Summary
Kombinato 5 fluorescerande proteiner märkning av hematopoetiska stamceller och progenitorceller möjliggör in vivo klon spårning via konfokala och två-foton mikroskopi, som ger inblick i benmärg hematopoetisk arkitektur under regenerering. Denna metod tillåter icke-invasiv öde kartläggning av spektralt Kodade HSPCs-härledda celler i intakta vävnader för långa perioder efter transplantation.
Abstract
Vi utvecklas och valideras en fluorescerande märkning metodik för klonal spårning av hematopoetiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) med hög rumslig och tidsmässig upplösning för att studera in vivo blodbildningen med hjälp av murina benmärgstransplantation experimentell modell. Genetisk kombimärkning med hjälp lentivirusvektorer kodar fluorescerande proteiner (fps) aktiverad cell öde kartläggning genom avancerad mikroskopi avbildning. Kodar för fem olika ramprogrammen: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato och mCherry användes för att samtidigt omvandla HSPCs, skapar en mångsidig palett av färg markerade celler. Avbildning med konfokala / två-foton hybrid mikroskopi möjliggör samtidig hög upplösning bedömning av unikt märkta celler och deras avkomma i samband med strukturella komponenter i vävnaderna. Volumetric analyser över stora områden visar att spektralt kodade HSPC-härledda celler kan detekteras icke-invasivt i olika intakta vävnader, däribland benmärgen (BM), Under långa perioder efter transplantation. Live studier som kombinerar video-rate multifoton och konfokal tidsförlopp avbildning i 4D visar möjligheten att dynamiskt cellulär och klonal spårning på ett kvantitativt sätt.
Introduction
Produktionen av blodceller, benämnda hematopoies, underhålls av en liten population av hematopoietiska stamceller och progenitorceller (HSPCs). Dessa celler är bosatta i benmärgen (BM) i en komplex microenvironmental nisch som består av osteoblaster, stromaceller, fettvävnad och kärlstrukturer, alla inblandade i kontrollen av självförnyelse och differentiering 1,2. Som intakt BM har traditionellt varit otillgängliga för direkta observationer, samspelet mellan HSPC och deras mikromiljö är i stort sett uncharacterized in vivo. Tidigare har vi etablerat en metod för att visualisera 3D arkitektur intakt BM använder konfokala fluorescens och reflektion mikroskopi 3. Vi präglas expansion av EGFP-märkta HSPCs i BM, men användningen av endast en enda FP uteslutet analys av regenerering vid en klonal nivå. Helt nyligen vi drog fördel av Lentiviral Gene ontologi (Lego) vektorer konstitutivt uttrycker fluorescent protein (fps) för att effektivt markera celler 4,5. Co-transduktion av HSPC med 3 eller 5 vektorer genererar en mångsidig palett av kombinatoriska färger, vilket gör spårning av flera individuella HSPC kloner.
Märkt HSPC kombinerat med ny bildteknik tillåtet att spåra enskilda HSPC homing och inympning i BM av bestrålade möss. LEGO-vektorer användes för att markera HSPC med 3 eller 5 olika bps (från Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato och mCherry) och följa deras engraftment över tiden i BM av konfokala och två-foton-mikroskopi, vilket möjliggör tydlig visualisering av ben och annan matrisstrukturer, och förhållandet mellan HSPC kloner till komponenter i sin mikromiljö. HSPC renades såsom härstamningen negativa celler från C57BL / 6 möss BM, transducerade med LEGO-vektorer, och återinfuseras genom svansvenen injektion i Myelosuppression ablateras kongena möss. Genom att övervaka stora volymer av bröstbenet BM vävnaden visualiseras vi endosteal engraftment inträffar i början avBM förnyelse. Cell kluster med varierande färgspektra dök ursprungligen i nära anslutning till benet och utvecklats centralt över tiden. Intressant, efter mer än 3 veckor märgen bestod av makroskopiska klon kluster, vilket tyder på spridning av blodbildningen härrör från enskilda HSPCs intill varandra i märgen, i stället för omfattande spridning av HSPCs via blodomloppet. Det var mindre färg mångfald vid sena tidpunkter, vilket tyder på svårigheter att omvandla långsiktiga återinplantering celler med flera vektorer.
