Summary
Misurare il coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) delle cellule può aiutare a capire i meccanismi di regolazione delle acquaporine (AQPs). P determinazione F in protoplasti di cellule vegetali sferiche qui presentati coinvolge protoplasti isolamento e l'analisi numerica dei loro tasso iniziale di variazione di volume a seguito di una sfida osmotico costante durante il bagno di perfusione.
Abstract
Studiare AQP meccanismi di regolazione è fondamentale per la comprensione delle relazioni idriche sia a livello cellulare e tutto il livello dell'impianto. Presentato qui è un metodo semplice e molto efficace per la determinazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) in protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche come oociti di rana. Il primo passo del saggio è l'isolamento di protoplasti dal tessuto vegetale di interesse mediante digestione enzimatica in una camera con una soluzione isotonica adeguata. La seconda fase consiste in un saggio sfida osmotica: protoplasti immobilizzati sul fondo della camera vengono sottoposti ad una partenza perfusione costante con una soluzione isotonica e seguiti da una soluzione ipotonica. Il gonfiore cella è il video registrato. Nella terza fase, le immagini vengono elaborate in linea per produrre variazioni di volume, e l'andamento temporale delle variazioni di volume è correlato con l'andamento temporale della variazione di osmolarezza del mezzo perfusione camera, utilizzando una curva di raccordo procedura scritta in Matlab (il 'PfFit'), per produrre P f.
Introduction
L'assorbimento di acqua e il flusso attraverso le membrane cellulari è un requisito fondamentale per l'esistenza dell'impianto sia a cellulare e tutto il livello dell'impianto. A livello cellulare, acquaporine (AQPs) giocano un ruolo chiave nella regolazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) della membrana cellulare 1-3.
Ad oggi, diversi metodi sono stati utilizzati per misurare il endogena P f di protoplasti da diversi organi vegetali (ad esempio radici, mesofillo, endodermis, ecc., Recensito da Chaumont et al. 4). Uno degli approcci per misurare P f è quello di esporre i protoplasti di una sfida osmotico e di monitorare il tasso iniziale del suo cambiamento di volume (ad esempio., La pendenza della prima fase lineare della variazione di volume). Due metodi differenti sono stati precedentemente descritti sulla base di questo approccio, entrambi basati su uno scambio istantaneo di soluzioni. Il primo consiste immobilizzione del protoplasti con una micropipetta di aspirazione e commutare il flusso della soluzione 5 e la seconda di trasferimento del protoplasti da una soluzione all'altra utilizzando una micropipetta 6. Questi aspirazione micropipetta e micropipetta metodi di trasferimento, che permettono l'acquisizione di immagini proprio all'inizio dello scambio soluzione veloce (per catturare la prima fase lineare della variazione di volume), probabilmente comportare uno stress fisico per protoplasti e richiedono attrezzature specializzate e micromanipolazione esperto.
Il metodo qui descritto riduce al minimo il disturbo alle cellule, comporta nessun micromanipolazione e permette la derivazione di P f quando la perfusione bagno non è istantanea.
Dopo la digestione enzimatica, i protoplasti, immersi in una soluzione isotonica, sono immobilizzati sul fondo coprioggetto di vetro di un Plexiglass (aka Lucite o perspex) da camera di interazione carica. Poi, durante un bagno perfusione costante,la soluzione isotonica viene lavato via da una soluzione ipotonica generando una sfida ipoosmotico ai protoplasti. Il rigonfiamento del protoplasti è video registrato e quindi, combinando le informazioni sul decorso della perfusione vasca e l'andamento temporale del gonfiore cella, il P f è determinata dalla elaborazione di immagini e procedure di montaggio curva.
I vantaggi di questo metodo sono che l'esperimento è molto efficiente, cioè è possibile monitorare alcune cellule simultaneamente in un singolo test, e che non richiede particolari attrezzature o particolari competenze micromanipolazione. Diverse applicazioni di questo metodo sono possibili. Ad esempio, la determinazione del nativo P f di una varietà di cellule di diversi tessuti e piante, come mesofillo e raggruppare le cellule della guaina di Arabidopsis foglia 7, mais mesofillo foglia o radice cellule della corteccia 8-10 o di sospensione di cellule in coltura 11,12. In additisu, è possibile determinare P f di cellule animali sferiche come le cellule ovociti 11. Un altro esempio riguarda l'esame delle attività di AQP da espressione transitoria della loro gene nei protoplasti (o qualsiasi altri geni che possono influire li, ad esempio, i geni di chinasi) e la determinazione del loro contributo alla P f; per esempio, l'espressione di pomodoro AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesofillo protoplasti di PEG trasformazione e determinazione la SlTIP2; P 2-correlati F 13. Infine, l'esame degli effetti sulla P f di diverse molecole / sostanze (farmaci, ormoni, ecc) ha aggiunto alle soluzioni possono anche essere esaminato, per esempio del bloccante AQP HgCl 2 7.
