 원형질체의 내생 P f를 측정에 사용되어왔다 (즉 뿌리, 엽육, endodermis 등., 쇼몽 등. 4 검토). P f를 측정하는 방법 중 하나는 삼투 도전 원형질체을 노출하고 그 부피 변화의 초기 속도를 모니터링 할 수있다 (예., 체적 변화의 초기 선형 단계의 기울기). 두 가지 방법은 이전에 용액의 순간 과거에이 방법에 기초하여 설명 모두 기초 하였다. 첫 번째는 immobiliz 구성마이크로 피펫으로 흡입 원형질체를 보내고 용액 흐름 5 및 6 마이크로 피펫을 사용하여 다른 하나의 용액으로부터 원형질체를 전송하는 두 번째 스위칭. 빠른 용액 교환 매우 시작에서 화상 획득을 허용 한 마이크로 피펫 흡입 및 마이크로 피펫 전사 방법은, 가능성 원형질체에 대한 물리적 스트레스를 수반, (부피 변화의 초기 선형 위상을 포착하기 위해) 및 특수 장비 및 전문가 미세 조작을 필요로한다.
여기서 설명한 방법은 더 미세 조작을 수반하지 않고 목욕 관류 순시 없을 때 P (F)의 유도를 허용하는, 세포에 교란을 최소화한다.
효소 분해 한 후, 등장 성 용액에 잠긴 원형질체는, 전하의 상호 작용에 의해 coverslip에 유리 플렉시 글라스의 바닥 (일명 플라스틱 유리 또는 방풍) 챔버에 고정된다. 그리고, 일정 기간 동안 관류 목욕,등장 성 용액은 원형질체에 hypoosmotic 도전을 생성하는 저장성 용액에 의해 멀리 플러시됩니다. 원형질체의 팽윤 비디오 기록하고, 목욕 관류의 시간 과정 및 세포 종창의 시간 경과에 대한 정보를 조합하여, P의 F는 화상 처리 및 커브 피팅 절차에 의해 결정된다.
이 방법의 장점은, 실험이 매우 효율적임을 아르는 단일 분석에서 동시에 몇 개의 셀을 모니터하는 것이 가능하고, 특별한 장비 나 특별한 기술이 미세 조작을 필요로하지 않는다는 것을, 즉. 이 방법에 대한 몇 가지 응용이 가능하다. 예를 들면, 엽육 같은 다른 조직 및 식물의 세포의 다양한 네이티브 P (F)의 결정 및 아라비돕시스 잎 07 옥수수 잎 엽육 또는 루트 피질 세포 8-10 또는 현탁 배양 세포 (11, 12)에서 시쓰 세포 번들. additi에서에, 이러한 난자 전지 (11)로서 구형 동물 세포의 P의 F를 결정하는 것이 가능하다. P의 F 기여도의 판정과, 또 다른 예는 원형질체 (예 네이즈의 유전자 또는 다른 유전자에 영향을 미칠 수있는 그들)에서의 유전자의 일시적 발현으로 AQP 활성의 시험을 포함한다; 이 PEG 변환 및 결정 SlTIP2하여 애기 장대 엽육 원형질체의, 예, 토마토 AQP SlTIP2의 표현 (13) f를 P를 2 관련. 마지막으로, (등 약물, 호르몬,) 다른 분자 / 물질 P의 F에 미치는 영향의 검토도 AQP 차단제 HgCl 2 (7)의 예를 들면, 검사 할 수있는 솔루션에 추가됩니다.
다음 프로토콜은 애기 장대 엽육 세포와 그들의 P (F)의 결정의 원형질체의 분리에 대해 설명합니다.
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Protocol
솔루션의 1 준비
- 준비 등장 (600 mOsm) 및 저장성 10 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 등을 포함 (500 mOsm) 솔루션 8 M 2 - (N-모르 폴린) -ethanesulphonic 산 (MES), 산도 5.7의 적절한 양의 삼투압을 조절 D-소르비톨 : 등장과 저장성 용액 440 밀리미터 540 밀리미터. osmometer 사용 (목표 값의 3 % 이내) 용액의 삼투압을 확인한다.
- 다음 효소를 포함하는 '효소 믹스'의 건조 재고 준비 : 0.55 g의 셀룰라아제, 0.1 g의 pectolyase, 0.33 g 폴리 비닐 피 롤리 돈 K 30, 0.33 g의 BSA (아래의 표 참조 1) 소용돌이에 의해 건조 분말을 혼합, 5.7 mg을 분취을하고 -20 ° C에 저장합니다.
애기 장대 엽육 원형질체의 2 절연
- 약 6 방울과 페트리 접시 (10cm)를 준비 (약합니다. 30 μL 각) 등장 성 용액을.
- 껍질 배축 (하단) 애기 장대 잎의 표피, C다음 솔루션을 만지고 아래로 노출 된 배축면 삭제 등장 솔루션에 사각형을 배치, 약 4 × 4mm 2의 제곱으로 벗겨 잎 유타.
- , 165 μL에 1.5 ㎖의 튜브에 등장액 (/ w w 3.3 %)의 효소 믹스 14.4 mg을 녹이고 용해까지 분간 정도 피펫 팅하여 부드럽게 섞어 같은 배양에서의 효소 용액의 몇몇 유사한 방울을 배치 요리.
- , 28 ° C로 설정 수욕에서 접시를 떠, 파라 필름의 한 라운드로 뚜껑을 밀봉 접시를 닫고 20 분 동안 품어 방울 효소 용액에 잎 조각을 전송합니다.
- 접시에 등장 솔루션보다 몇 방울 (각 효소 용액 드롭 당 2 방울)를 추가합니다. 새로운 등장 솔루션 강하 각 잎 조각을 전송 한 후, 순차적으로, 두 번째 드롭에 (멀리 효소 솔루션을 씻어). , 집게를 사용하여 가장자리로 조각을 들어 올려는 원형질체를 분리합니다 (티백 등) 두 번째 드롭에 흔들.1.5 ML 튜브로 (잘립니다 100 μL 피펫 팁 사용) 원형질체와 방울을 수집합니다.
(3) 저장성 도전 분석 : 애기 장대 엽육 세포 붓기
- 저장성 용액으로 등장 성 용액 및 다른 열 하나의 열을 작성하여 관류 시스템 (그림 1A)를 준비합니다. 아래쪽 입구 매니 폴드 (도 1b)에 튜브 끝까지 채워 용액 일부 유량 (제 저장성 후 등장 성), 밸브를 개방하자. 더 갇혀있는 기포가 없는지 확인하고 밸브를 닫습니다.
- (, 또한도 1c의 챔버의 개략도를도 1b 참조) 내에서 슬라이드 플렉시 글라스 챔버 용 바닥을 만들기 위해, 실리콘 그리스 (표 1)를 이용하여, 커버 슬립을 봉쇄. 원형질체, 코트 "끈"(그리스 링 내에서 커버 슬립의 위쪽을 향 노출 된 표면을) 챔버 바닥을 만들려면 그또는 폴리-L-라이신 (물 중 0.1 % 표 1) 양의 차지 베어링 프로타민 설페이트 (표 1 물을 1 %)와. 2 분 린스 - 3 - 1 대기, 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 통해이 '접착제'를 확산 4 회 등장 성 용액으로하고, 나머지 솔루션을 멀리 흔들.
- 등장 성 용액으로 챔버까지 채 웁니다. 이어서, 잘려 피펫 팁을 사용하여, 챔버 함유 용액 원형질체의 방울을 추가하고 3 기다려 - 원형질체가 정착하기위한 4 분. 투명 커버 (그림 1D, 1E)와 챔버 (아래에 공기 방울을 트래핑 방지) 솔루션 표면을 만져을 커버.
- (빠른 속도를 거꾸로 현미경 테이블에 (! 부드럽게) 슬라이드를 놓고 관류 시스템 (튜브!에 공기 방울을 차단할) 펌프에 연결 / 분 1 ML에서 일정 관류의 등장 솔루션 흐름을 켭니다 4 ml / 분)까지 이용 될 수있다.
- 기록을 위해부피 변화는 반전 20X 현미경 대물 렌즈와 PC 컴퓨터에 연결된 CCD 비디오 카메라와 함께 사용된다. 선택한 부동의 원형질체의 60 초 비디오 동영상을 기록 할 수 ImageJ에 소프트웨어의 'CMU 1394 카메라 드라이버'플러그인 (이 두 소프트웨어 조각의 다운로드 주소를 특정 재료의 표 참조)을 사용하여 (아마도 바닥에 붙어있는) 한 이미지 / 초 (1 Hz에서)의 속도로. 등장 성 용액의 15 초 워시 기록 (이 기준을 구성한다)를 시작, 45 초간 저장성 용액으로 전환 (재관류의 개시부터 총 60 초를 완료). TIF 형식으로 동영상을 저장합니다. 참고 : 최대 규모의 경계 (그림 2A)에서 모양과 잘 집중 셀 형상 구형 : 다음 기준을 충족 가능한 한 많은 세포로보기 필드를 선택합니다.
ImageJ에 사용 셀 볼륨 변경의 4 분석
참고 :를 분석하기 위해팽윤 셀의 이미지의 시리즈는 '이미지 탐색기'를 열고 (자이 Draye가 작성) ImageJ에 소프트웨어 14 '원형질체 분석기'플러그인을 사용합니다. 첫 시점에서 선택 원형질체부터 '원형질체 분석기'플러그인 자동 원형질체 엣지 (윤곽)을 감지하고 (플러그인 아래 PfFit 분석 프로그램과 함께 사용할 수있는) 실험 기간 동안 자신의 지역 시간 코스를 계산할 .
- ImageJ에를 시작합니다. 그들이 전개로 영화를 열려면 드롭 다운 메뉴에 연속적으로 다음, ImageJ에 패널에 '파일을'클릭 '가져 오기'다음 '이미지 탐색기'. 선택한 동영상을 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 한 다음 '원형질체 분석기'를 클릭 왼쪽. 실험 기간 동안 크게 움직이지 남아 원형질체를 식별하기 위해 (원형질체 이미지 하단의 슬라이더를 사용하여) 동영상을 검색 - 이러한 분석됩니다. 위로 첫번째 IMA에GE는 마우스를 사용하여, 다음 등장 생 매개 변수 '의 표에'OK '를 클릭 선택 원형질체 (그림 2B) 주위에 (ImageJ에 그리기 도구에서 선택) 원을 그립니다.
- 원형질체 검출 알고리즘을 실행하려면, 드롭 다운 메뉴에서 다음, 원형질체 이미지 상단 패널 '프로세스'를 '지역'을 클릭합니다. 영화 전반에 걸쳐 선택한 원형질체 (그림 2C)의 주위에 녹색 동그라미를 검사합니다. 엑셀 파일의 '결과'를 저장합니다. ImageJ에를 종료합니다. 참고 : 빨간 점이 나타납니다 경우 (나쁜 윤곽에 맞게 표시하기 - 일반적으로 인해 가난한 이미지 대비로)를 다른 매개 변수로 다시 실행.
- 각 셀에 속하는 라인 분리하는 (- 두 개 이상의 셀이 동시에 분석 된 경우 - 분석은 프레임 단위로 수행되므로, 좌우 될 것이다), 엑셀, 셀 번호 열 ( '오브젝트'에 의해 저장된 데이터를 정렬 ).
- dete하려면, P (F)의 실제 값을 획득하기위한 화소 간 μm의 변환율을 rmine 동일 20X 현미경 대물 렌즈를 통해 마이크로 미터 눈금자 이미지 스냅. 통치자의 이미지를 따라 (ImageJ에 그리기 도구에서 선택)은 줄을 드래그하여 ImageJ에 메인 패널의 맨 아래에있는 자 길이 화소 수에 상응를 참조하십시오. 2 μM로 엑셀 파일의 임의의 화소 영역 값을 변환한다. 텍스트 파일로 (각 셀 별도로) (두 개의 숫자 열 만) 지역 시간 코스를 저장합니다. 참고 :이 볼륨 맞는 'PfFit'프로그램에 입력됩니다.
5 ImageJ에와 matlab에 프로그램 P f를 맞추기를 사용하여 실험 상공 회의소에서 삼투압 변화의 속도를 모델링
- 등장 성 용액 ( '표시 염료'를 생산하는) 100 ㎖에 2 mg을 크실렌 cyanol (표 1, 아래)를 추가합니다.
- 표시 염료과 비 염색 시간과 (3.1)를 관류 시스템을 준비합니다ypotonic 솔루션입니다.
- 커버 슬립 (전 원형질체와 같이)로 커버하고 현미경 스테이지에 배치하고 부드럽게 표시 염료와 챔버를 작성하여 플렉시 글라스 챔버의 바닥에 실리콘 그리스를 사용하여 커버 슬립을 밀봉합니다.
- 관류 시스템과 펌프에 실을 연결하고 리터의 ml / 분에서 일정한 관류에 대한 표시 염료 흐름을 켭니다.
- 1 Hz에서의 속도로 60 초 동영상을 기록합니다. 표시 염료의 15 초에 녹음을 시작, 45 초 동안 저장성 용액으로 전환합니다. 촬영을 중지합니다. 표시 염료 (최소 30 초)을 세척, 새로운 영화를 시작합니다. 6 회 모든 동영상을 저장 - 5를 반복
- 변화 투과율의 평균 시간을 구하는 과정 지표 염료 투과율의 비디오 이미지를 분석하는 소프트웨어를 ImageJ에 사용한다.
- ImageJ에 시작, '파일', 다음 '열기'를 클릭하고, 동영상을 검색해보세요. 각 영화의 경우, 10 픽셀 폭 넓은 수직 그릴영화의 1 차 이미지의 아무 곳이나 사각형입니다. 다음 드롭 다운 메뉴에서 '잘라 내기'를 클릭, ImageJ에 메인 패널에 '이미지'를 클릭합니다.
- '몽타주 만들기'를 '스택'와 (열 60 행 일) : 그들은 전개로 다시 '이미지'를 클릭, 한 행에 (60 초 동영상) 60 프레임을 정렬하려면, 다음 드롭 다운 메뉴에서 연속적으로 클릭합니다. 어디서나 이미지의 전체 행을 따라 한 픽셀 높은 수평 사각형을 그리고 ImageJ에 메인 패널에서 '분석'을 클릭 한 다음 드롭 다운 메뉴에서 '플롯 프로필'을 클릭합니다. NOTE : (도시 생략) 나타난다 창 A '몽타주 플롯'및 투과율 데이터의 목록은 메뉴에서 개방 될 수있다. 영화의 각각의 이미지가 자사의 10 픽셀 폭 넓은 사각형 결과적으로 "타임베이스"에서 발생하는 열 투과율 값을 기준으로이 목록에 표시됩니다 (이미지 일련 번호)는 10 배 이상이다.