Dessutom HSPCs bildat kluster i mjälten, ett organ också ansvarig för hematopoies i möss. HPSC härledda enskilda celler skulle kunna lösas i tymus, lymfkörtlar, mjälte, lever, lunga, hjärta, hud, skelettmuskel, fettvävnad och njure samt. De 3D-bilder kan bedömas kvalitativt och kvantitativt uppskatta fördelningen av celler med minimala störningar av vävnaderna. Slutligen vi illustrerad möjligheten att levande dynamiska studier i 4D genom att kombinera resonant scanning multifoton och konfokala time-lapse avbildning. Denna metod gör det möjligt för icke-invasiv hög upplösning, flerdimensionella cell öde spårning av spektralt markerade celler populationer i deras intakt 3D arkitektur, som ger ett kraftfullt verktyg i studiet av vävnadsregenerering och patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss inhystes och hanteras i enlighet med handledningen för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health, och inskriven vid en NHLBI Animal Care och användning kommittén godkända protokoll. Kvinna B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) och C57BL / 6 möss, 6-12 veckor gamla, användes som givare och mottagare, respektive.
En lista över material, reagens och utrustning finns i tabell 1.
1. Lego Transduktion av Mouse HSPCs och benmärgstransplantation
Utför procedurer som beskrivs nedan i en certifierad skyddsnivå 2 (BSL-2) skåp (vävnadsodling huva).
- Produktion av Lego vektorer Kodning 5fps
- Använd lentiviral "Gene ontologi" (Lego) vektorplasmider, var och kodar för en annan FP från en stark konstitutiv SFFV promotor, däribland Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), och Lego-C2 (mCherry) vänligen tillhandahållen av Dr Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland); nu också tillgänglig från Addgene 5-7.
- För att producera LEGO vektorer, utsädes 5 x 10 6 293T-celler i 10 cm skålar (använd 12 rätter för varje vektor) 24 h före transfektion i 8 ml I10 medier (IMDM kompletterat med 10% FCS och glutamin / penicillin / streptomycin).
- Transfektera cellerna med kalciumfosfat som använder något modifierade CAPHOS kit rekommendationer:
- För varje platta mix 15 ug LEGO vektor, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 | ig PREV-TAT, och 1 | ig pMD2.G-VSV-G-plasmider i närvaro av 50 | il 2,5 M CaCl2, och tillsätt vatten till erhållande av en 500 | il total volym.
- Fällning DNA plasmider med 500 pl 2x HeBS (HEPES-saltlösning) och inkubera i 20 minuter i rumstemperatur före tillsats till varje platta i 293T-celler.
- Inkubera cellerna för6 h i en 37 ° C 5% CO2 inkubator; ta bort media och tillsätt färskt odlingsmedier 6 h efter transfektion.
- Samla odlingssupernatanter innehållande lentivirala partiklar från varje platta, dagligen, under tre dagar. Varje dag efter supernatant samling lägga färska I10 media till varje platta.
- Filtrera genom 0,22 um porer, pool och koncentrera supernatanter genom ultracentrifugering på en SW28 rotor under 2 timmar vid 71.900 xg och 4 ° C.
- Resuspendera supernatanterna i 1 ml StemSpan medier. Alikvotera de lentivirala lager i 200 fil och förvara vid -80 ° C.
- Titrering av Lentiviral Particles
Bestäm titern av Lego vektorpartiklar i insamlade supernatanterna via kvantifiering av transducerande enheter / ml med hjälp av NIH3T3 celler. Titrar blir möjligt att beräkna volymen för varje vektor supernatant som behövs för att leda till den önskade relativa mångfald av infektion (MOI) för experimentell målceller.- Platta 5 x 10 4 NIH3T3 celler per brunn (12-brunnar) i 2 ml I10 medier en dag innan titreringen.