Il seguente protocollo descrive l'isolamento di protoplasti di cellule e la determinazione del loro P f Arabidopsis mesofillo.
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Protocol
1 preparazione di soluzioni
- Preparare isotonica (600 mOsm) e ipotonica (500 mOsm) soluzioni contenenti KCl 10 mM, 1 mM CaCl 2, e 8 M 2 (N-morfolina) Acido -ethanesulphonic (MES), pH 5.7 e regolare osmolarità con gli importi adeguati di D-sorbitolo: 540 mm per l'isotonico e 440 mm per la soluzione ipotonica. Verificare l'osmolarità della soluzione (entro il 3% del valore nominale) utilizzando un osmometro.
- Preparare uno stock secco di 'mix enzimatico' contenente i seguenti enzimi: 0,55 g cellulasi, 0,1 g pectolyase, 0,33 g di polivinilpirrolidone K 30, 0,33 g di BSA (vedi tabella 1 qui di seguito), mescolare la polvere secca da vortice, fare 5,7 mg aliquote e conservare a -20 ° C.
2 Isolamento di protoplasti di Arabidopsis mesofillo
- Preparare una capsula di Petri (10 cm) con circa 6 gocce (circa. 30 ml ciascuna) di soluzione isotonica.
- Sbucciare le abaxial epidermide (inferiore) foglia di Arabidopsis, cut la foglia pelati in quadrati di circa 4 x 4 mm 2, quindi posizionare i quadrati sulla soluzione isotonica scende con il lato abaxial esposto verso il basso, toccando la soluzione.
- Sciogliere 5,7 mg del mix enzima in 165 microlitri soluzione isotonica (3,3% w / w) in una provetta da 1,5 ml, mescolare delicatamente pipettando per un minuto o giù di lì fino alla dissoluzione, e mettere alcune gocce simili della soluzione enzimatica nello stesso Petri piatto.
- Trasferire i pezzi di foglia sulla soluzione enzimatica gocce, chiudere il piatto di tenuta del coperchio con un giro di parafilm ed incubare per 20 minuti, il piatto che galleggia in un bagnomaria regolato a 28 ° C.
- Aggiungere qualche più gocce della soluzione isotonica al piatto (2 gocce per ogni goccia di soluzione enzimatica). Trasferire ogni pezzo foglia di una nuova goccia soluzione isotonica, poi, in sequenza, ad una seconda goccia (per lavare la soluzione enzimatica via). Sollevare il pezzo per il bordo usando pinze, agita nella seconda discesa (come una bustina di tè) per rilasciare i protoplasti.Raccogliere le gocce con i protoplasti (utilizzando una pipetta 100 microlitri tagliati fuori) in una provetta da 1,5 ml.
3 Il ipotonico sfida saggio: Gonfiore cellulare Arabidopsis mesofillo
- Preparare il sistema di perfusione (Figura 1A) riempiendo una colonna con la soluzione isotonica e un'altra colonna con la soluzione ipotonica. Aprire la valvola, far entrare un po flusso della soluzione (prima il ipotonico, quindi il isotonica) per riempire il tubo fino in fondo al collettore di aspirazione (Figura 1B). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate, e quindi chiudere la valvola.
- Sigillare il coprioggetto, utilizzando grasso al silicone (Tabella 1), per fare un fondo per la camera all'interno della diapositiva plexiglass (Figura 1B, vedi anche gli schemi della camera in Figura 1C). Per rendere il fondo della camera (la superficie rivolta verso l'alto esposta del coprioggetto all'interno dell'anello di grasso) "sticky" per protoplasti, cappottocon carica positiva-cuscinetto protamina solfato (1% in acqua; Tabella 1) o poli-L-lisina (0,1% in acqua; Tabella 1). Stendere questo 'collante' sopra il coprioggetto utilizzando un puntale, attendere per 1 - 2 minuti, sciacquare 3 - 4 volte con la soluzione isotonica e scuotere via la soluzione rimanente.
- Riempire la camera con la soluzione isotonica. Poi, aggiungere una goccia di protoplasti contenenti soluzione alla camera, usando un puntale tagliato fuori e aspettare 3-4 minuti per i protoplasti di stabilirsi. Coprire la camera con un coperchio trasparente (Figure 1D, 1E) di toccare la superficie soluzione (evitare di intrappolare bolle d'aria sotto).
- Posizionare il vetrino (con delicatezza!) Su un tavolo microscopio invertito, collegarlo al sistema di perfusione e la pompa (la guardia contro le bolle d'aria nel tubo!) E accendere il flusso della soluzione isotonica per perfusione costante a 1 ml / min (le tariffe più veloci può essere usato fino a 4 ml / min).
- Per la registrazionevariazioni di volume, è usato un microscopio invertito, con un obiettivo 20X e con una videocamera CCD collegata ad un computer PC. Utilizzare il plugin 'CMU 1394 Camera Driver' del software ImageJ (vedere la tabella di materiali specifici per gli indirizzi di download di questi due pezzi di software) per registrare un filmato video di 60 secondi di protoplasti immobili selezionati (presumibilmente, quelle attaccata al fondo) ad una velocità di 1 immagine / sec (1 Hz). Avviare la registrazione con 15 sec lavaggio della soluzione isotonica (ciò costituisce la linea di base), passare alla soluzione ipotonica per 45 secondi (per completare un totale di 60 secondi dall'inizio della perfusione). Salvare il filmato in formato TIF. NOTA: Scegliere un campo di vista con il maggior numero possibile di cellule, che soddisfano i seguenti criteri: forma sferica e con un contorno di cellule ben focalizzato il loro più grande perimetro (Figura 2A).
4 Analisi della variazione di volume delle cellule Utilizzo ImageJ
NOTA: Per analizzare ilserie di immagini di un rigonfiamento cellulare, utilizzare il 'Image Explorer' e plugins 'Protoplast Analyzer' nel software ImageJ (scritto da Xavier Draye) 14. Partendo con i protoplasti scelti al loro primo punto temporale, il plug-in 'Protoplast Analyzer' in grado di rilevare automaticamente i protoplasti bordi (contorni) e calcolare l'andamento temporale delle loro aree durante l'esperimento (i plugin sono disponibili con il programma di analisi PfFit, qui di seguito) .
- Inizia ImageJ. Per aprire il filmato, fare clic su 'File' del pannello ImageJ, poi, consecutivamente sul menu a discesa mentre si svolgono: 'Import' poi 'Image Explorer'. Evidenziare il filmato prescelto, quindi fare clic destro su di esso, poi a sinistra, clicca su 'Protoplast Analyzer'. Percorso attraverso il filmato (con un cursore in protoplasti immagine in basso) per identificare i protoplasti che rimangono in gran parte immobile durante l'esperimento - questi saranno analizzati. Ritornare alla prima image, utilizzando il mouse, disegnare cerchi (raccolti dagli strumenti di disegno ImageJ) intorno alle protoplasti selezionati (Figura 2B), quindi fare clic su 'OK' nella tabella dei "parametri di rilevazione" che è apparso.
- Per avviare l'algoritmo di rilevamento di protoplasti, fare clic su 'locale' sul pannello superiore dell'immagine protoplasti, poi 'Processo' nel menu a discesa. Esaminare i cerchi verdi intorno alle protoplasti selezionati (Figura 2C) in tutto il film. Salvare il 'risultato' in un file Excel. Esci ImageJ. NOTA: Nel caso in cui appare un punto rosso (per indicare un cattivo contorno fit - di solito a causa di un contrasto povero), eseguire di nuovo con parametri diversi.
- Per separare le linee appartenenti a ciascuna cella (che - se due o più cellule sono state analizzate simultaneamente - si intrecciano, perché l'analisi viene fatta fotogramma per fotogramma), in Excel, ordinare i dati salvati in base alla colonna numero di cellule ('oggetto' ).
- Per determine il fattore di conversione pixel-per-micron per ottenere il valore reale di P f, scatto l'immagine di un sovrano micrometro tramite lo stesso obiettivo 20X microscopio. Trascinare una linea (prelevati da strumenti di disegno ImageJ) lungo l'immagine righello e leggere il numero di pixel pari alla lunghezza righello nella parte inferiore del pannello principale ImageJ. Convertire i valori arbitrari zona dei pixel nel file Excel in micron 2. Salvare il corso zone tempo (per ogni cella separatamente) come file di testo (due colonne di numeri unici). NOTA: Questo sarà un input per il programma 'PfFit' volumi di montaggio.
5. Modellazione del Tasso di osmolarità Variazione nella camera sperimentale Uso ImageJ e la f Fit Matlab programma P
- Aggiungere 2 mg xilene cyanol (Tabella 1, in basso) a 100 ml di soluzione isotonica (per produrre il 'colorante indicatore').
- Preparare il sistema di perfusione (come in 3.1) con il colorante indicatore e la h non tintosoluzione ypotonic.
- Sigillare il vetrino con grasso al silicone sul fondo della camera di plexiglass, quindi riempire delicatamente la camera con il colorante indicatore, coprire con un coprioggetto (come con i protoplasti prima) e posizionarlo sul palco microscopio.
- Collegare la camera al sistema di perfusione e la pompa, e accendere il flusso di colorante indicatore di perfusione costante a l ml / min.
- Registrare un filmato di 60 secondi alla velocità di 1 Hz. Avviare la registrazione con 15 sec di colorante indicatore, passare alla soluzione ipotonica per 45 sec. Smettere di riprese. Lavare con l'indicatore Dye (almeno per 30 secondi), quindi avviare un nuovo film. Ripetere circa 5 - 6 volte e salvare tutti i film
- Utilizzare il software ImageJ per analizzare le immagini video della trasmittanza colorante indicatore di ottenere un andamento temporale media del cambiamento trasmittanza.
- Inizia ImageJ, fare clic su 'File', poi, 'Apri', e cercare il film. Per ogni film, disegnare un ampio 10 pixel verticalirettangolo ovunque l'immagine 1 ° del film su. Fare clic su 'Immagine' sul pannello principale ImageJ, quindi fare clic su 'Crop' nel menu a discesa.
- Per allineare i 60 fotogrammi (del filmato 60 sec) in una riga, fare clic di nuovo 'Immagine', quindi fare clic su consecutivamente nei menu a discesa mentre si svolgono: 'Stacks' e 'Fare Montage' (colonne, righe 60 1). Disegnare un rettangolo orizzontale alta 1 pixel ovunque lungo tutta la fila di immagini e cliccare su 'Analizza' nel pannello principale ImageJ, quindi fare clic su 'profilo grafico' nel menu a discesa. NOTA: A 'Trama di Montage' finestra apparirà (non mostrato), e un elenco dei dati di trasmittanza possono essere aperti dal menu. Ogni immagine del film è rappresentato in questa lista di 10 valori di trasmittanza originari del suo rettangolo largo 10 pixel e di conseguenza la "base dei tempi" (il numero sequenziale dell'immagine) è 10 volte più a lungo.
- Copiare le liste del dat trasmittanzauna (una lista per ogni film) in un file Excel. Calcolare la media dei corsi a tempo trasmittanza ottenuti dai diversi film delle vampate di colorante indicatore. Generare una base reale tempo moltiplicando il numero sequenziale dell'immagine di 0,1. Salvare il periodo di tempo mediato (due colonne) in un file di testo. NOTA: Prima di media, se lo si desidera, tracciare i corsi individuali di tempo, di rifiutare eventuali irregolarità. Assicurarsi che il film include almeno 5 sec finale dello stato stazionario trasmittanza dell'indicatore Dye.
- Avviare il raccordo Fit Matlab programma P f (pannello 'indicatore Fit', figura 3) per calcolare i vari parametri del corso tempo osmolarità. NOTA: sulla base delle note concentrazioni iniziali e finali della soluzione nella vasca da bagno, l'andamento temporale del cambiamento di concentrazione osmotica della soluzione viene calcolata l'andamento temporale di concentrazione (calcolato, a sua volta, dalla trasmittanza colorante indicatore), supponendo che segue le stesse dinamiche come ilconcentrazione di colorante. P f Fit è un programma disponibile per l'uso a titolo gratuito. Il 'PfFit_Installer_web.exe' può essere scaricato da: P f Guida per l'utente Fit 'con spiegazioni e definizioni precise è accessibile tramite Giove come un file supplementare, che aiuta a familiarizzare l'utente con il programma P F Fit.
- Nel pannello 'indicatore Fit', importare i dati del corso tempo medio di trasmittanza Indicatore Dye ('file di dati Indicator', figura 3A) e inserire manualmente i parametri dell'esperimento attuali e le ipotesi iniziali dei parametri 'width' e ' t_half 'che descrive l'andamento temporale della concentrazione di colorante indicatore (Figura 3B. Fare clic su' Esegui 'per visualizzare le trame dei andamento nel tempo della concentrazione colorante indicatore (dati reali e in forma, figura 4a), e del modellato (calcolato) Bagno osmolarità (Figura 4B). NOTA: agood adatta ai dati è essenziale (una raccomandazione: iniziare con i valori riportati nella figura 3).
6 Determinazione del P F utilizzando il Fitting programma Matlab P f Fit
NOTA: Oltre alle ipotesi di base per quanto riguarda il comportamento di un protoplasti come un vero e perfetto osmometro 11, la determinazione di P f basa sulla presunzione che P f può cambiare con il tempo, che questa dinamica di P f sottende il tempo corso della variazione di volume delle cellule e che i tre parametri sufficienti per descriverlo: P fi (il valore iniziale di P f), Slope Pf (il tasso di variazione lineare di P f) e Delay (il periodo compreso tra l'inizio del bagno cambiamento osmolarità fino all'inizio della variazione di volume delle cellule). Diversi modelli possono essere testati, tra cui diverse combinazioni di questi parametri e dei loro valori, inclusi i valori nulli 11. P
- Passare alla 'Fit Volume' del pannello (Figura 5). Scegliere per l'importazione del file di dati aree (il file di testo con l'andamento temporale delle "aree" dei protoplasti analizzati, Figura 5A). Scegliere 'Ultimo Indicatore Fitting' come fonte parametro (Figura 5B, vedere la 'P f Guida per l'utente Fit' di alternative). NOTA: Questi parametri (Figura 5D) vengono poi utilizzate per rigenerare il cambiamento osmoticum nella vasca da bagno per i volumi procedura di montaggio.
