Summary
Medición del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de las células puede ayudar a entender los mecanismos de regulación de las acuaporinas (AQPs). Determinación f P en protoplastos de células vegetales esféricas presentados aquí implica protoplastos aislamiento y análisis numérico de su tasa inicial de cambio de volumen como resultado de un desafío osmótica durante la perfusión baño constante.
Abstract
El estudio de los mecanismos de regulación AQP es crucial para la comprensión de las relaciones de agua, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. Se presenta aquí un método sencillo y muy eficaz para la determinación del coeficiente de permeabilidad osmótica de agua (P f) en protoplastos de plantas, aplicable en principio también a otras células esféricas tales como oocitos de rana. El primer paso del ensayo es el aislamiento de protoplastos a partir del tejido vegetal de interés por digestión enzimática en una cámara con una solución isotónica adecuada. El segundo paso consiste en un ensayo de desafío osmótica: protoplastos inmovilizados en la parte inferior de la cámara están sometidos a una partida de perfusión constante con una solución isotónica y seguido por una solución hipotónica. La hinchazón celular es el vídeo grabado. En el tercer paso, las imágenes se procesan en línea para producir cambios de volumen, y el curso temporal de los cambios de volumen se correlaciona con la evolución en el tiempo del cambio en osmoladad del medio de perfusión cámara, usando un procedimiento de ajuste de curvas por escrito en Matlab (el 'PfFit'), para producir P f.
Introduction
La absorción de agua y el flujo a través de las membranas celulares es un requisito fundamental para la existencia de plantas, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. A nivel celular, las acuaporinas (AQPs) juegan un papel clave en la regulación del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de la membrana celular 1-3.
Hasta la fecha, varios métodos han sido empleados en la medición de la P f endógena de protoplastos de diferentes órganos de la planta (es decir, raíces, mesófilo, endodermis, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uno de los enfoques para medir P f es exponer los protoplastos a un desafío osmótica y para monitorear la tasa inicial de su cambio de volumen (es decir., La pendiente de la fase lineal inicial de la variación de volumen). Dos métodos diferentes se han descrito anteriormente sobre la base de este enfoque, tanto basados en un intercambio instantáneo de soluciones. La primera de ellas consiste en immobilizing la de protoplastos con una micropipeta de succión y cambiar el flujo de la solución 5 y el segundo de transferir la de protoplastos a partir de una solución a otra utilizando una micropipeta 6. Estos métodos de transferencia de aspiración micropipeta y micropipeta, que permiten la adquisición de imágenes en el comienzo mismo del intercambio solución rápida (para capturar la fase lineal inicial de cambio de volumen), probablemente involucre a un estrés físico de protoplastos y requieren equipo especializado y micromanipulación experto.
El método aquí descrito minimiza la perturbación a las células, no implica ningún micromanipulación y permite la derivación de P f cuando el baño de perfusión no es instantánea.
Después de la digestión enzimática, los protoplastos, sumergidas en una solución isotónica, se inmovilizan en la parte inferior cubreobjetos de vidrio de un plexiglás (también conocido como Lucite o plexiglás) por cámara de interacción de carga. Luego, durante un baño de perfusión constante,la solución isotónica es arrastrada por una solución hipotónica generar un desafío hipoosmótica a los protoplastos. La hinchazón de la protoplastos es de vídeo grabada y luego, mediante la combinación de la información sobre el curso temporal de la perfusión de baño y el curso temporal de la inflamación celular, la P f está determinada por el procesamiento de imágenes y los procedimientos de ajuste de curvas.
Las ventajas de este método son que el experimento es muy eficiente, es decir, es posible supervisar unas pocas células simultáneamente en un único ensayo, y que no requiere equipos especiales o particulares habilidades de micromanipulación. Varias aplicaciones para este método son posibles. Por ejemplo, la determinación de la P f nativa de una variedad de células de diferentes tejidos y plantas, tales como mesófilo y el paquete células de la vaina de la hoja de Arabidopsis 7, el maíz mesófilo de la hoja o células de la corteza de la raíz 8-10 o suspensión células cultivadas 11,12. En additien adelante, es posible determinar P f de las células animales tales como células esféricas 11 ovocitos. Otro ejemplo involucra la evaluación de la actividad AQP por la expresión transitoria de su gen en los protoplastos (o cualesquiera otros genes que puedan afectarles; por ejemplo, genes de quinasas) y determinación de su contribución a P f; por ejemplo, la expresión de tomate AQP SlTIP2; 2 de Arabidopsis en protoplastos de mesófilo de transformación PEG y la determinación de la SlTIP2; P 2 relacionada con f 13. Finalmente, el examen del efecto sobre P f de diferentes moléculas / sustancias (fármacos, hormonas, etc) que se añade a las soluciones también se puede examinar, por ejemplo, del bloqueador de AQP HgCl 2 7.
El siguiente protocolo describe el aislamiento de protoplastos de células y determinación de su P f Arabidopsis mesófilo.
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Protocol
1 Preparación de Soluciones
- Preparar isotónico (600 mOsm) y hipotónica (500 mOsm) soluciones que contienen 10 mM de KCl, 1 mM CaCl 2, y 8 M 2 (N-morfolina) -ethanesulphonic ácido (MES), pH 5,7 y ajustar la osmolaridad con las cantidades apropiadas de D-sorbitol: 540 mM para la isotónica y 440 mM de la solución hipotónica. Verificar la osmolaridad de la solución (a menos de 3% del valor objetivo) usando un osmómetro.
- Preparar una pasta seca de "mezcla enzimática 'que contiene las siguientes enzimas: 0,55 g de celulasa, pectoliasa 0,1 g, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (véase la Tabla 1 a continuación), mezclar el polvo seco por vórtice, hacer alícuotas de 5,7 mg y almacenar a -20 ° C.
2 Aislamiento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo
- Preparar una placa de Petri (10 cm) con aproximadamente 6 gotas (aprox. 30 l cada una) de solución isotónica.
- Pelar las abaxial epidermis (inferior) de la hoja de Arabidopsis, cut la hoja pelada en cuadrados de unos 4 x 4 mm 2, a continuación, colocar los cuadrados de la solución isotónica cae con el lado abaxial expuesto abajo, tocando la solución.
- Disolver 5,7 mg de la mezcla de enzimas en 165 l solución isotónica (3,3% w / w) en un tubo de 1.5 ml, mezclar suavemente con la pipeta por un minuto más o menos hasta que se disuelva, y colocar varias gotas similares de la solución enzimática en el mismo Petri plato.
- Transfiera los trozos de hojas en la solución enzimática gotas, cierre el sellado de la tapa de la placa con una ronda de parafilm y se incuba durante 20 min, flotando el plato en un baño de agua a 28 ° C.
- Añadir varias gotas más de la solución isotónica al plato (2 gotas por cada enzima gota solución). Transferencia de cada pieza de la hoja a una nueva gota solución isotónica, entonces, de forma secuencial, a una segunda gota (para lavar la solución enzimática de distancia). Levante la pieza por el borde con unas pinzas, agitar en la segunda caída (como una bolsa de té) para liberar los protoplastos.Recoger las gotas con los protoplastos (usando una punta de pipeta 100 l recortada) en un tubo de 1,5 ml.
3. La hipotónica Desafío Ensayo: Hinchazón Cell Arabidopsis mesófilo
- Preparar el sistema de perfusión (Figura 1A) rellenando una columna con la solución isotónica y otra columna con la solución hipotónica. Abrir la válvula, dejar que un flujo de solución (la primera hipotónica, entonces el isotónica) para llenar el tubo de todo el camino hasta el colector de entrada (Figura 1B). Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas, y luego cerrar la válvula.
- Sellar un cubreobjetos, utilizando grasa de silicona (Tabla 1), para hacer un fondo para la cámara dentro de la diapositiva de plexiglás (Figura 1B; véase también los esquemas de la cámara en la Figura 1C). Para hacer que el fondo de la cámara (la que mira hacia arriba superficie expuesta de la cubreobjetos dentro del anillo de grasa) "pegajosa" para protoplastos, el escudocon sulfato de soporte de carga positiva-protamina (1% en agua, Tabla 1) o poli-L-lisina (0,1% en agua; Tabla 1). Extienda esta 'pegamento' sobre el cubreobjetos usando una punta de pipeta, espere 1 - 2 min, enjuagar 3 - 4 veces con la solución isotónica y agitar lejos la solución restante.
- Llene la cámara de arriba con la solución isotónica. A continuación, añadir una gota de solución de protoplastos que contienen a la cámara, usando una punta de pipeta recortado y espere 3 - 4 min durante los protoplastos se asienten. Cubra la cámara con una cubierta transparente (figuras 1D, 1E) tocar la superficie de la solución (evitar atrapar burbujas de aire por debajo).
- Coloque la corredera (con cuidado!) En una mesa de microscopio invertido, conectarlo al sistema de perfusión y la bomba (para protegerlos contra las burbujas de aire en el tubo!) Y encienda el flujo de la solución isotónica para la perfusión constante a 1 ml / min (tasas más rápidas se puede utilizar, hasta 4 ml / min).