- Bered fem-faldiga seriespädningar av vektor-supernatanter i I10 media kompletterade med protaminsulfat (4 mg / ml 1,000x är).
- Ta bort materialet från cellerna, och ersätta med 500 pl överstående lösningar innehållande motsvarande 2, 0,8, 0,32 och 0,128 l av koncentrerad virus.
- Bestäm antalet (nr) av celler som finns per brunn vid tiden för transduktion, räknar en kontrollbrunn.
- 6 h efter transduktion, tillsätt 2 ml I10 media och inkubera under 3 dagar vid 37 ° C, 5% CO2.
- Skörda cellerna från varje brunn med användning av trypsin-EDTA, och bestämma procentandelen av fluorescerande celler (% FP) via flödescytometri.
- Beräkna den titer som följer, i genomsnitt titrarna som erhållits för varje brunn (utspädning) resulterar i en% FP mellan 1 och 50%: Titer (vektorpartiklar / ml) = Nejx% FP / volym vektor supernatant (ml). Medelvärdet titer som erhållits för varje utspädning om% FP är mellan 1 och 50%.
- Mouse Cell Collection, Rening, transduktion och transplantation (schematiskt visad i figur 1A anpassad från Malide et al. 4).
- Offra donatormöss av en godkänd procedur. Harvest benmärg från främre och bakre ben: dissekera överarmsben, lårben och skenben, grundligt ta bort alla muskler, ledband och överflödig vävnad från ben, spänner över i slutet av varje ben så nära som möjligt till det gemensamma, och spola benmärgen ur benet med användning av en 27-0 G nål på en spruta innehållande I10 medier.
- Pellets hela benmärgsceller för 10 minuter vid 500 xg, 4 ° C och lysera röda celler två gånger med 50 ml ACK-buffert. Återsuspendera cellerna i 10 ml I10 media.
- Rena härstamning negativa (Lin-) progenitorceller med MACS härstamning utarmning Sats enligt ett modifierat kit protocol:
- Använd 30 pl anti-Biotin mikrokulor istället för 10 l / 10 7 celler; slutföra tvättsteg med I2 media (IMDM kompletterat med 2% FCS) i stället för buffert.
- Sätt ett tvättsteg mellan inkubation med biotin-antikropp Cocktail och inkubation med Anti-biotin mikropärlor; och jämvikta kolonnen med I10 istället för buffert.
- Kultur Lin-celler för 48 h vid en startdensitet av 5 x 10 5 celler / ml i StemSpan medium kompletterat med 10 ng / ml murint IL-3, 100 ng / ml murint IL-11, 100 ng / ml humant Flt-3 ligand och 50 ng / ml murin stamcellsfaktor.
- Överför 1 till 4 x 10 5 celler till 12-brunnars plattor belagda med RetroNectin och transducera med LEGO supematanter, var och en vid en infektionsmultiplicitet (MOI) av 6-7 för att uppnå 50% expressionseffektiviteten för varje FP, i närvaro av StemSpan media och cytokiner i detalj ovan och 4 | ig / ml protaminsulfat.
- Transducera cellermed varje LEGO vektor individuellt såsom beskrivs i steg 1.3.5 och blanda celler efter transduktion (benämnd Mix) eller sam-transducera celler med alla 5 LEGO vektor supernatanter samtidigt (benämnt Co). Ta bort celler 24 timmar senare, tvätta en gång med StemSpan media utan cytokiner och resuspendera dem i StemSpan media utan cytokiner för transplantation, eller överföra dem till färskt medium med cytokiner, och kultur för ytterligare 96 timmar innan konfokalmikroskopi och flödescytometri.
- Utför benmärgstransplantation genom infusion transducerades Lin HSPCs via svansvenen injektion i 11 Gy enkeldos pre-bestrålade mottagare (6-18 h före transplantation) mottagare, i en volym av 100 | il, vid en cell dos per mus motsvarar en -4 x 10 5 Lin-celler som ursprungligen klädd för transduktion. I varje experiment transplantera en hel kohort av djur med samma population av omvandlade givar BM-celler.