- Nel 'Volume Fit' pannello (Figura 5C), inizializzare (compilare le ipotesi iniziali per i parametri F) P: P f, Pf e Delay Slope (una raccomandazione: iniziare con 1, 1, e 30, rispettivamente), ha scelto il modello di 'classe' (una raccomandazione: iniziare con II e marchio 'verifica' per tutti e tre i parametri da montare). Fare clic su 'Esegui', poi bulbo oculare la figura intermedia (Figura 5E) e regolare il parametro Delay e la lunghezza del record, se necessario.
- Esaminate il grafico dei risultati (figura 6) per valutare la qualità vestibilità e registrare l'errore di misura. Modificare i parametri di inizializzazione pochi piegare ogni, e ri-'Run '. Nota: Non scoraggiatevi quando il programma si blocca - basta riavviare il programma!
- Ripetere questa procedura diverse volte, partendo da diverse combinazioni di parametri di inizializzazione, puntando il valore minimo dell'errore in forma.
- Copiare l'elenco dei risultati in forma direttamente dallo schermo, o trovare in tegli PfFit-generato il file '_FIT_Vol_Results.txt'.
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Representative Results
Per determinare la P f e confrontare l'attività di diversi AQPs, vengono utilizzati protoplasti da mesofillo foglia Arabidopsis. Questi protoplasti sono stati trovati ad avere bassi basale (sfondo) livelli P f 7 e può servire come un sistema funzionale espressione per consentire riproducibili misurazioni P f.
Protoplasti da una foglia maturo da un 6 settimane di età Arabidopsis pianta sono stati isolati e tre gene costruisce con i geni AQP da Arabidopsis (AtPIP2, 1) e il mais (ZmPIP1, 2 e ZmPIP2; 4) sono state transitoriamente (e separatamente) espressi utilizzando la trasformazione PEG Metodo 15. Supponendo che l'evento di trasformazione è simultanea di un gran numero di plasmidi applicate alla cella, indipendentemente dalla loro natura e in base ai risultati che mostravano un tasso di successo del 100% per sincronizzato espressione transiente dei due plasmidi in una cella precedentemente riportato per altri sistemi vegetali15,16, furono co-trasformato con un vettore codificante la proteina fluorescente verde (eGFP) per etichettare i protoplasti trasformati (Figura 7).
Per i saggi P f, protoplasti sono stati fissati nella camera sperimentale (Figura 1B) e la GFP protoplasti etichettato sono stati monitorati in video mentre erano arrossate, inizialmente con la soluzione isotonica (600 mOsm), poi con la soluzione ipotonica (500 mOsm), utilizzando il sistema di perfusione (Figura 1A).
I corsi tempo delle variazioni di volume delle cellule (Figura 8A) sono stati ottenuti per ogni cella in due fasi: in primo luogo, la 'Image Explorer' e plugins 'Protoplast Analyzer' sono stati utilizzati per generare l'andamento nel tempo delle variazioni del contorno cellulare (Figura 2), poi, il programma Matlab raccordo P f Fit (Figura 5) è stato utilizzato per importare theszone E e convertirli in volumi cellulari. I valori di P f (Figura 8C) sono stati ottenuti per ciascuna cella utilizzando il programma P f Fit (figura 5), sulla base del decorso temporale dei volumi cellulari e, inoltre, sul decorso media importato dei cambiamenti trasmittanza dell'Indicatore Dye (Figura 3), convertito al corso tempo del cambiamento concentrazione colorante indicatore (Figura 4A) e poi - per l'andamento temporale del cambiamento bagno osmolarità (Figure 4B, 6A e 8B). Vale la pena notare, che DELC, la differenza nelle concentrazioni osmotiche nella cella (CIN) e nel bagno (Cout), cioè., La forza motrice per l'afflusso dell'acqua, è dovuto quasi esclusivamente alla variazione di Cout (Figura 6A ). In questo esperimento, P f aumentata durante il test (Figura 6B).
Il P F f della cella di controllo trasformata con GFP sola (Figura 8C).
Figura 1: Il sistema volume-test. (A) L'apparato sperimentale: Il sistema di perfusione contiene serbatoi di soluzione (colonne infusione, 'Cols'), tubo (T), valvole (V) e una pompa peristaltica (P) collegato alla slitta plexiglass impostato sul tavolo microscopio. HS = soluzione ipotonica, è la soluzione isotonica, Cm fotocamera. (B) una vista ingrandita della diapositiva plexiglass con la camera sperimentale (Chr) e il tubo collegato tramite un ingresso (A) Connettore collettore. La soluzione viene aspirata dalla camera attraverso una uscita (Out) alla pompa. (C) Un disegno schematico della la diapositiva plexiglass (in senso antiorario: vista dall'alto, vista, lato lungo e corto-vista laterale): a = copertura in vetro antiscivolo, il fondo camera centrale; b = nastro adesivo trasparente (Tabella 1), che funge da fondo per la soluzione di ingresso e uscita scanalature che portano da e verso la camera centrale; quando il nastro Scotch è sostituito (solo occasionalmente), un foro è tagliato in esso sotto la camera; c = un blocco di plexiglass incollato alla diapositiva; d = un foro del connettore di uscita. I numeri sono mm (ma il disegno non è in scala). (D) una vista ingrandita della porzione centro della diapositiva con il coperchio trasparente (anche plexiglas) che copre parzialmente la camera centrale (frecce). (E) Schema (top e viste laterali) del coperchio trasparente. La dimensione della maniglia del coperchio trasparente (plastica verde in D) è arbitraria. Altri particolari sono come in C.