- Para la grabaciónlos cambios de volumen, se utiliza un microscopio invertido, con un objetivo de 20X y con una cámara de vídeo CCD conectada a un ordenador PC. Utilice el plugin 'CMU 1394 Camera Driver' del software ImageJ (ver la Tabla de materiales específicos para las direcciones de descarga de estas dos piezas de software) para grabar una película de vídeo de 60 segundos de protoplastos inmóviles seleccionados (presumiblemente, los atrapados en el fondo) a una velocidad de 1 image / seg (1 Hz). Inicie la grabación con un lavado de 15 segundos de la solución isotónica (esto constituye la línea de base), cambiar a la solución hipotónica durante 45 segundos (para completar un total de 60 segundos desde el inicio de la perfusión). Guardar la película en formato TIF. NOTA: Elija un campo de visión con tantas células como sea posible, el cumplimiento de los siguientes criterios: forma esférica y con un contorno celular bien enfocado en su mayor perímetro (Figura 2A).
4. Análisis de la variación del volumen celular de uso de ImageJ
NOTA: Para analizar laserie de imágenes de una célula de la hinchazón, use el 'Explorador de imágenes' y 'plugins Protoplasto Analyzer' en el software ImageJ (escrito por Xavier Draye) 14. A partir de los protoplastos elegidos en su primer punto de tiempo, el plug-in 'de protoplastos Analizador' detectará automáticamente los bordes protoplastos (contornos) y calcular la evolución temporal de sus áreas durante el experimento (los plugins están disponibles con el programa de análisis PfFit, a continuación) .
- Iniciar ImageJ. Para abrir la película, haga clic en "Archivo" en el panel de ImageJ, a continuación, de forma consecutiva en los menús desplegables medida que se desarrollan: "Importar" y luego "Explorador de imágenes". Resalte la película elegida, a continuación, haga clic en él, a continuación, haga clic izquierdo sobre 'Protoplasto Analizador'. Navegar a través de la película (mediante un control deslizante en la imagen inferior protoplasto) para identificar protoplastos que permanecen prácticamente inmóviles durante el experimento - éstos serán analizados. De vuelta en la primera image, con el ratón, dibuje círculos (recogidos de las herramientas de dibujo ImageJ) alrededor de los protoplastos seleccionados (Figura 2B), a continuación, haga clic en "Aceptar" en la tabla "parámetros de detección" que aparecían.
- Para iniciar el algoritmo de detección de protoplastos, haga clic en 'local' en el panel superior de la imagen de protoplastos, a continuación, "Proceso" en el menú desplegable. Examine los círculos verdes alrededor de los protoplastos seleccionados (Figura 2 C) a lo largo de la película. Guarde el 'resultado' en un archivo de Excel. Salir ImageJ. NOTA: En caso de que aparezca un punto rojo (para indicar un mal ajuste de contorno - por lo general debido a un contraste de imagen pobre), vuelva a ejecutar con diferentes parámetros.
- Para separar las líneas pertenecientes a cada celda (que - si se analizaron simultáneamente dos o más células - se entrelazan, porque el análisis se realiza fotograma a fotograma), en Excel, ordenar los datos guardados por la columna del número de células ("objeto" ).
- Para determine el factor de conversión de píxel a m para obtener el valor real de P f, snap una imagen de un gobernante micrómetro mediante el mismo objetivo 20X microscopio. Arrastre una línea (extraído desde las herramientas de dibujo ImageJ) a lo largo de la imagen regla y leer el número de píxeles equivalente a la longitud de la regla en la parte inferior del panel principal ImageJ. Convertir los valores del área de píxeles arbitrarias en el archivo de Excel en m 2. Guarde el curso zonas de tiempo (para cada celda por separado) como un archivo de texto (dos columnas de números solamente). NOTA: Este será un insumo para el programa 'PfFit' volumen ajustado.
5. Modelado de la Tasa de Cambio osmolaridad en la Sala Experimental Usando ImageJ y la f Fit Matlab Programa P
- Añadir 2 mg cianol xileno (Tabla 1, a continuación) a 100 ml de la solución isotónica (para producir el "Indicador de tinte ').
- Prepare el sistema de perfusión (como en 3.1) con el indicador de Dye y la h no teñidossolución ypotonic.
- Sellar una hoja de cubierta con grasa de silicona a la parte inferior de la cámara de plexiglás, a continuación, rellene suavemente la cámara con el Indicador de Dye, cúbralo con una hoja de cubierta (al igual que con los protoplastos antes) y colocarlo en la platina del microscopio.
- Conecte la cámara al sistema de perfusión y la bomba, y encienda el flujo Indicador de tinte para una perfusión constante en l ml / min.
- Grabar una película de 60 segundos a una velocidad de 1 Hz. Inicie la grabación con 15 segundos de Indicador Dye, cambiar a la solución hipotónica durante 45 segundos. Dejar de filmar. Lave con el Indicador de tinte (por lo menos durante 30 segundos), a continuación, iniciar una nueva película. Repetir unas 5 - 6 veces y guardar todas las películas
- Utilice el software ImageJ para analizar las imágenes de vídeo de la transmitancia Indicador de tinte para obtener un transcurso de tiempo promedio de la transmitancia de cambio.
- Iniciar ImageJ, haga clic en "Archivo" y, a continuación, 'Open', y navegar por la película. Para cada película, dibujar un 10 píxeles de ancho vertical,rectángulo en cualquier parte de la imagen 1 st de la película. Haga clic en "Imagen" en el panel principal ImageJ, a continuación, haga clic en "Recortar" en el menú desplegable.
- Para alinear los 60 cuadros (de la película 60 segundos) en una fila, haga clic de nuevo 'Imagen', a continuación, en forma consecutiva en los menús desplegables medida que se desarrollan: "Pilas" y "Haz Montage '(columnas 60, filas 1). Dibuje un 1 píxel alta rectángulo horizontal en cualquier lugar a lo largo de toda la fila de imágenes y haga clic en "Analizar" en el panel principal ImageJ, a continuación, haga clic en el perfil de parcela 'en el menú desplegable. NOTA: A 'Parcela de Montage "ventana aparecerá (no se muestra), y una lista de datos de transmitancia se pueden abrir desde el menú. Cada imagen de la película está representado en esta lista por 10 valores de transmitancia originarios de su amplio rectángulo de 10 píxeles y en consecuencia la "base de tiempos" (el número secuencial de la imagen) es 10 veces más.
- Copie las listas del dat transmitanciaa (una lista por película) a un archivo de Excel. La media de los cursos de tiempo de transmitancia obtenidos de las varias películas de los rubores Indicador Dye. Generar una base de tiempo real, multiplicando el número secuencial de la imagen en un 0,1. Guarde el curso del tiempo promedio (dos columnas) a un archivo de texto. NOTA: Antes de promedio, si se desea, trazar los cursos de tiempo individuales, de rechazar cualquier irregularidad. Asegúrese de que la película incluye al menos 5 final sec de la transmitancia en estado estacionario del indicador Dye.
- Inicie el programa de ajuste P f Fit Matlab (el panel 'Indicador Fit', Figura 3) para calcular los distintos parámetros de la evolución temporal de la osmolaridad. NOTA: en base a las concentraciones iniciales y finales conocidos de la solución en el baño, el curso temporal del cambio de concentración osmótica de la solución se calcula a partir de la evolución en el tiempo de concentración (calculado, a su vez, a partir de la transmitancia Indicador de tinte), suponiendo que sigue la misma dinámica que laconcentración de colorante. P f Fit es un programa disponible para su uso de forma gratuita. El 'PfFit_Installer_web.exe' se puede descargar desde: P f Guía de compatibilidad usuario con explicaciones detalladas y definiciones es accesible a través de Jove como un archivo suplementario, lo que ayuda a familiarizar al usuario con el programa Fit P f.
- En el panel 'Indicador Fit', importar los datos de la evolución en el tiempo promedio de la transmitancia Indicador Tinte ('archivo de datos Indicador', Figura 3A) e introducir manualmente los parámetros del experimento actuales y las estimaciones iniciales de los parámetros 'width' y ' t_half 'que describe la evolución temporal de la concentración del tinte indicador (Figura 3B. Haga clic en "Ejecutar" para ver las parcelas de la evolución temporal de la concentración del tinte indicador (datos reales y en forma, la figura 4A), y de la calculada baño de modelado () osmolaridad (Figura 4B). NOTA: agood ajuste a los datos es esencial (una recomendación: comenzar con los valores que se muestran en la Figura 3).
6. Determinación del P f utilizando el programa de ajuste de P f Fit Matlab
NOTA: Además de los supuestos básicos en relación con el comportamiento de un protoplasto como un verdadero y perfecto osmómetro 11, la determinación de P f se basa en la presunción de que P f puede cambiar con el tiempo, que esta dinámica de P f subyace el tiempo curso del cambio de volumen de células y que tres parámetros son suficientes para describirlo: P fi (el valor inicial de P f), Pendiente Pf (la tasa del cambio lineal de P f) y de retardo (el periodo desde el inicio de la bañera cambio de la osmolaridad hasta el inicio del cambio de volumen celular). Diferentes modelos pueden ser probados, incluyendo diferentes combinaciones de estos parámetros y sus valores, incluyendo los valores nulos 11. P
- Cámbiese al panel 'Volumen Fit' (Figura 5). Elija para importar el archivo de áreas de datos (el archivo de texto con el transcurso del tiempo de las "áreas" de los protoplastos analizados, la figura 5A). Elija 'Última Indicador de montaje' como fuente de parámetro (Figura 5B; ver la 'P f Guía de ajuste del usuario de alternativas). NOTA: Estos parámetros (Figura 5D) sirven entonces para regenerar el cambio osmótico en el baño para los volúmenes procedimiento de ajuste.