- För in vitro karaktärisering av transducerad HProduktresuméer, odla cellerna för ytterligare 4-5 dagar i StemSpan kompletterat med cytokiner och analysera med flödescytometri för transduktion effektivitet och genom mikroskopi för färg mångfald.
- Offer individuella möss och hämta vävnader och organ för avbildning, vid olika tidpunkter upp till 120 dagar efter transplantation.
- Spraya med etanol pälsen på musen och incisionsfilm huden på den ventrala sidan undvika hår spridning.
- Dissekera och punktskatter i enlighet med standardförfaranden mjälte, popliteala lymfkörtlar, lungor, hjärta, hud, fettvävnad, skelettmuskel, njure, lever, liksom huvudet för att få tillgång till calvaria.
- Alternativt kan du använda calvaria eller inrätta ett fönster ben för levande avbildning upprepade gånger över tiden 2,8,9 eller bild ytliga organ såsom hud och lymfkörtlar i levande djur.
- Placera enskilda organ i 35 mm nummer 0 täckglas odlingsskålar i 50-10056, l PBS för avbildning dem intakta utan snittning, fixering eller vidare behandling som beskrivs i steg 2,5.
- För volymröntgen, hålla organen in i kall PBS fram till användning. För tidsförlopp avbildning omedelbart gå till att avbilda organ i DMEM, 10% FBS innehållande 20 mM HEPES vid 37 ° C
- Offer individuella möss och hämta vävnader och organ för avbildning, vid olika tidpunkter upp till 120 dagar efter transplantation.
2 Konfokal och Två-foton mikroskopi och bildanalys
- Utför mikroskopi avbildning med en Leica SP5 fem kanaler konfokala och multifoton system utrustat med flera linjer Argon, diod 561 nm, HeNe 594 nm, och HeNe 633 nm synliga lasrar. Användning i 2-foton-läge, en pulsad femtosekund Ti: Sapphire (Ti-Sa) laser, avstämbara för excitation från 680 till 1080 nm med spridning korrektion. Användning i experiment med rödskiftade ramprogrammen (tdTomato och mCherry), en optisk parametrisk oscillator (OPO) laser för att utöka produktionen våglängdsområdet så långt som 1,030-1,300 nm, sekventiellt eller samtidigt med tHan Ti-Sa laser.
- Bild olika vävnader med hjälp av en HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA vatten doppa mål (WD = 2,5 mm), en HC-PLAPO-CS 20X / 0,70 NA torr mål (WD = 0,6 mm) eller HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA vattenimmersionsobjektiv (WD = 0,6 mm).
- Erhåll konfokal fluorescensspektra som samlar lambda stackar (xyλ) av emitterat ljus i 5 nm-bandbredder av det synliga spektrumet från BM-celler transducerade med en enda FP LEGO vektor liksom av kontroll, icke-transplanterade BM.
- Process bilder med Leica LAS-AF v2.4.1 programvara för att skapa referensspektra av alla 5 ramprogrammen samt autofluorescens (Figur 2A). Använda individuell FP-spektra och skillnaden i fluorescens ljusstyrka (uttryckt som% av EGFP) av Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) och mCherry (47%) som 5 sekventiella avbildnings kanaler enligt följande: Cerulean (458/468 till 482 nm), EGFP (488/496 till 514 nm), Venus (514/523 till 558 nm), tdTomato (561/579 till 597 nm) och mCherry (594/618 till 670 nm) (
- Validera exakt ramprogram separation, som celler omvandlade med varje enskild FP syns bara i motsvarande kanal och frånvarande från resten (figur 2C). Dessutom skapar detta definieras flerkanalig strategi en unik 5-kanaler "Colorprint" som gör att efterföljande färganalys och klon spårning och har fördelen att minska hämtningstider jämfört med spektral avbildning.
- Process bilder med Leica LAS-AF v2.4.1 programvara för att skapa referensspektra av alla 5 ramprogrammen samt autofluorescens (Figur 2A). Använda individuell FP-spektra och skillnaden i fluorescens ljusstyrka (uttryckt som% av EGFP) av Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) och mCherry (47%) som 5 sekventiella avbildnings kanaler enligt följande: Cerulean (458/468 till 482 nm), EGFP (488/496 till 514 nm), Venus (514/523 till 558 nm), tdTomato (561/579 till 597 nm) och mCherry (594/618 till 670 nm) (
- Separat fluorescens emission, i 2-foton-läge, med hög verkningsgrad anpassade dikroiska speglar och samla med fyra kanaler som inte descanned detektor (NDD) enligt följande: en dikroisk spegel vid 568 nm följt av en dikroisk spegel vid 465 nm, följt av a 452/45 nm emissionsfilter för SHG eller autofluorescens och Cerulean, ett 525/40 nm emissionsfilter för EGFP eller Venus, och en 648 nm dikroisk spegel och 620/60 nm emissionsfilter för tdTomato eller mCherry.
- Avslöja strukturell information från två-foton mikroskopi intrinsic kontrast avbildning (såsom beskrivits ovan) av vävnad autofluorescens från elastin, NADH, (exciteras vid 780 nm), och andra övertonen alstrad signal (SHG) från ben och fibrillärt kollagen (exciteras vid 920 nm eller 860 nm uppsamlades i en bakåtspridd riktning) 10,11.
- För 3D-volym rendering, samla serie xyz bilder (typiskt 1 x 1 x 4 ^ m 3 voxelstorlek) längs z-axeln vid 5 pm intervaller över en rad djup (150-300 nm) under hela benmärgen och andra vävnader, över stora områden med hjälp av kakel funktionen av programvaran för att automatiskt generera sydda volymer som omfattar en hel bröstben fossae, ca 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) och 300 nm (z) (figur 2D-2E) och Film 1.
- Bild calvarial märg direkt genom skallen utan sektione 2, 8.
- Avsnitt bröstbenet längs sagittalplanet (TUDELNING) och sedantvärled vid skarven mellan 2 sternal Fosse och image genom snittet ansiktet 3,4,12 (översikt i figur 1B anpassat från Takaku m.fl. 3).
- För 4D tidsförlopp imaging, placera nyligen utskuren popliteal lymfkörtel, mjälte, lungor, eller calvarial benprover uncut på 35 mm nummer 0 coverglass odlingsskålar i 50-100 l DMEM, 10% FBS innehållande 20 mM HEPES vid 37 ° C och använda 2-foton Ti-Sa excitation (860 nm) i kombination med konfokala excitation (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) och Leica resonans scanner (8000 Hz / s), med z-stackar (~ 80 um) vid 20 sek intervall i upp till 1 tim.
- För samtidig tre färger 2P imaging använder Ti-Sa trimmad till 860 nm samtidigt med OPO laser (trimmad vid 1,130 nm för tdTomato, eller 1140 nm mCherry) (film 2).
- Rekonstruktion och analys av 3D Volymer och 4D tidssekvenser
- Använd Imaris x64 softwär version 7.6, eller alternativa programvaror för att omvandla de kaklade-högar av råbilder i volym-renderade (3D) uppgifter om fluorescerande celler inuti benmärgen och olika vävnader samt att exportera dem som 3D-rotation filmer, som tidigare beskrivits 3,4 (film 1) steg-för-steg-exempel:
- I Imaris, Öppna z-stack bild; Välj "Surpass" för att visa 3D-volym visualisering.
- Använd "navigera" att höja volymen ca 360 °.
- Välj "Animation" för att skapa en animering; använda nyckelrutor för att lägga till utvalda vyer, zoom, rotationer av volymen; Förhandsgranska filmen, redigera efter behov och spara filen i en önskad film format (ex: avi, mov).