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Figura 2: Analisi di gonfiore protoplasti immagini utilizzando il plug-in 'Protoplast Analyzer'. (A) una, la prima immagine del film con protoplasti, b, come in una, ma cerchi gialli indicano la selezione effettuata dopo aver esaminato il filmato, prima che i contorni vengono caricati automaticamente, C, dal primo fino all'ultimo immagine i cerchi verdi strettamente seguire i contorni dei protoplasti "ben educati" in fase di analisi. (B) 'trame Time'-corso (con unità di numero di immagine sulle ascisse) delle aree calcolate entro i contorni di protoplasti (' Area ', in pixel quadrati ), per ogni monitorato (e numerata) protoplasti. (C) Il pannello di immissione parametri del plug-in del 'Protoplast dell'analizzatore'. Quattro "parametri di rilevamento" possono essere regolati per ottimizzare l'algoritmo di rilevamento protoplasti. Il 'numero di pixel di confine 'Parametro imposta lo spessore minimo del contorno protoplasti (valore di default: 5). Il parametro 'peso relativo' influenza la soglia del livello di grigio differenza tra l'area di protoplasti interno e il bordo esterno (default: 2). Il 'rapporto massimo circonferenza' definisce una soglia per escludere protoplasti ogni volta la loro forma si discosta da un cerchio. Questo parametro è il rapporto tra la circonferenza protoplasti alla circonferenza di un cerchio perfetto avente la stessa area della protoplasti (default: 1.05). La 'aumento della superficie massima' (% di aumento per ogni passo temporale) parametro esclude protoplasti con aumenti area del profilo di sopra del valore del parametro (valore di default: 5%). Infine, il plugin gestisce anche piccoli movimenti di protoplasti, ma si fermerà tracciamento protoplasti che si muovono rapidamente o che scompaiono dalla zona dell'immagine. Il film può essere ripetuta tante volte quanto necessario, e un singolo di protoplasti può essere rianalizzati separatamente..com / files / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il pannello 'indicatore Fit' del programma P F Fit. Questa parte si traduce corso indicatore del tempo di trasmissione nel corso tempo del bagno osmolarità. (A) Cercare il file di dati salvato contenente l'andamento nel tempo delle variazioni di trasmittanza del colorante indicatore. (B) O utilizzare l'elenco salvato in precedenza di variabili e parametri, o inserire manualmente i 5 valori variabili dell'esperimento corrente: 'true_C_init' e 'true_C_end' (i osmolarities della soluzione del bagno iniziale e la soluzione P f -assay perfuso attraverso il bagno) ', t_start_wash'(La durata del campionamento di base a livello di colorante indicatore iniziale),' threshold_% '(% del valore basale, a cui il programma rileva automaticamente la partenza dalla trasmissione basale; 1-5% di solito sono i più efficaci),' N_steady_st_pts '(il numero di campioni - con 10 campioni rappresentativi di ogni immagine Indicatore Dye presa - da media a livello di stato stazionario fine del colorante indicatore, cruciale per la conversione della concentrazione di colorante indicatore alla concentrazione osmoticum) e ipotesi iniziali per due dei quattro parametri del decorso temporale sigmoidale colorante indicatore trasmittanza, 'width' e t mezzo (All'incirca relativa alla durata della parte transizione del sigma, e al suo punto medio, rispettivamente; t la metà può essere negativo!). Due parametri fit vantaggiose, oltre a 'width' e t metà sono ottenuti senza la necessità di tentativo inizialees: lag ('flush_lag'), il tempo tra l'apertura della valvola per l'arrivo della soluzione nella vasca, e 'C_init', senza significato fisico, ma necessari per la descrizione del corso tempo osmolarità (vedere la lettera P f Fit Guida per l'utente.
Figura 4:. La concentrazione di colorante indicatore nel bagno e l'osmolarità del mezzo (A) Il corso tempo della concentrazione di colorante indicatore, calcolato direttamente da dati (punti) e dai parametri di best-fit (linea) come è lavato lontano da una soluzione non tinto. (B) Il corso di tempo calcolato della variazione osmolarità della soluzione del bagno, supponendo che segue la stessa dinamica della variazione della concentrazione colorante indicatore.