- En el panel de 'Volumen Fit' (Figura 5C), inicializar (rellenar las conjeturas iniciales para los parámetros F) P: P f, Pendiente Pf y Delay (una recomendación: comenzar con 1, 1, y 30, respectivamente), eligió el modelo 'Clase' (una recomendación: comenzar con la Segunda y la marca 'cheques' para los tres parámetros que se instalen). Haga clic en "Ejecutar", y luego calcular visualmente la cifra provisional (Figura 5E) y ajustar el parámetro de retardo y la longitud del registro, si es necesario.
- Examine la gráfica resultados (Figura 6) para evaluar la calidad apta y registrar el error en forma. Cambie los parámetros de inicialización de algunas Dobla cada una, y re-'Run '. NOTA: No se desanime cuando el programa se atora - simplemente reinicie el programa!
- Repita este procedimiento varias veces, a partir de diferentes combinaciones de parámetros de inicialización, el objetivo para el valor más bajo del error de ajuste.
- Copiar la lista de los resultados de ajuste directamente desde la pantalla, o encontrarlos en tél PfFit-generó archivo '_FIT_Vol_Results.txt'.
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Representative Results
Con el fin de determinar el P f y comparar la actividad de diferentes AQPs, se utilizan protoplastos de mesófilo de la hoja de Arabidopsis. Se encontró que estos protoplastos a tener bajos basal (fondo) los niveles de P f 7 y pueden servir como un sistema funcional-expresión para permitir mediciones P f reproducibles.
Se aislaron protoplastos de una hoja madura de una planta Arabidopsis 6 semanas de edad y tres genes construye con genes de Arabidopsis AQP (AtPIP2; 1) y el maíz (ZmPIP1; 2 y ZmPIP2; 4) fueron transitoriamente (y por separado) expresan utilizando la transformación PEG método 15. Suponiendo que el caso de la transformación es simultánea para un gran número de plásmidos aplicados a la célula, independientemente de su naturaleza y función de los resultados que mostraron una tasa de éxito del 100% para sincronizada la expresión transitoria de dos plásmidos en una célula se informó anteriormente para otros sistemas de plantas15,16, que se co-transformaron con un vector que codifica la proteína verde fluorescente (EGFP) con el fin de etiquetar los protoplastos transformados (Figura 7).
Para los ensayos de P f, los protoplastos se pusieron en la cámara experimental (Figura 1B) y la GFP marcado protoplastos fueron controlados por el vídeo mientras se lavaron inicialmente con la solución isotónica (600 mOsm), después con la solución hipotónica (500 mOsm), utilizando el sistema de perfusión (Figura 1A).
Los cursos de tiempo de los cambios de volumen celular (Figura 8A) se obtuvieron para cada célula en dos etapas: en primer lugar, el "Explorador de imágenes" y plugins 'Protoplasto Analyzer' fueron utilizados para generar el curso temporal de los cambios en el contorno de la célula (Figura 2), a continuación, se utilizó el programa de ajuste de Matlab P f Fit (Figura 5) para importar theszonas E y convertirlos a volúmenes de células. Los valores de P F (Figura 8C) se obtuvieron para cada celda utilizando el programa Fit P f (Figura 5), basado en el curso del tiempo de los volúmenes de células y, adicionalmente, en el curso del tiempo promedio importado de los cambios de transmitancia del indicador Tinte (Figura 3), convertido a la evolución en el tiempo del cambio de concentración de indicador del tinte (Figura 4A) y, a continuación - a la evolución en el tiempo del cambio de la osmolaridad baño (figuras 4B, 6A y 8B). Vale la pena señalar, que Delc, la diferencia en las concentraciones osmóticas en la célula (Cin) y en el baño (Cout), es decir., La fuerza impulsora para la afluencia de agua, se debió casi exclusivamente a los cambios de Cout (Figura 6A ). En este experimento, P f aumentó durante el ensayo (Figura 6B).
El P f f de la célula de control transformado con GFP sola (Figura 8C).
Figura 1: El sistema volumen-ensayo. (A) La configuración experimental: El sistema de perfusión contiene depósitos de solución (columnas de infusión, 'Cols'), el tubo (T), las válvulas (V) y una bomba peristáltica (P) conectado a la corredera plexiglás establecido sobre la mesa microscopio. SA = solución hipotónica, es la solución isotónica, Cm cámara. (B) una vista ampliada de la corredera de plexiglás con la cámara experimental (Chr) y el tubo unido a través de una entrada (In) conector de colector. La solución se aspira desde la cámara a través de una salida (Out) a la bomba. (C) Un dibujo esquemático de la diapositiva de plexiglás (sentido antihorario: vista superior, vista de lado largo y vista del lado corto): a = cubierta de vidrio de deslizamiento, el fondo de la cámara central; b = claro cinta adhesiva (Tabla 1), que sirve como un fondo para las ranuras de entrada y salida de solución conducen hacia y desde la cámara central; cuando se sustituye la cinta Scotch (sólo de vez en cuando), un agujero se corta en ella debajo de la cámara; c = un bloque de plexiglás pegado a la corredera; d = un agujero conector de salida. Los números son mm (pero el dibujo no está a escala). (D) una vista ampliada de la porción central de la corredera con la cubierta transparente (también plexiglas) que cubre parcialmente la cámara central (flechas). (E) Dibujo esquemático (top y vistas laterales) de la cubierta transparente. El tamaño de la empuñadura cubierta transparente (plástico verde en D) es arbitraria. Otros detalles son como en C.