- För kvantitativ bedömning av 3D-cell och klon frekvens, positioner, storlekar och distribution, ytterligare process z-stackar som använder Imaris XT-moduler som integrerar MATLAB-program som utför avståndsmåttstämmer för (med ett avstånd omvandling algoritm) och kluster analys, som tidigare beskrivits 3,4. Trans sekvenserna av bildstaplar med tiden till volym renderade fyrdimensionella (4D) filmer med Imaris x64 programvara och använda plats och yta analys för halvautomatiserad spårning av cellmotilitet i tre dimensioner med hjälp av autoregressiva rörelsealgoritmer.
- Utför multispektral bildanalys av celler enligt följande: extrahera flera färger märkta fläckar genom att lägga alla fem kanaler via kanal aritmetiska av Imaris XT in i en ny kanal; bestämma för alla fläckar (celler) medelintensitets fluorescens i var och en av de fem komponentkanalerna. Exportera värdena i Excel programvara för att rita grafer visar den unika "Colorprint" dvs den relativa% av varje FP i individuell cell (Figur 2E kurva). Korrigera datauppsättningen för vävnads drift, och beräkna cell hastighet och förskjutning över tiden, spårlängder, vägar och avstånd; exportvärden i Excel SOFtware att rita grafer. Montera sammansatta figurer med Adobe Photoshop CSS 5 programvara.
- Använd Imaris x64 softwär version 7.6, eller alternativa programvaror för att omvandla de kaklade-högar av råbilder i volym-renderade (3D) uppgifter om fluorescerande celler inuti benmärgen och olika vävnader samt att exportera dem som 3D-rotation filmer, som tidigare beskrivits 3,4 (film 1) steg-för-steg-exempel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela montering 3D konfokala / 2-foton mikroskopi rekonstruktioner av bröstbenmärgs tidsförloppet avslöjade inympning och expansion av transplanterade co-5fps i ett mönster med anmärkningsvärda egenskaper: kloner verkade tydligt avgränsad, homogent märkt med bred palett av färger från början och framsteg över tiden för att företrädesvis innehålla celler av mestadels en färg. Konfokalmikroskopi setup och representativa exempel på avbildnings 5fps-märkt HSPC i sternala benmärg illustreras i Figur 2 och Filmer 1 och 2.
Hela-mount 3D konfokala / 2-foton mikroskopi rekonstruktioner av intakta vävnader demonstrera möjligheten att spåra öde färgmärkta BM-härledda celler under längre tidsperioder i de levande vävnaderna. Representativa exempel på benmärg härledda celler i hematopoetiska och icke-hematopoetiska organ efter transplantation visas i Fi gur 3.
Figur 1 Översikt över de experimentella procedurer. A) De schematiska stegen illustrerar isolering av Lin BM-celler, transduktion med Lego vektorer som kodar en mängd olika FPS färgvarianter, och reinfusion av omvandlade celler in-Myelosuppression ablateras möss (benmärgstransplantation). B) Benmärgs (bröstbenet, calvaria ), samt olika organ / vävnader undersöktes med konfokala och två-foton mikroskopi vid olika tidpunkter efter transplantation. Panel A är anpassad från figur 1 i et al. Malide 4 och panel B anpassad från figur 1 i Takaku et al 3.
2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2 Konfokalmikroskopi setup och representativt exempel för avbildning 5fps-märkt HSPC i benmärgen. A) Spectral (xyλ) avbildning som används för att spela in referensemissionsspektra för varje FP, illustrerad i normaliserade histogrammen pseudocolored med cyan (Cerulean), grön (EGFP), gul (Venus), magenta (tdTomato) och röd (mCherry): exalterat med 594 Nm (solid röd linje) jämfört med 561 Nm (streckad röd linje) våglängds B) Fem kanaler inställda på bild sekventiellt utsläpp av:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venus ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm) och mCherry (618-670 nm). Paneler A och B är anpassade från figur 1 i Malide et al. 4 C) avbildning av sternala BM från möss som transplanterats med transducerade med individuella FP vektorer. Varje FP var synlig endast i cellerna transducerade med motsvarande vektorn avbildas i lämplig lmAnnel och frånvarande från de andra (ingen överhörning). D, E) Engraftment och utbyggnad av trans samarbete 5FP markerade cellerna i benmärgen in vivo. Dag 4 efter transplantation (D) kluster av celler som är markerade i många olika färger var synliga närhet till benet kanten (SHG, vit), företrädesvis i anslutning till det gemensamma mellan två fossae. Vid dag 30 (E) ett stort klon av unik färg (grönt - gult) har utvidgats till att ockupera hela fossae som visas i den sammanslagna samt enstaka kanaler bilder. Ramprogrammen innehållsanalys visar homogen märkning med två ramprogrammen varianter EGFP och Venus.