- 투과율 DAT의 목록을 복사Excel 파일에 (영화 당 하나의 목록). 표시 염료 홍조의 여러 영화에서 얻은 투과율 시간 코스 평균값. 0.1 이미지 일련 번호를 곱하여 실시간베이스를 생성합니다. 텍스트 파일에 평균화 시간 코스 (두 열)을 저장한다. NOTE : 평균화하기 전에, 필요한 경우, 임의의 요철을 거부, 개별 시간 과정을 플롯. 동영상이 표시 염료의 정상 상태 투과율의 적어도 5 초 최종 포함되어 있는지 확인합니다.
- 삼투압 시간 코스의 다양한 매개 변수를 계산하기 위해 matlab에 피팅 프로그램 P f를 맞춤 ( '표시 맞추기'패널, 그림 3)를 시작합니다. NOTE : 욕 용액의 공지 된 초기 및 최종 농도에 기초하여, 상기 용액의 변화 삼투압 농도의 타임 코스를 가정하면, (인디케이터 염료 투과율부터 차례로 계산) 농도의 시간 경과로부터 계산된다 같은 역학을 따른다염료 농도. P F 맞춤 무료로 사용할 수있는 프로그램입니다. P f를 맞춤 프로그램을 사용자에게 익숙하게하는 데 도움이 보충 파일로 정돈를 통해 액세스에 대한 자세한 설명과 정의와 P f를 맞춤 사용 설명서 ':'PfFit_Installer_web.exe은 '에서 다운로드 할 수 있습니다.
- '표시 맞추기'패널에서 표시 염료 투과율 ( '표시 데이터 파일'도 3A)의 평균 시간 코스의 데이터를 가져 수동으로 현재 실험 매개 변수와 매개 변수 '폭'과 '의 초기 추측을 삽입 t_half 표시 염료 농도의 시간 과정의 플롯 (실제 데이터와 맞는 그림 4A)를 볼 실행 ''표시 염료 농도 (그림 3B의 시간 과정을 설명. 클릭 ', 그리고 모델 (계산) 목욕 삼투압 (그림 4B) 참고 :. AG데이터 OOD 착용감이 필수적이다 (추천 :도 3에 도시 된 숫자로 시작).
6 matlab에 피팅 프로그램 P f를 맞추기를 사용하여 P f를 결정
주 : 사실과 완벽 osmometer 11 같은 원형질체의 동작에 관한 기본적인 가정 사항에 더하여, P (F)의 판정이 P의 f는 P (F)의이 역학 시간을 기초 것을 시간에 따라 변경 될 수 있다는 가정에 달려 세포 부피 변화의 과정과 그 세 파라미터를 설명하는 데 충분하다 : P 좋 (P (F)의 초기치), 경사 PF (P (F)의 선형의 변화율)과 지연 (욕의 개시로부터 기간 세포 부피 변화의 시작까지 삼투압 변화). 다른 모델은 null 값 (11)을 포함하여 다른 이들 매개 변수의 조합 및 해당 값을 포함하여, 테스트 할 수 있습니다. P
- '볼륨 맞추기'패널 (그림 5)로 전환합니다. 임포트 영역 데이터 파일 (분석 원형질체,도 5a의 '영역'의 시간 경과와 함께 텍스트 파일)을 선택한다. 매개 변수 소스로 '마지막 표시 피팅'을 선택합니다 (그림 5B, 대안은 'P f를 맞춤 사용 설명서'를 참조). 참고 :이 매개 변수 (그림 5D)는 다음 절차를 피팅 된 볼륨에 대한 욕 농도의 삼투압 변화를 다시 생성하는 데 사용됩니다.
- '볼륨 맞추기'패널 (그림 5C)에서 초기화 (에 대한 초기 추측) P의 F 매개 변수를 입력 : P의 F, 경사 PF 및 지연 (추천 : 모델 '클래스'를 선택했다 각각 1, 1, 30,)로 시작 (추천 : II와 마르크로 시작 세 가지 매개 변수에 대한 '검사')가 장착된다. 다음 중간 그림 (그림 5E)를 안구하고 필요한 경우 지연 매개 변수와 레코드의 길이를 조절, '실행'을 클릭합니다.
- 맞는 품질을 평가하고 적합 오류를 기록하는 결과 그래프 (그림 6)를 검사합니다. 약간의 각을 접어 초기화 매개 변수를 변경하고 '- 'Run를 다시. 참고 : 프로그램이 걸리면 때 낙심하지 마십시오 - 그냥 프로그램을 다시 시작!
- 맞는 오류의 가장 낮은 값을 목표로, 초기화 매개 변수의 서로 다른 조합을 시작으로이 절차를 여러 번 반복합니다.
- 화면에서 직접 맞는 결과 목록을 복사 또는 t에서 찾을그는 '_FIT_Vol_Results.txt'파일을 생성 PfFit.