Figura 5:. L''Fit Volume' pannello del programma P f Fit (A) Cercare il file di dati decorso zona del protoplasti analizzato (B) Scegliere il 'Ultima Indicatore Fitting' opzione per importare i parametri dell'esperimento dal. . ultima corsa attraverso la 'indicatore Fit' (consultare la Guida utente Supplemental P f Fit for alternative) (C) 'Tipo di modello' / 'Classe': Classe I contiene il modello più semplice 1, Classe II - i modelli 2-5, classe III - Modelli 6 - 8 I modelli si differenziano rispetto a quali parametri si determinano e che sono da regolare (cioè, liberamente variabile.) durante la procedura di montaggio (barrare la casella per consentire a variazioni), e se non ' SlopePf 'e / o' Gara 'sono nulli. La modalitàls 1-6 sono discussi a lungo da Moshelion et al 11.. "Combinazioni" elenca le scelte dei parametri dettati dalla scelta di 'Tipo Modello' / 'Classe'. Tra i modelli con un risultato simile fit - scegliere la più semplice! Inizializzare la 'P f', 'Slope Pf' ('Slope_Pf') e parametri 'Delay' come indicato (maggiori dettagli su 'Gara' a E di seguito). (D) Le variabili ei parametri che descrivono l'andamento temporale del cambiamento bagno osmoticum vengono immessi manualmente, o come descritto in B. (E) Una trama interim, invocata da colpire 'RUN', di un corso a tempo di cambiamento di volume (calcolati sia dalle aree di contorno cella) per aiutare nella scelta del valore iniziale per il parametro 'Ritardo'. Stima, dal ammirato, la lunghezza totale della linea di base dal 1 ° punto fino l'inizio del cambiamento di volume delle cellule (il 'ritardo compreso: la somma di 't-start-wash' + 'lag' / 'flush-lag' + il 'ritardo' "fisiologico"). Inserire questo valore come parametro di input per il 'ritardo' nel pannello 'VolumeFit' e 'Run' di nuovo (si veda anche la Guida per l'utente Supplemental P f Fit).
Figura 6: I risultati di raccordo (A) "Dietro le quinte": gli andamenti temporali finali calcolati delle concentrazioni osmoticum nei due comparti:. Del bagno (Cout, linea verde) e la cella (Cin, linea blu; Cin è calcolato sulla base della variazione di volume di protoplasti e un presupposto che la membrana plasmatica è permeabile solo all'acqua - la "osmometro perfetto e vero" 11), e il corso del tempo la differenza tra loro (DELC, Linea rossa), che è la forza motrice per il flusso di acqua, 'Eo-tlag' segna la fine del 'filo-lag' e l'inizio della sfida ipotonico (qui solo a circa 21 sec). Casella rossa: l'errore del valore di misura (misura-ERR, vedi definizione in B sotto) (B) Il risultato finale del montaggio del decorso del volume;. Scatola verde: 'variabili di input' sono i valori immessi tramite il pannello P f Fit / 'VolumeFit' (definito in Figura 5A leggenda). Scatola nera: 'exptl-Vol' e 'montato-Vol' sono i dati sperimentali e il volume calcolato utilizzando i parametri di best-fit, rispettivamente 'Eo-tlag' è lo stesso che in A, marchi 'Eo-Delay' l' l'inizio della variazione di volume. 'Area up 3%' segna il volume a cui la superficie è aumentata del 3%, il limite presunto alla capacità membrana cellulare di allungare senza rompersi. 'Pf (in scala)' è l'andamento temporale del raccordo-based calcolato P f, che coprono i valori indicati sotto la scatola rossa come 'Span di P f'. Red Box: 'DOTATO PARAMETRI' sono i valori dei parametri migliori fit: 'Pf i' (P F iniziale), 'ritardo' (il periodo compreso tra l'inizio della sfida ipotonico e l'inizio del cambiamento di volume (che, secondo il modello 5 utilizzato in questo esempio, è anche l'inizio di una variazione del valore f P), e 'pendenza-P f' (la costante di velocità di variazione del valore P f 'fit_ERR' mostrato in A. - l'obiettivo di minimizzazione della procedura di raccordo Matlab - è la deviazione "root-mean-square" (vale a dire, una radice quadrata di un quadrato deviazione media) di un punto verde dalla linea nera), presentato come% del volume di base è. è da questo valore che il relativo successo di raccordo ripetuto con differenti valori di parametro di inizializzazione viene giudicato. ANOTA DI ATTENZIONE: Poiché i valori dei parametri best-fit potrebbero essere il risultato di un minimo locale trovato nella procedura di minimizzazione errore - per verificare che un minimo globale è stato trovato, diverse piste sono tenuti con differenti valori di inizializzazione per questi tre parametri (e il fit_ERR più basso dovrebbe essere cercato nel corso di questi tentativi di dialogo Blu:. DELTA sono i cambiamenti che si sono verificati entro la fine del periodo di variazione di volume montato: 'avg Volm%' è la misura relativa della variazione di volume protoplasti calcolato e 'Area avg%' è la variazione relativa della superficie protoplasti. La dimensione iniziale della cella è data da 'raggio', derivato dal valore medio del contorno basale protoplasti.