Figur 3. Exempel på benmärg härledda celler i hematopoetiska och icke-hematopoetiska organ efter transplantation. Olika tisSues och organ avbildades intakt genom djup 150-200 um och stora ytor, beräkningsmässigt sydd och återges i 3D som skugg rekonstruktioner. A) Poplietallymfknutor lymfkörtel på 120 dagar efter transplantationen demonstrerar spridda celler oftast markerade med gul (Venus) och röd (mCherry) perifert omgivna av kollagenfibrer (vit, SHG). B) Likaså mjälten samtidigt visar små kluster och mestadels spridda celler i olika färger sammanflätade med kollagenfibrer nätverk. C) i levern fluorescerande celler med morfologi tyder på stellatceller eller makrofager (Kupffer celler) i olika färger var i linje längs kollagenfibrer nätverk (SHG vit) avgränsar lever lobulär strukturer. D) I en hud flik avbildas från dermal sido fluorescerande celler av olika färger och morfologier sågs, de flesta med stor storlek och morfologi tyder Langerhanska s eller dendritiska liknande identitet, LYIng enligt elastin fibrer (autofluorescens vid 780 nm, vit) och längs kollagen (SHG vid 920 nm, vit) muskelfibrer och hårsäckar. E) I hjärtat sett från epicardial sidan många enskilda stora fluorescerande celler med makrofag-liknande morfologi ursprung från flera kloner baserade på de olika färgerna sett syns ytligt och även varvat djupare mellan hjärtmuskelceller (vit) visualiseras genom sin svår två-foton autofluorescens (vid 780 nm). Inga FP fluorescerande kardiomyocyter iakttogs. Närliggande celler (CE) av samma färg tyder på plats proliferation och korta migration. F) I lungan många fluorescerande celler med en skiftande palett av färger var utspridda i spetsliknande struktur kollagenfibrer (SHG) på alla djup nivåer, med varierande morfologier tyder dendritiska celler, makrofager, och typ 2 pneumocyt identiteter.
Film 1. 3D rekonstruktion av sternal BM på 4 dagar efter transplantationen Co 5fps. kluster av celler som är markerade i många olika färger var synliga i nära anslutning till benet kanten (SHG, vit), företrädesvis i anslutning till det gemensamma mellan två fossae. Klicka här att se den här filmen.
Film 2 4D time lapse bröst BM två-foton och OPO mikroskopi på dag 39 efter transplantation Co 3 bilder per sekund (Cerulean - vit, Venus - gul, tdTomato - magenta) ben (SHG i vitt). Obs flera statiska kloner markerade med gult eller gul-magenta kombination intill ben i motsats till mycket rörliga individuella myeloida progenitorceller. klicka gärna här för att se den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här detaljerna i en kraftfull metod som nyligen tagits fram för klonal cell spårning, som kombinerar den stora mångfald som genereras av kombinato märkning med 5FP-kodande Lego vektorer och bildbehandling med tandem konfokala och 2-foton mikroskopi för att uppnå volymetrisk och dynamisk avbildning i levande vävnader. Detta utvidgades användningen av FP-baserade färgmärkning genom att spela in konfokal spektral identitet i fem "distinkta" 8-bits kanaler. Således det relativa förhållandet mellan Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, mCherry inom varje cell skapar en unik "Colorprint" för identifiering av klonal avkomma. Den multicolor märkning av 5fps ökar paletten etikett med mer mångfald, som visades särskilt användbar när man studerar fördelning, kontakter, kaklade arrangemang och konkurrenskraftiga interaktioner mellan celler eller grupper av celler av samma typ i täta vävnadsprover. I kombination med 2-foton-excitation av inneboende strukturella egenskaper av olika vävnader ochorgan, kan vi spåra färg märkt klonala celler i deras naturliga miljö utan behov av fixering och fysisk snittning. Demonstrationen som dotterceller som härrör från enskilda stamceller behålla en distinkt "färg-print", trots differentiering och proliferation visades i vårt publicerad studie, med hundratals differentierade celler som finns i enskilda in vitro kolonier (CFU) som visar samma "Colorprint."