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Representative Results
다른 AQPs의 활성을 P의 F를 결정하고, 비교하기 위하여, 애기 장대 잎의 엽육 원형질체가 사용된다. 이 원형질체 낮은 기저 (배경)의 P F 레벨 7을 갖는 것으로하고, 재현성 P f를 측정 가능하도록 기능적 발현 시스템이 될 수있다.
육주 애기 공장에서 성숙한 잎에서 원형질체는 고립 된 세 유전자는 애기 장대에서 AQP 유전자를 구축 (AtPIP2 1)과 옥수수 (ZmPIP1 2 및 ZmPIP2 4) (개별적으로) 일시적했다 PEG 변환을 사용하여 표현 방법 15. 동기화에 대한 변화의 이벤트를보고 하나의 셀에 두 개의 플라스미드의 일시적 발현은 다른 식물 시스템에 이전에 100 % 성공률을 보였다 결과에 자신의 성질에 관계없이 셀에인가하고 기반 플라스미드 다수의 동시라고 가정15, 16는, 이들은 형질 전환 된 원형질체 (도 7)를 레이블링하기 위해 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 인코딩하는 벡터로 공동 - 형질 전환시켰다.
P의 F 세이 들어, 원형질체는 실험 챔버 (도 1b)에 설정하고, 이들이 등장액 (600 mOsm) 다음 저장성 용액 (500 mOsm)와 초기 플러싱 동안 원형질체 레이블 GFP가 비디오에 의해 모니터링하고, 관류 시스템 (그림 1A)를 사용하여.
먼저, '콘텐츠 탐색기'및 '원형질체 분석기'플러그인 셀 형상 영역의 변화의 시간 코스를 생성하는 데 사용 하였다 (도 : 세포 부피 변화 (도 8a)의 타임 코스는 두 단계에서 각각의 셀에 대해 얻어졌다 2) 다음, matlab에 피팅 프로그램 P f를 맞추기 (그림 5) 살전 가져 오는 데 사용되었다전자 분야 및 세포 볼륨으로 변환. P의 F 값 (도 8C)이 표시의 투과율 변화를 가져온 평균 시간 코스에, 또한 셀 볼륨의 시간 경과에 기초하여 P의 F 맞는 프로그램을 이용하여 각각의 셀 (도 5)에 대해 유도하였고 염색 (도 3), 인디케이터 염료 농도 변화의 시간 경과로 변환 다음, (도 4a) 및 - 목욕 삼투압 변화 (도 4B,도 6A 및도 8b)의 타임 코스. 그것은 DELC, 셀 (혓바닥)에서 삼투압 농도의 차이가 욕조 (COUT) 즉.에서, 물 유입에 대한 구동력이 거의 유일한 COUT의 변화 (도 6A에 기인 것을 주목할 가치가있다 ). 이 실험에서, P는 F의 분석 (도 6B) 중에 증가 하였다.
P f를 (도 8C)로 형질 전환 된 제어 셀의 P f를보다 현저하게 높았다.
그림 1 : 볼륨 분석 시스템입니다. (A) 실험 장치 : 관류 시스템 솔루션 저수지를 포함 (주입 열 '부터 Cols') 현미경 테이블에 설정 플렉시 글라스 슬라이드에 연결된 튜브 (T), 밸브 (V)와 연동 펌프 (P). HS = 저장성 용액을 등장액, 형상 카메라. (B) 실험 챔버 (대하)와 입구 (에서) 매니 폴드 커넥터를 통해 연결된 튜브와 플렉시 글라스 슬라이드의 확대도이다. 용액은 펌프 출구 (출력)을 통해 챔버로부터 흡입된다. (C)의 개략도 플렉시 글라스 슬라이드 (시계 반대 방향 : 상위 뷰, 긴 쪽보기 짧은 쪽보기) = 유리 커버 슬립, 중앙 챔버 바닥; B = 투명 접착 테이프 (표 1), 및 상기 중앙 챔버에서 이어지는 입구 및 출구를위한 용액 홈 바닥로서의; 스카치 테이프 (가끔)를 교체 할 때, 구멍은 상기 챔버 아래에서 절단; C는 슬라이드에 붙어 플렉시 글라스 블록을 =; D는 콘센트 커넥터 구멍 =. 숫자는 mm이다 (그러나 도면은 축척 없음). (D) 부분의 중앙 챔버 (화살표)를 덮는 (도 플렉시 글라스) 투명 커버와 슬라이드의 중앙 부분의 확대도. (E) 개략도 (가기 및 측면보기) 투명 커버. 투명 커버 핸들 (D 녹색 플라스틱)의 크기는 임의이다. 기타 자세한 사항은 C. 같이 아르
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그림 2 : '원형질체 분석기'플러그인을 사용하여 원형질체 이미지를 붓기의 분석. 윤곽이 마지막 이미지까지 첫번째에서, C를 자동으로 감지되기 전에 (A),에서와 같이 원형질체, B, 함께 영화의 첫 번째 이미지 만 노란색 동그라미는 동영상을 검토 한 후 만든 선택을 나타내는 녹색 동그라미 단단히 분석을 진행 "잘 행동"원형질체의 윤곽을 따릅니다. (B) 사각형 픽셀 영역 ','원형질체의 윤곽 내에서 계산 영역 ((가로축에 이미지 번호 단위) Time' 코스 플롯을 ' ), 각 추적 (고유 번호) 원형질체합니다. (C) '원형질체 분석기'플러그인의 매개 변수 입력 패널입니다. 포 '검출 파라미터'미세 조정 원형질체 검출 알고리즘으로 조정될 수있다. 테두리 픽셀 '숫자 '파라미터 원형질체 형상의 최소 두께를 설정 (디폴트 값 : 5). 상대 중량 '파라미터는 내측 원형질체 영역과 외측 테두리 사이 계조 임계 차분 (기본값 : 2)에 영향을 미친다. '최대 둘레 비율'은 그들의 형상이 원형에서 벗어난다마다 원형질체 제외위한 임계 값을 정의한다. 이 매개 변수는 원형질체와 같은 지역 (1.05 기본값)을 갖는 완벽한 원의 원주 둘레 원형질체의 비율이다. '최대 면적 증가'파라미터 (시간 스텝 당 % 증가) 파라미터 값을 위 윤곽 영역이 증가 (5 % 기본값)과 원형질체를 제외한다. 마지막으로, 플러그인은 작은 원형질의 움직임을 처리하지만, 빠른 속도로 이동하거나 그 이미지 영역에서 사라 원형질체 추적을 중지합니다. 영화는 필요한 횟수만큼 재실행 될 수 있고, 하나의 원형질체는 별도로 다시 분석 할 수있다..COM / 파일 / ftp_upload / 51,652 / 51652fig2highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : P f를 맞추기 프로그램의 '표시 맞추기'패널. 이 제품은 목욕 삼투압 타임 코스로 표시 투과율 시간 코스를 변환한다. (A) 인디케이터 염료의 투과율의 변화의 시간 경과를 포함하는 저장된 데이터 파일을 살펴볼 수있다. (B) 어느 변수 및 파라미터의 이전에 저장된리스트를 사용하거나 현재 실험의 수동 오 삽입 변수 값 'true_C_init'및 'true_C_end (초기 욕 용액 및 목욕을 통해 관류 P F 형 -assay 용액 osmolarities)를,'t_start_wash(초기 표시 염료 수준에서 기본 샘플링의 지속 시간이), 'threshold_ %'(프로그램이 자동으로 기준 투과율에서 출발 감지되는 기준 값의 %; 1-5%은 일반적으로 가장 효과적이다), 'N_steady_st_pts (샘플의 개수 - 찍은 모든 지표 염료 화상을 나타내는 10 샘플들이 함께 - 인디케이터 염료의 단부 정상 상태 레벨 평균화하기 위해, 농도의 삼투압 농도 인디케이터 염료 농도의 변환을위한 결정적인)이위한 초기 추측 표시 염료 투과율 S 자형 시간 코스의 네 개의 매개 변수의 '폭'과 t의 절반 (대략 S 자형의 전이 부분의 지속 기간에 관련된, 각각의 중간 점으로; t 절반은 음수가 될 수있다!). '폭'와 t 절반 이외에 두 최적 파라미터는 초기 추측에 대한 필요없이 얻어진다ES : 삼투압 시간 코스의 설명 (기업 P를 참조 물리적 의미없이 래그 ( 'flush_lag'), 목욕 용액 도착 밸브 개방까지의 시간, 및 'C_init'되지만, 필요 F 맞춤 사용 설명서를 참조하십시오.
도 4 :. 욕 인디케이터 염료 농도 및 매질의 삼투압 (A) 인디케이터 염료 농도의 타임 코스 데이터 (도트)로부터 직접 계산하고이 세정 될 때 최적 파라미터 (라인) 발 거리가 표시기 염료 농도의 변화와 같은 다이나믹 다음 가정 비 염색 용액. (B) 욕 용액 삼투압 변화의 계산 시간 경과에 의한.
