DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
La obtención de ADN de alta calidad para los estudios genéticos humanos es esencial en el proceso de descubrimiento de genes de enfermedades. Blood, aunque requiere un procedimiento invasivo y también de ser más caro que la recolección de saliva, se ve favorecida por la creación de líneas celulares inmortalizadas como una fuente infinita de ADN, o iPSCs para estudios funcionales, y algunas veces de ADN de sangre se utiliza cuando las líneas celulares no están disponibles. Sin embargo, la obtención de la sangre requiere un flebotomista capacitado y la sangre tiene una vida media más corta que la saliva 1. ADN de la saliva es menos costoso y más fácil de obtener, ya que puede ser recogida y enviada a través del correo electrónico sin la necesidad de un flebotomista, aumentando de este modo posibles piscinas temáticas mucho más allá de la zona de influencia de los hospitales y los laboratorios 2. Estudio de inscripción puede ser mejorado cuando los sujetos tienen la opción de dar una muestra de saliva en lugar de sangre 3, 4. Las preocupaciones sobre la cantidad y calidad del ADN de la saliva pueden haber limitado su nos generalizadae pesar de numerosos estudios estudios recientes que demuestran la idoneidad de la saliva total, con un promedio de 4,3 x 10 5 células por mililitro, para pruebas de ADN a través de los métodos de hisopos bucales mayores que no obtuvieron cantidades significativas de saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mientras que existe una literatura modesta que muestra la idoneidad de ADN derivado de la saliva entera para aplicaciones de genotipificación incluyendo métodos basados en microarrays 8, 9, la secuenciación de próxima generación 10, ningún estudio ha examinado (NGS). El objetivo de la optimización de este protocolo de extracción de ADN de la saliva entera era maximizar la cantidad y calidad de las aplicaciones de la genética en una manera rentable que se implementa fácilmente en laboratorios con reactivos y consumibles comunes.
Extracción de ADN de la saliva requiere de varios procedimientos: 1) la recolección y almacenamiento, 2) la lisis celular, 3) tratamiento con RNasa, 4) la precipitación de proteínas, 5) la precipitación con etanol, 6) rehidratación ADN. La solución de ADN de Estabilización de Buffer, se describe2 anteriormente, las funciones adecuadamente sin alteración. No se hizo ningún intento de optimizar el tratamiento con RNasa y medidas de rehidratación de ADN. Para cada paso restante, se identificaron diversas variables que pueden afectar el rendimiento. Cada variable fue manipulado de forma individual y la mejora en el rendimiento y la calidad se evaluó estadísticamente. Para las variables que se mostraron para mejorar el rendimiento y / o calidad del ADN, se incluyeron los valores óptimos en el protocolo final.
El presente procedimiento es un protocolo de extracción de ADN optimizada que ha mejorado considerablemente el rendimiento de ADN de alto peso molecular en comparación con métodos estándar, sin comprometer la calidad del ADN. El paso crítico con el mayor efecto sobre el rendimiento más fue paso 5.2, que incluye una etapa de centrifugación ya durante la precipitación de etanol que cualquier protocolo publicado revisado aquí, excepto que no estaba ampliamente distribuido 11. No se detectaron cambios en…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
Proteinase K | Sigma | P6556 |
Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
Isopropanol | Fisher | A416-4 |
Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
NaCl | Fisher | AC194090010 |
Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
Equipment | ||
Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |