द्वारा उत्पादित उपकला नुकसान का विश्लेषण<em> एटामोइबा हिस्टोलिटिका</em> संक्रमण
Summary
एटामोइबा हिस्टोलिटिका से मानव संक्रमण amoebiasis, उष्णकटिबंधीय देशों में डायरिया का एक प्रमुख कारण हो जाती है. संक्रमण सेल सेल संपर्क के उद्घाटन और फलस्वरूप दस्त, कभी कभी जिगर के संक्रमण के द्वारा पीछा उत्तेजक, आंतों उपकला कोशिकाओं के साथ रोगज़नक़ बातचीत से शुरू की है. यह लेख amoebiasis रोगजनन के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए जल्दी मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का आकलन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करता है.
Abstract
एटामोइबा हिस्टोलिटिका मानव amoebiasis की प्रेरणा का एजेंट, उष्णकटिबंधीय देशों में डायरिया और यकृत फोड़ा का एक प्रमुख कारण है. संक्रमण आंतों उपकला कोशिकाओं के साथ रोगज़नक़ की बातचीत से शुरू की है. यह बातचीत इस तरह तंग जंक्शनों (टी जे) के रूप में कहनेवाला संरचनाओं के विघटन की ओर जाता है. टी जे आंत लुमेन से मेजबान ऊतक अलग करने के लिए उपकला परत की सील किया जाता है. हाल के अध्ययनों से परजीवी प्रोटीन EhCPADH112 द्वारा टी जे के विघटन ई. के लिए एक शर्त है कि सबूत प्रदान उपकला बाधा शिथिलता के साथ है कि हिस्टोलिटिका आक्रमण. इस प्रकार, ई. के दौरान टी जे disassembly में शामिल आणविक तंत्र का विश्लेषण हिस्टोलिटिका आक्रमण amoebiasis रोगजनन के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है. यह लेख प्रारंभिक मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के आकलन और परजीवी आक्रमण क्षमता की अनुमति देता है कि एक आसान मॉडल प्रस्तुत करता है. विश्लेषण किया जा करने के लिए पैरामीटर शामिल हैं टीransepithelial विद्युत प्रतिरोध, उपकला सतह रिसेप्टर्स, अभिव्यक्ति में परिवर्तन और उपकला junctional मार्करों और उपकला कोशिकाओं के भीतर परजीवी अणुओं का स्थानीयकरण के स्थानीयकरण साथ EhCPADH112 की बातचीत.
Introduction
एटामोइबा हिस्टोलिटिका सूजन और दस्त. ई. के कारण मानव amoebiasis, एक आंत्र संक्रमण के जिम्मेदार एक एकल कोशिका प्रोटोजोआ है हिस्टोलिटिका वार्षिक 50 लाख व्यक्तियों को संक्रमित करता है, लेकिन संक्रमित लोगों के बारे में केवल 10% amoebiasis 1 के लिए जुड़े लक्षण विकसित. संक्रमण ई. युक्त दूषित भोजन या पानी की घूस पर तब होता है हिस्टोलिटिका अल्सर. आंत में अल्सर पेट के mucin का पालन करना और 2 पैदा करना है कि लाइव ट्रोफोजोइट्स उत्पादन. ट्रोफोजोइट्स आमतौर पर मल के माध्यम से उत्सर्जित कर रहे हैं कि अल्सर के रूप में. अन्य मामलों में और अभी तक अज्ञात कारणों के लिए, ट्रोफोजोइट्स आंतों उपकला परत को तोड़ने और अंतर्निहित ऊतकों आक्रमण. सबसे खराब मामलों में, वे रक्त प्रवाह में प्रवेश और जिगर के रूप में 3 अन्य अंगों को प्रभावित.
उपकला बैरियर तोड़कर शामिल हो गए कोशिकाओं को बनाए रखने कि उपकला transmembranal संरचनाओं के विघटन की आवश्यकता है. उपकला कोशिकासंपर्क तंग (टीजे) से मिलकर शिखर junctional जटिल द्वारा गठित और जंक्शनों (ए जे) adherens, और 4 desmosomes रहे हैं. सबसे शिखर जंक्शनों टी जे रहे हैं, और इसलिए, वे ई. द्वारा affronted पहली बाधा हैं मेजबान आक्रमण के दौरान हिस्टोलिटिका और कुछ अन्य रोगजनकों. टी जे ऐसे पड़ोसी सेल के रिसेप्टर्स के साथ होमोसेक्सुअल या heterophilic बातचीत में संलग्न है कि claudins, occludin और junctional आसंजन अणुओं (जाम) के रूप में transmembranal आसंजन रिसेप्टर्स के शामिल हैं. वे intracellularly उपकला को आगे यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए actin cytoskeleton के लिए आसंजन रिसेप्टर्स कि कनेक्ट (ZO) परिवार zonula occludens की पाड़ अणुओं से बंधे हुए हैं. टी जे अत्यधिक पानी और घुला हुआ पदार्थ के रिसाव को रोकने, आंत लुमेन से आंतों के ऊतकों सीलिंग के लिए जिम्मेदार हैं. टी जे परजीवी द्वारा बाधित कर रहे हैं के बाद इस प्रकार, ऊतकों पर हमला कर रहे हैं. ई. (मैं) Targ को अमीबा की आसंजन में शामिल लोगों को: हिस्टोलिटिका जैसे कई अणुओं secretesएट कोशिकाओं 5; एक्सोसाइटोसिस द्वारा मेजबान कोशिकाओं की हत्या में भाग लेने वाले (द्वितीय) झिल्ली सक्रिय कारक है, उदाहरण के लिए कहा जाता आयन चैनल के गठन पेप्टाइड्स 6,7 amoebapores; और (iii) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन नीचा और ऊतक विघटन 5,8,9 कि मध्यस्थता proteinases.
एक साथ EhCPADH112 जटिल है कि फार्म सिस्टीन प्रोटीज EhCP112 और आसंजन अणु EhADH112 दो ई. हैं हिस्टोलिटिका टी जे 10 के disassembly में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं कि प्रोटीन डाह. लाइव ट्रोफोजोइट्स, उनकी कुल lysates और secreted उत्पादों उपकला बाधा के टी जे जटिल और कार्यात्मक अशांति में आणविक परिवर्तन प्रेरित. इस अध्ययन में यह EhCP112 और EhADH112 इस प्रकार ई. की सुविधा, occludin और internalization और सेल प्रोटीन की गिरावट के लिए अग्रणी claudin -1 प्रोटीन के साथ बातचीत दिखाया गया है कि paracellular मार्ग के माध्यम से हिस्टोलिटिका प्रवेश द्वार.
हमारे आंकड़े और उन ओF अन्य समूहों 11-17 जोरदार परजीवी आक्रमण की अनुमति है कि विशिष्ट मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की आवश्यकता सुझाव है. इन मुलाकातों के आणविक आधार Unraveling amoebiasis रोगजनन का एक बेहतर समझ के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. वृद्धि की paracellular पारगम्यता द्वारा विशेषता ट्रोफोजोइट्स द्वारा टी जे के चुनिंदा अशांति, transepithelial विद्युत प्रतिरोध में कमी (आतंकवाद) द्वारा मापा जा सकता है. मेजबान epithelia की ओर परजीवी प्रोटीन के स्थानांतरण immunofluorescence धुंधला और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी, यह भी संभव प्रत्यक्ष बातचीत का संकेत उपकला junctional मार्कर के साथ अमीबा विषैलापन कारकों की सह स्थानीयकरण प्रकट कर सकते हैं कि एक विधि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस अनुच्छेद में, हम उपकला कोशिकाओं और ट्रोफोजोइट्स, खेती काटा और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और उनके परिणामों की जांच करने के लिए छेड़छाड़ कर रहे हैं कि कैसे विस्तार से वर्णन है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ई. द्वारा उपकला संक्रमण के दौरान इन विट्रो मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदेश में हिस्टोलिटिका, यह उपकला कोशिकाओं और ट्रोफोजोइट्स दोनों की अच्छी तरह से स्थापित संस्कृतियों क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
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