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Figura 2: Análisis de la hinchazón protoplastos imágenes utilizando el plugin de 'Protoplasto Analizador'. (A) a, la primera imagen de la película con protoplastos, b, como en A, pero círculos amarillos indican la selección realizada después de revisar la película, antes de que los contornos se autodetectables, c, desde la primera hasta la última imagen de los círculos verdes bien seguir los contornos de los protoplastos "buen comportamiento" sometidos a análisis. (B) 'parcelas tiempo'-curso (con unidades de número de la imagen en el eje de abscisas) de las áreas calculadas dentro de los contornos de protoplastos (' Area ', en píxeles cuadrados ), para cada seguimiento (y numerada) de protoplastos. (C) El panel de entrada parámetros de plug-in la 'Protoplasto analizador. Cuatro 'parámetros de detección "se pueden ajustar para afinar el algoritmo de detección de protoplastos. El 'número de píxeles del borde 'Parámetro establece el espesor mínimo del contorno de protoplastos (valor por defecto: 5). El parámetro 'peso relativo' influye en la diferencia de umbral de nivel de gris entre el área de protoplastos interior y el borde exterior (por defecto: 2). La "relación de circunferencia máxima 'define un umbral de exclusión de protoplastos siempre que su forma se desvía de un círculo. Este parámetro es la relación de la circunferencia de protoplastos a la circunferencia de un círculo perfecto que tiene la misma área que la de protoplastos (por defecto: 1,05). El 'aumento máximo área' (% de aumento por tiempo de paso) parámetro excluye protoplastos con zona de contorno aumenta por encima del valor del parámetro (valor por defecto: 5%). Por último, el plugin también se encarga de los pequeños movimientos de protoplastos pero dejará de obedecer a protoplastos que se mueven rápidamente o que desaparecen del área de la imagen. La película se puede volver a ejecutar tantas veces como sea necesario, y un solo de protoplastos puede reanalyzed separado..com / files / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Panel El 'Indicador Fit' del programa Fit P f. Esta parte se traduce el curso temporal indicador de transmitancia en curso temporal osmolaridad baño. (A) Explorar para el archivo de datos guardado que contiene el curso temporal de los cambios de transmitancia del indicador Dye. (B) utilizar la lista previamente guardada de variables y parámetros, o insertar manualmente los 5 valores de las variables del experimento actual: 'true_C_init' y 'true_C_end' (los osmolaridades de la solución del baño inicial y la solución P f -assay perfundidos a través de la bañera) ', t_start_wash'(La duración de la toma de muestras de referencia en el nivel inicial Indicador del tinte),' threshold_% "(% del valor de referencia, a la que el programa detecta automáticamente la salida de transmisión de línea de base; 1-5% son por lo general el más eficaz), 'N_steady_st_pts '(el número de muestras - con 10 muestras que representan cada imagen Indicador de colorante absorbido - que se promedian en el nivel de estado estacionario final del Indicador Dye, crucial para la conversión de la concentración de indicador Dye a la concentración osmótico) y aproximaciones iniciales para dos de los cuatro parámetros de la evolución en el tiempo sigmoidal Indicador Tinte transmitancia, 'width' y t medio (Más o menos relacionada con la duración de la parte de transición de la sigmoide, y a su punto medio, respectivamente; t medio puede ser negativo!). Dos mejores parámetros de ajuste, además de 'width' y t la mitad se obtienen sin necesidad de aproximación inicialES: lag ('flush_lag'), el tiempo entre la apertura de la válvula a la llegada de la solución en el baño, y 'C_init', sin significado físico, pero necesaria para la descripción de la evolución en el tiempo osmolaridad (ver la P Suplementario Guía del usuario f Fit.
Figura 4:. La concentración del tinte indicador en el baño y la osmolaridad del medio (A) El curso temporal de la concentración Indicador Dye, calculado directamente de datos (puntos) y de los parámetros de mejor ajuste (línea), ya que se lava de distancia por una solución no teñido. (B) El curso de tiempo calculado del cambio de la osmolaridad de la solución del baño, suponiendo que sigue la misma dinámica que el cambio de la concentración de indicador Dye.