그림 5. P f를 맞추기 프로그램의 '볼륨 맞추기'패널 (A)을 분석 원형질체의 영역 시간 코스 데이터 파일을 찾아 (B)를 '피팅 마지막 표시'를 선택 옵션에서 실험 매개 변수를 가져옵니다. . '표시 맞추기'(대안에 대한 보충 P F 맞추기의 사용 설명서를 참조하십시오) (C) '모델 유형'/ '클래스'를 통해 마지막으로 실행 : 클래스 I는 간단한 모델 일을 포함, 클래스 II - 모델 2-5, 클래스 III - 모델은 6 - 8 모델 매개 변수를 고정 및 조정되고있다 (. 즉, 자유롭게 변수) 피팅 절차를 수행하는 동안 (이 변화 할 수 있도록 박스를 표시), 그리고 '여부되고 있는지에 따라 차별화 SlopePf '및 / 또는'지연 '널 (null)입니다. 모드LS 1 -. 6 Moshelion 등 (11)에 의해 길이에서 논의된다. '조합'모델 유형 '/'클래스 '의 선택에 의해 결정 파라미터 선택을 나열합니다. 비슷한 맞는 결과 모델 중 - 간단한 선택! 'P의 F', '경사 PF'( 'Slope_Pf') (아래 E의 '지연'에 대한 자세한 내용)과 같이 '지연'매개 변수를 초기화합니다. (D) 변수 및 변경 목욕 농도의 삼투압의 시간 경과를 나타내는 파라미터가 입력 중 B. (E) 중간 플롯에서 설명한 것처럼 수동 또는 볼륨 변화의 시간 코스의 'RUN'을 타격에 의해 호출 (계산 셀 형상 영역에서) '지연'파라미터에 대한 초기 값의 선택을 돕기 위해. 추정치 (세포 부피 변화의 시작까지 1 차 시점에서,베이스 라인의 총 길이를 기준 째려포함 지연 't-시작 - 세척'+ '지연'/ '플러시 지연'+ "생리" '지연')의 합. (또한 보충 P F 맞추기의 사용 설명서를 참조하십시오) 다시 'VolumeFit'패널에서 '지연'과 '실행'에 대한 입력 매개 변수로이 값을 삽입합니다.
그림 6 : 피팅의 결과 (A)은 "무대 뒤에서"두 구획의 농도의 삼투압 농도의 계산 된 궁극적 인 시간 코스 :. 목욕 (법정, 녹색 선)과 셀 (혓바닥, 파란색 선은, 혓바닥입니다 "완전하고 사실 osmometer"11), 그리고 그들 사이의 차이의 시간 경과 (DELC - 원형질체 체적 변화 및 세포막 만 물 투과성 인 가정에 기초하여 계산물 흐름에 대한 구동력이며, 적색 라인)은 'EO-tLag'은 '지연으로 플러시'여기 저장성 도전 스타트 (단지 약 21 초에서)의 끝을 표시한다. 빨간색 상자 : 맞는 값의 오차 (에 맞게-ERR을 아래 B의 정의 참조) (B) 볼륨 시간 코스 피팅의 궁극적 인 결과를,. 녹색 상자 '입력 변수는'(그림 5A 전설에 정의 된) P f를 맞추기 / 'VolumeFit'패널을 통해 입력 한 값입니다. 블랙 박스 'exptl-집'및 '끼워-집'실험 데이터이며, 최적 파라미터를 이용하여 계산 된 부피는, 각각, 'EO-tLag'은 'EO-지연'부호와 동일하다 부피 변화의 시작. '지역 최대 3 %'는 표면적이 파열없이 스트레칭 세포막 능력을 3 %로 추정 한계를 증가하는 양을 표시한다. 'PF는 (축소)'피팅 - 바의 시간 과정이다SED는 'P (F)의 스팬'로 빨간색 상자 아래에 표시된 값에 걸쳐, P f를 계산. 빨간색 박스 : 최적 파라미터의 값이 '끼워 PARAMETERS가'같습니다 'PF I'(초기 P의 F), '지연'저장성 도전 발병 및 부피 변화의 시작 사이 (기간 ( 본 실시 예에 사용 된 모델 5에 따르면, 또한 P의 F 값의 변화에 개시), 및 '슬로프 P f를'P의 F 값의 변화 (일정 속도 인 'fit_ERR'A에 도시. - matlab에 피팅 절차의 최소화 목표 - "평균 제곱근"편차 (즉, 평균 제곱 편차의 제곱근) 기준 볼륨의 %로 제시 검은 선에서 녹색 점)의이. 다른 파라미터 초기화 값과 반복 피팅의 상대적인 성공 판정되는 값이된다.주의의 주 : 최적의 매개 변수 값이 오류 최소화 과정에서 발견 된 지역의 최소의 결과가 될 수있는 바와 같이 - 세계 최소가 발견되었는지를 확인하기 위해, 여러 가지 실행은 이러한 세 가지 매개 변수에 대해 서로 다른 초기 값으로 필요 (그리고 아르 '평균 VOLm %'를 기준으로 계산 된 원형질체의 부피 변화의 범위와 '평균 면적 %'입니다 : 델타가 장착 부피 변화 기간 말까지 발생한 변경 사항입니다. 가장 낮은 fit_ERR는 이러한 시도 중 블루 상자를 찾아야한다 원형질체 표면적의 상대적인 변화이다. 셀의 초기 크기는 원형질체 기저 형상 영역의 평균치로부터 유래 '반지름'로 주어진다.