Detta tillvägagångssätt kombinerar fördelarna med encelliga löst högupplösta bilder tillsammans med optisk sektione via konfokalmikroskopi. Mycket stora x - y (mm 2) regioner i intakta tät vävnad volym kan undersökas genom att generera kaklade-bilder. Dessa högupplösta bilder från optiska sektioner kan användas för beräknings rekonstruera (automatiskt och "on-the-fly") komplett 3D volymer av stor komplexitet till djup av ~ 30 um, bestående ~ 20-30 lager av celler,vaskulär, ben och kollagenstrukturer. 3D rekonstruktioner kan användas för morfometriska icke-invasiva kvantitativa analyser av biologisk intresse. Ett viktigt förbehåll att påpeka är att stora volymer / högupplösande avbildning är tidskrävande, till exempel 1 timme per ~ 1 mm 3 av vävnad (en fossae av bröstbenet), därför rekommenderar vi imaging högst 1 mus per experiment per dag då benmärg samt olika vävnader måste undersökas i detalj.
Även om det för närvarande är tekniskt omöjligt att avbilda bröst benmärg i samma musen flera gånger över tid, kan värdefull information erhållas genom att studera individuella möss vid olika tidpunkter från en kohort ursprungligen transplanteras med samma population av Lego-omvandlade Lin-celler. Bröstbenet är ett utmärkt läge för att studera benmärgs förnyelse på grund av sin tidiga och fullständig hematopoietisk återuppbyggnad, stabilitet, enkel snitt, reproducerbarhet, och stor volym. Det är viktigt att nå nära 50% transduktion effektivitet Lin celler för varje enskild FP vektor, innan du fortsätter med en transplantation och bildexperiment, för att få tillräckligt med färg mångfald och FP-uttryckande celler för att göra experimentet informativa. Det kommer alltid att finnas en varning att mer än en klon får av en slump hamnar med liknande eller identiska colorprints, särskilt om transduktion är ineffektiva och många celler har bara en eller två införanden. Det är också viktigt att vara säker på att varje enskild injektion i svansvenen levereras nära 100% av celldosen.
Detta bevisar genomförbarheten av högupplösta 4D leva dynamiska studier genom att kombinera resonant scanning multifoton och konfokala time-lapse avbildning. Det gör inte bara statiska karakterisering av olika kloner utan även analys av kinetiska skillnader mellan celler markerade med samma färg. Dessutom visar video-rate 4D avbildning av tre FPS märkta prover som använder successfully i tandem Tisa och OPO lasrar för högre effektivitet, mindre skadliga, djupare penetration av levande vävnad, vilket banade väg för 2-foton intravital avbildning. Dessutom inrättas ett värdefullt alternativ för att spåra celler under långa perioder (månader) övervinna nuvarande färgbaserade begränsningar. Detta tillvägagångssätt använder kommersiellt tillgängliga konfokala och två-photon lasermikroskop och automatiserade användar interaktiva bildanalys metoder som bygger på ett kommersiellt tillgängligt programpaket möjliggör enkel implementering i vanliga mikroskopifaciliteter.
Slutligen är denna metod inte begränsad till analys av HSPCs. Många biologiska system skulle kunna dra nytta av möjligheten att lösa Spatiotemporal arrangemang av kloner komplexa cellulära och strukturella element via multicolor märkning och konfokala och 2-photon avbildning. Organåterhämtning, immunsvar och tumörmetastaser mönster skulle kunna förhöras, att föreslå några potentiella tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