Figura 5:. El 'Volumen Fit' del panel del programa Fit P f (A) Busque el archivo de datos cronológicos área del protoplasma analizado (B) Elija el 'Last Indicador de montaje' opción de importar los parámetros del experimento de la. . última ejecución a través del 'Indicador Fit' (ver la Guía del usuario Suplementario P f Fit alternativas) (C) / 'Class' 'Modelo Tipo': Clase I contiene el modelo más simple 1, Clase II - modelos 2-5, clase III - los modelos de 6 - 8 Los modelos difieren con respecto a los parámetros que se están fijas y que se están ajustado (es decir, variables libremente.) durante el procedimiento de ajuste (marque la casilla para permitir que varían), y si es o no ' SlopePf 'y / o' Delay 'son nulas. El modols 1-6 se discuten en detalle por Moshelion et al 11.. 'Combinaciones' enumera las opciones de los parámetros dictados por la elección del 'Modelo Tipo' / 'Class'. Entre los modelos con un resultado en forma parecida - elegir el más simple! Inicialice la 'P f', 'Pendiente Pf' ('Slope_Pf') y los parámetros de "retraso" como se muestra (más detalles acerca de "retraso" en E infra). (D) Las variables y los parámetros que describen el curso de tiempo de la osmótico baño de cambiar de entrada son ya sea manualmente, o como se describe en B. (E) Una parcela provisional, invocado por golpear 'Ejecutar', de un transcurso de tiempo de cambio de volumen (calculado de las zonas de contorno celular) para ayudar en la elección del valor inicial para el parámetro 'Delay'. Estimado, por echando un vistazo, la longitud total de la línea de base a partir de la 1 st punto hasta el inicio del cambio de volumen celular (la 'retraso inclusiva: la suma de 't-empezar-wash' + 'lag' / 'ras-lag' + la "fisiológica" "retraso"). Introduzca este valor como parámetro de entrada para el "retraso" en el panel 'VolumeFit' y 'Run' de nuevo (véase también la Guía del usuario Suplementario P f Fit).
Figura 6: Los resultados de montaje (A) "Detrás de las escenas": los cursos de tiempo finales calculados de las concentraciones osmótico en los dos compartimentos:. El baño (Cout, línea verde) y la célula (Cin, línea azul; Cin es calculado con base en el cambio de volumen de protoplastos y la suposición de que la membrana plasmática es permeable al agua sólo - la "osmómetro perfecta y verdadera" 11), y el curso temporal de la diferencia entre ellos (DACA, Línea roja), que es la fuerza motriz para el flujo de agua, 'Eo-Tlag' marca el fin de la 'flush-lag' y el inicio del desafío hipotónica (aquí sólo en alrededor de 21 segundos). Cuadro rojo: el error del valor de ajuste (fit-ERR, véase la definición en B a continuación) (B) El resultado final de montaje de la evolución en el tiempo del volumen;. Caja verde: 'variables de entrada "son los valores introducidos a través del panel del P f Fit /' VolumeFit '(definido en la leyenda 5A Figura). Negro caja: 'exptl-Vol "y" Vol-equipado "son los datos experimentales y el volumen calculado utilizando los parámetros de mejor ajuste, respectivamente,' Eo-Tlag 'es el mismo que en A, marcas' Eo-Delay 'el el inicio de cambio de volumen. 'Area de hasta el 3% "marca el volumen en el que la superficie se incrementó en un 3%, el límite a la supuesta capacidad de la membrana celular a estirarse sin romperse. 'Pf (escalada)' es el curso temporal de la conexión-based calcula P f, que abarca los valores indicados por debajo de la caja roja como 'Span de P f'. Red Box: 'EQUIPADO parámetros' son los valores de los parámetros de mejor ajuste: 'Pf i' (el P inicial f), "retraso" (el período entre el inicio del desafío hipotónica y el inicio del cambio de volumen (que, de acuerdo con el modelo de 5 utilizado en este ejemplo, es también el comienzo en un cambio en el valor f P), y 'pendiente-P f' (la constante de velocidad de cambio en el valor P f 'fit_ERR' se muestra en A. - el objetivo de la reducción al mínimo del procedimiento de ajuste Matlab - es la desviación "root-mean-square" (es decir, la raíz cuadrada de una desviación al cuadrado promedio) de un punto verde en la línea de negro), presentado como% del volumen de referencia It. es por este valor que el éxito relativo de ajuste repetido con diferentes valores de inicialización parámetro es juzgado. ANOTA DE PRECAUCIÓN: Como los valores de los parámetros de ajuste óptimo podría ser el resultado de un mínimo local que se encuentra en el procedimiento de minimización de errores - para verificar que se ha encontrado un mínimo global, se requieren varias pasadas con diferentes valores de inicialización para estos tres parámetros (y la fit_ERR más bajo se debe buscar durante estos intentos cuadro azul:. deltas son los cambios que se produjeron a finales del periodo de cambio de volumen ajustable: 'promedio Volm%' es la medida relativa de la variación del volumen de protoplastos calculado y 'Area promedio%' es el cambio relativo de la superficie de protoplastos. El tamaño inicial de la celda viene dado por 'radio', derivado del valor medio de la zona del contorno basal de protoplastos.