그림 7 : 엽육 원형질체의 에피 형광 현미경보기 (B) 하에서 GFP와 PEG 변형, (A) 후. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8 :. 체적 변화 및 추출 삼투 투수 성, 저장성 도전에 노출시 팽윤 원형질체의 P를 F (A) 타임 코스 (60 초) (± SE 평균) (B) 동안 욕 계산 된 농도의 삼투압 농도. 저장성 도전. 저장성 용액 흐름이 15 초에서 켜져있는 동안, 그것은 단지 후에 화장실에 도달합니다여기에 5.9 초. (C) P (F)의 지연 (SE 평균 ±). 별표 제어 (P ≤0.05)에서 유의 한 차이를 나타냅니다. (:; : N = 13, ZmPIP1 2 : N = 28, ZmPIP2 4 : N = 34 일 N = 52, AtPIP2 제어) 적어도 3 개의 독립적 인 n 개의 원형질체의 총 각 치료를위한 실험 데이터.
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Discussion
여기서 설명하는 다른 세포에 구면도 원칙적으로 적용 절연 식물 원형질체의 P f를, 예를 들면., 개구리 난 모세포 (11)를 측정하기위한 간단하고 매우 효율적인 절차이다. 이 방법은 세포에 침투 챌린지에 응답하여 상기 P F의 측정에 기초한다. 이러한 접근 방식에 기초하여 상기 다른 방법과는 대조적으로, 그러나, 삼투압의 해법의 변화, 즉, 기저 세포 부피가되는 등장 성 용액으로부터 일정한 목욕 재관류 동안, 순간이지만 점진적 아니다 설립. 또한,이 방법은 흡인 피펫을 수반하므로 원형질체에 대한 외란을 최소화하지 않는다.
여기에 제시된 방법은 다른 식물이나 조직으로부터 원형질체의 다양한에서 측정을 할 수 있습니다. 그러나 때문에 관련된 계산 만 구면 세포를 분석 할 수있다. 번째의 또한, 효소 격리전자 원형질체 및 용액의 삼투압은 (예를 들어, 토마토 엽육 원형질체의 효소 적 분리는 애기 장대 원형질체의 경우보다 상당히 더 긴, 소요 시간에 대해) 정량 세포로 조절 될 필요가있다.
제시된 프로토콜에 따라 애기 장대 엽육 원형질체의 분리는 원형질체의 높은 숫자를 산출, 간단한 신속하고 효율적입니다. 특히, 이것은, 낮은 기저 P의 F 수준 및 높은 변환 효율 (도 8)과 결합 된, 서로 다른 AQP 동종 형에 의한 P (F)의 양적 비교가 가능하도록, 그들이 AQPs의 기능적 발현을위한 매력적인 시스템을 만든다. (예를 들면 GFP 등) 마커 유전자와 이러한 원형질체에 AQPs 표현하면, 하나는 분석을 위해 세포를 형광 실험 챔버의 원형질체를 용이하게 선별 할 수있다.
그것은이 시스템은 실행 가능한 alternativ 여부를 확인하는 것이 보람있다심지어 동물 출처 AQPs 시금위한 난자에 전자 (즉, 기능적 동물성 단백질이 식물 세포에서 발현 될 수있다 (17)은 이미 입증되었다).
P f를 맞춤 프로그램을 사용하여, 두 개 이상의 매개 변수는, P f를 옆 저장성 도전 원형질체 응답의 설명은 획득된다 : 지연, 부피 변화의 발병 및 목욕 재관류의 개시 및 경사 PF 사이의 시간, (11에서 자세히 설명) 삼투 도전 중 P의 F의 변화율.
볼륨 피팅 절차를 설정 한 각 실험 데이터의 경우 결국 가장 낮은 오류가있는 착용감을 선택, 이러한 매개 변수에 대해 다른 시작 (초기화) 값을 제공, 여러 번 수행해야합니다. 이 오류 최소화 프로세스는 사람 사이에 서로 다른 깊이와 계곡의 풍경에 깊은 계곡 ( "세계 최소")을 찾는 것으로 묘사 될 수있다Y 언덕과는 다소 얕은 계곡 ( "로컬 최소")에 적발되지 시도.
P (F)의 두 종류가 hypoosmotic의 시작에서의 F는 P의 단부로부터 계산 ( '초기 F P') 및 팽창 15 초 끝에 f를 계산 P 반응 종기, 얻어진 지연 ( 'P의 F Fi를 NAL'). 둘 사이의 차이는 Moshelion 외 의해 충분히 논의된다. 11, 해석 모델 6과 관련하여.
프로토콜의 두 가지 중요한 단계가있다 : 첫째, 인디케이터 염료 농도, 세포의 팽창 부피의 시간 경과에 초, 착용감의 시간 경과에 잘 맞는.
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Acknowledgments
이 작품은 연구 (FNRS) C 과학적위한 벨기에 기금 보조금, 이스라엘 과학 재단 예루살렘 FC에 Interuniversity 명소 폴란드 프로그램 - 벨기에 과학 정책 및 "Recherches Concertées 드 Communauté 프랑세즈 드 Belgique - 작업"(에 의해 지원되었다 MM (부여 # 12분의 1,311)에 ISF) 및 NM (부여 # 12분의 1,312)이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
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