Summary

In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II

Published: August 01, 2014
doi:

Summary

Il protocollo per rilevare le cellule autoreattive T CD4 nel cervello e nel cuore dalla colorazione diretto con complesso maggiore di istocompatibilità di classe II dextramers è stato descritto nella presente relazione. Per un'analisi completa, un metodo affidabile per enumerare le frequenze di cellule CD4 + T antigene-specifiche in situ è pensato anche.

Abstract

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.

Introduction

L'uso del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri per la rilevazione di cellule antigene-specifiche CD4 T è stata una sfida 1-7. Per migliorare la sensibilità di rilevazione di MHC classe II tetrameri, il team di ricerca ha creato tetrameri di prossima generazione, denominati "dextramers" 8. Dextramers contengono dorsali destrano in cui più frazioni streptavidina-fluoroforo sono coniugate, in modo che diversi peptidi-tethered, biotinilati monomeri MHC possono essere collegati ad una molecola destrano 9. Così, grandi aggregati di dextramers MHC che contengono diversi complessi MHC-peptide possono interagire con molteplici recettori delle cellule T (TCR).

Questo gruppo ha recentemente generato dextramers per varie auto-antigeni e ha dimostrato che la sensibilità di rilevazione di dextramers era di circa cinque volte più di tetrameri 8. I sistemi sperimentali includono encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotto con proteolipid proteina (PLP) 139-151 nei topi SJL; EAE indotta con mielina degli oligodendrociti glicoproteina (MOG) 35-55 in topi C57BL / 6; e miocardite autoimmune sperimentale (EAM) indotta con miosina cardiaca catena pesante-α (MyHC) 334-352 in A / J topi. Questo studio dimostra l'uso di PLP 139-151 – e MyHC 334-352 dextramers per rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T in situ con specificità sviluppando un protocollo di colorazione diretta, eliminando così la necessità di amplificare i segnali utilizzando anticorpi fluoroforo, un approccio comunemente impiegato con l'utilizzo di tetrameri. Inoltre, un metodo completo di valutare tessuti è anche stato studiato per enumerare affidabile le frequenze di cellule CD4 T antigene-specifiche in situ 10. Rilevamento di cellule T antigene-specifiche in situ permette delineazione di eventi provocati da stimoli antigenici specifici da quelle causate dall'attivazione astanti. Allo stesso modo, la tecnica in situ anche provides opportunità per monitorare la cinetica di infiltrazioni di cellule T antigene-specifiche negli organi bersaglio.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure di polizia sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dalla University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Induzione di EAE Per indurre EAE, preparare l'emulsione peptide / adiuvante completo di Freund (CFA) come descritto in 11 con le seguenti modifiche: Fase 1.1:. Preparare PLP 139-151 ad una concentrazione di 1 mg /…

Representative Results

In questo rapporto, nella rilevazione in situ di antigene-specifiche, autoreattivi cellule T CD4 di colorazione diretto con MHC di classe II dextramers è descritto. Sezioni cerebrali appena tagliato sono state derivate da topi EAE e colorate con cocktail contenenti PLP 139-151 (controllo) dextramers e anti-CD4 (specifico) o TMEV 70-86. I primi pannelli in figura 1 mostra l'analisi LSCM di sezioni cerebrali costained con PLP 139-151 dextramers (rosso) e di anticorpi CD4 (verde), in…

Discussion

A differenza di tetrameri MHC di classe, l'uso di MHC classe II tetrameri per applicazioni di routine continua ad essere impegnativo, soprattutto per enumerare le frequenze precursori di cellule T CD4 autoreattivi bassa affinità, dovute in parte alla loro dipendenza di attivazione 6,15-17. Recentemente, questo problema è stato aggirato con la creazione della prossima generazione di tetrameri, chiamati "dextramers," ci permette di rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T per un certo numer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association e dei Bambini Cardiomiopatia Foundation (SDG2462390204001), e il National Institutes of Health (HL114669). CM è un destinatario di una borsa di assegno di ricerca post-dottorato assegnato dalla Fondazione miocardite, NJ.

Materials

CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4οC
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4οC
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4οC
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4οC
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 οC
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4οC
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4οC
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
Dextran conjugated SA-APC  Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4οC
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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