Figura 7: Epi-fluorescencia vista microscopía de protoplastos de mesófilo (A) bajo luz blanca transmitida y (B) a 488 nm de excitación y 520 nm de emisión. Barra de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8:. Cambio de volumen y la permeabilidad al agua osmótica extraído, P f (A) Evolución temporal (60 segundos) de protoplastos hinchazón tras la exposición al desafío hipotónica (media ± SE) (B) La concentración osmoticum calculada en el baño durante el. desafío hipotónica. Tenga en cuenta que mientras que el flujo de la solución hipotónica se enciende en 15 segundos, alcanzó el baño sólo después de unlag, aquí de 5.9 seg. (C) P f (media ± DE). Los asteriscos indican diferencias significativas con el control (p ≤0.05). Los datos de al menos tres experimentos independientes para cada tratamiento con un total de n protoplastos (de control: n = 52, AtPIP2; 1: n = 13, ZmPIP1; 2: n = 28, ZmPIP2; 4: n = 34).
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Discussion
Descrito aquí es un procedimiento sencillo y muy eficaz para medir la P f de protoplastos de plantas aisladas, aplicable en principio también a otras células esféricas, por ejemplo., Oocitos de rana 11. Este método se basa en la medición de la P f en respuesta a un desafío osmótica de la célula. En contraste con los otros métodos basados en este enfoque, sin embargo, el cambio de soluciones, es decir, de la osmolaridad, no es instantánea, pero gradual, durante un baño de perfusión constante, empezando con la solución isotónica, en el que el volumen de la celda de referencia es establecida. Además, este método no implica una pipeta de aspiración y por lo tanto reduce al mínimo la perturbación de los protoplastos.
El enfoque presentado aquí permite mediciones de una variedad de protoplastos, de diferentes plantas o tejidos. Sin embargo, a causa de los cálculos involucrados, sólo las células esféricas pueden ser analizados. Además, el aislamiento enzimático de le protoplastos y la osmolaridad de las soluciones deben ajustarse a las células ensayadas (por ejemplo, el aislamiento enzimático de protoplastos de mesófilo de tomate toma alrededor de una hora, considerablemente más largo que en el caso de protoplastos de Arabidopsis).
El aislamiento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo de acuerdo con el protocolo presentado es simple, rápida y eficiente, produciendo un alto número de protoplastos. En particular, esto, combinado con sus bajos niveles basales P f y su alta eficiencia de transformación (Figura 8), ellos un sistema atractivo para la expresión funcional de AQPs hace, para permitir comparaciones cuantitativas de P f inducida por diferentes isoformas AQP. Cuando se expresa en estos AQPs protoplastos con un gen marcador (tal como GFP), se puede detectar fácilmente los protoplastos en la cámara experimental para células fluorescentes para analizar.
Vale la pena comprobar si este sistema es un alternativ viablee para ovocitos para ensayar AQPs incluso de fuentes animales (que las proteínas animales funcionales pueden expresarse en células vegetales ha sido ya demostrada 17).
Utilizando el programa de ajuste f P, dos parámetros más, al lado de la P f, se obtienen para la descripción de las respuestas a los retos de protoplastos hipotónicas: retardo, el tiempo entre el inicio de cambio de volumen y el comienzo de la perfusión del baño, y pendiente Pf, la tasa de cambio en P f durante el desafío osmótica (descrito en detalle en 11).
Para establecer el procedimiento de ajuste del volumen cada dato experimental debe realizarse varias veces, el suministro de valores diferentes de partida (inicialización) para estos parámetros, el tiempo de elegir el ajuste con el menor error. Este proceso de minimización de error podría ser interpretado como la búsqueda del valle más profundo (un "mínimo global") en un paisaje de valles con diferentes profundidades, entre hombrecolinas y, y no intentar quedar atrapados en un valle poco profundo (un "mínimo local").
Se obtienen dos tipos de P f, P f en el comienzo mismo de la hipoosmótica hinchazón respuesta («P f inicial ') y P f calcula al final de 15 segundos de la hinchazón, a contar desde el final de la demora ("f fi nal P '). La diferencia entre los dos se discute completamente por Moshelion et al. 11, con respecto a los 6 modelos analizados.
Hay dos pasos críticos en el protocolo: en primer lugar, un buen ajuste a la evolución temporal de la concentración de indicador Dye, segundo, un buen ajuste a la evolución en el tiempo del volumen de la célula de la hinchazón.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas del Fondo Nacional Belga para Científicos c Investigación (FNRS), el Interuniversitario de atracción polacos Programa-belga Política de Ciencia y la "Comunidad Francesa de Bélgica-Acciones de Recherches Concertées" a FC, de la Fundación de Ciencias de Israel Jerusalén ( ISF) a MM (Grant # 1311-12), y para NM (Grant # 1312-12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