Figura 7: Epi-fluorescenza vista al microscopio di protoplasti mesofillo (A) sotto trasmessa luce bianca e (B) a 488 nm di eccitazione e di emissione di 520 nm. Scala bar:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8:. Cambiamento di volume e la permeabilità all'acqua osmotica estratto, P f (A) corso di tempo (60 secondi) di protoplasti gonfiore in seguito all'esposizione sfida ipotonico (media ± SE) (B) La concentrazione osmoticum calcolata nel bagno durante l'. sfida ipotonica. Si noti che mentre il flusso della soluzione ipotonica era acceso a 15 secondi, ha raggiunto il bagno solo dopolag, qui di 5.9 sec. (C) P f (media ± SE). Gli asterischi indicano differenze significative di controllo (p ≤0.05). I dati di almeno tre esperimenti indipendenti per ogni trattamento, con un totale di n protoplasti (controllo: n = 52, AtPIP2; 1: n = 13, ZmPIP1; 2: n = 28, ZmPIP2; 4: n = 34).
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Discussion
Descritto qui è una procedura semplice e molto efficace per misurare la P f di isolati protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche, ad es., Oociti di rana 11. Questo metodo si basa sulla misura della P f in risposta ad una sfida osmotica alla cella. A differenza di altri metodi basati su questo approccio, tuttavia, la variazione di soluzioni, cioè, della osmolarità, non è istantanea ma graduale, durante un bagno perfusione costante, iniziando con la soluzione isotonica, in cui il volume delle cellule basali è stabilito. Inoltre, questo metodo non comporta una pipetta di aspirazione e riduce quindi il disturbo ai protoplasti.
L'approccio qui presentato permette misurazioni da una varietà di protoplasti, da piante diverse o tessuti. Tuttavia, a causa dei calcoli coinvolti, solo le cellule sferiche possono essere analizzati. Inoltre, l'isolamento enzimatica di thE protoplasti e l'osmolarità delle soluzioni devono essere adeguate alle cellule saggiate (per esempio, l'isolamento enzimatica di pomodoro protoplasti mesofillo dura circa un'ora, notevolmente più lungo nel caso di protoplasti di Arabidopsis).
L'isolamento di protoplasti di Arabidopsis mesofillo secondo il protocollo presentato è semplice, rapido ed efficace, ottenendo un elevato numero di protoplasti. In particolare, questa, combinata con i loro bassi livelli basali P f e la loro elevata efficienza di trasformazione (figura 8), loro un sistema attraente per l'espressione funzionale di AQPs fa, per consentire di confronto quantitativo di P f indotta da differenti isoforme AQP. Quando esprimendo AQPs in questi protoplasti con un gene marcatore (come GFP), si può facilmente schermare i protoplasti nella camera sperimentale di cellule fluorescenti da analizzare.
Vale la pena di verificare se questo sistema è una valida alternative di ovociti per saggiare AQPs anche da fonti animali (che le proteine animali funzionali possono essere espressi nelle cellule vegetali è stato già dimostrato 17).
Utilizzando il programma P f Fit, altri due parametri, accanto alla P f, si ottengono per la descrizione delle risposte protoplasti alle sfide ipotonici: il ritardo, il tempo che intercorre tra l'inizio del cambiamento di volume e l'inizio di bagno perfusione, e Slope Pf, il tasso di variazione di P f durante la sfida osmotica (descritte in dettaglio 11).
Per ogni dati sperimentali stabiliti la procedura di montaggio del volume deve essere eseguita più volte, fornendo valori diversi a partire (inizializzazione) per questi parametri, alla fine la scelta della forma con l'errore più basso. Questo processo di minimizzazione errore potrebbe essere descritto come ricerca della valle più profonda (un "minimo globale"), in un paesaggio di valli con diverse profondità, tra l'uomocolline y, e senza tentare essere catturati in una valle piuttosto bassa (un "minimo locale").
Due tipi di P f si ottengono, P f all'inizio della ipoosmotico gonfiore risposta ('P f iniziale') e P f calcolato alla fine del 15 sec di gonfiore, contando dalla fine del il ritardo ('f fi nale P'). La differenza tra i due è discussa completamente da Moshelion et al. 11, per quanto riguarda i 6 modelli analizzati.
Ci sono due fasi critiche nel protocollo: in primo luogo, una buona misura per l'andamento temporale della concentrazione di colorante indicatore, secondo, una buona misura per l'andamento temporale del volume della cella rigonfiamento.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale belga per fi Scienti c Research (FNRS), il Interuniversitario di attrazione polacchi programma-belga Politica della scienza e le "Comunità francese del Belgio-Actions de Recherches Concertées" per FC, dalla Fondazione Gerusalemme Israele Science ( ISF) a MM (Grant # 1311-1312), e NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
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