DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Innhenting av høy kvalitet DNA for menneske genetiske studier er viktig i sykdomsgenet funnet prosessen. Blod, selv krever en invasiv prosedyre og også å være dyrere enn spytt samling, er foretrukket for å skape udødeliggjorte cellelinjer som uendelig kilde til DNA eller iPSCs for funksjonelle studier, og noen ganger blod-DNA blir brukt når cellelinjer som ikke er tilgjengelige. Men å skaffe blod krever et trenet phlebotomist og blod har en kortere halveringstid enn spytt en. DNA fra spytt er rimeligere og enklere å få tak i, siden det kan samles inn og sendes i posten uten behov for en phlebotomist, og dermed øke potensielle lagt bassenger godt utover nedslagsfeltet for sykehus og laboratorier to. Study påmelding kan forbedres når motivet har muligheten til å gi en spyttprøve i stedet for blod 3, 4. Bekymringer om mengden og kvaliteten av DNA fra spytt kan ha begrenset sin omfattende osse til tross for tallrike studier nylige studier som viser egnetheten av hele spytt, med et gjennomsnitt på 4,3 x 10 5 celler pr milliliter, etter DNA-testing over de eldre bukkale vattpinner metoder som ikke oppnår betydelige mengder av spytt 2, 3, 4, 5, 6.. Selv en beskjeden litteraturen eksisterer viser egnetheten av hele spytt avledet DNA for genotyping applikasjoner inkludert mikromatrisebasert metoder 8, 9, 10, har ingen studier undersøkt neste generasjon sekvensering (NGS). Målet for optimalisering av hele denne spytt DNA-ekstraksjon protokollen var å maksimere kvantitet og kvalitet for genetikk applikasjoner på en kostnadseffektiv måte som er lett implementeres i laboratorier med felles reagenser og forbruksmateriell.
DNA-ekstraksjon fra spytt krever flere prosedyrer: 1) innsamling og lagring, 2) cellelyse, 3) RNase behandling, 4) protein nedbør, 5) etanol nedbør, 6) DNA rehydrering. DNA Stabilization Buffer løsning, beskrevettidligere 2, funksjoner tilstrekkelig uten endringer. Ingen forsøk på å optimalisere RNase behandling og DNA rehydrering trinn ble laget. For hver gjenværende trinn ble flere variabler som kan påvirke avkastningen identifisert. Hver variabel ble manipulert individuelt og forbedring i utbytte og kvalitet ble vurdert statistisk. For variabler som ble vist å forbedre utbyttet og / eller DNA-kvalitet, ble de optimale verdier som inngår i den avsluttende protokoll.
Den foreliggende fremgangsmåte er en optimalisert DNA-ekstraksjon protokoll som har betydelig forbedret utbytte av høy molekylvekt-DNA sammenlignet med standardmetoder, uten at det går DNA-kvalitet. Den kritiske trinnet med størst effekt på yielden mest var trinn 5.2, som inkluderer en lengre sentrifuge trinnet under etanol nedbør enn noen publisert protokollen anmeldt her, bortsett fra en som ikke var allment distribuert 11. Ingen endringer i DNA-kvalitet forbundet med denne lenger sentrifugering ble p…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
Proteinase K | Sigma | P6556 |
Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
Isopropanol | Fisher | A416-4 |
Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
NaCl | Fisher | AC194090010 |
Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
Equipment | ||
Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |