Summary
Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.
Introduction
Het is vele jaren bekend dat deleties of extra exemplaren van chromosomale segmenten veroorzaken verstandelijke beperking, dysmorfie en congentical misvormingen, en in sommige gevallen leiden tot genetische syndromen 1. Echter, de enige technologie beschikbaar tot het midden van de jaren 2000 voor het genoom-brede detectie van deze veranderingen was G-gestreepte chromosoom analyse, die een resolutie van rond 5-10Mb heeft, afhankelijk van de regio en de aard van de onbalans, en dat kan niet detecteren abnormale chromosomen waar materiaal is vervangen door een gebied van een ander chromosoom met hetzelfde bandenpatroon. Bijkomende cytogenetische technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie en multiplex ligatie-specifieke probe versterking zijn beschikbaar voor de ondervraging van specifieke loci geweest, in de gevallen van vermoedelijke specifieke syndromatische onbalans, maar het was niet tot de invoering van de array-comparatieve genomische hybridisatie (array CGH) in routine klinische diagnostische service 2-5 dat genoom-brede detectie van copy number varianten (CNV) en werd het mogelijk op een sterk verhoogde resolutie (meestal rond de 120kb). Klinische servicewerkzaamheden naast studies hebben aangetoond dat CNV sommige gebieden zijn wijdverspreid in de normale populatie 6-7, terwijl andere CNV eerder detecteerbaar zijn verbonden neurodisabilities zoals autisme en epilepsie 8-11.
De in dit document beschreven protocol wordt gebruikt in onze Britse National Health Service (NHS) klinisch diagnostisch laboratorium; we gebruiken roman hybridisatie strategieën, batch testen en robotica om de kosten in deze staat gefinancierde dienst te minimaliseren.
Vóór het protocol hieronder dient hoogwaardige DNA worden geëxtraheerd uit het geschikte uitgangsmateriaal, gewoonlijk bloed, gekweekte cellen of weefselmonsters. Spectrofotometrie kan worden gebruikt om te worden gemeten (moet> 50 ng / ul) en controleer 260: 280 absorptie verhoudingen (moeten be 1.8-2.0). Gel electroforese kan worden gebruikt om te controleren dat het DNA van hoog molecuulgewicht zonder significante afbraak.
Dit protocol is ontworpen voor een hogere doorvoersnelheid laboratoria die zijn labelen 96 monsters per run met behulp van geautomatiseerde liquid handling robotica. Het kan echter worden aangepast voor lagere doorvoer labs zonder automatisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bij de etikettering Reactie
- Vóór, pre-aliquot cyanine 3 en 5 gelabeld dUTPs, ongelabelde nucleotiden en willekeurige primers gebruikt bij de concentraties producent aanbevolen in 96-well platen en bewaar bij -20 C gebruiksklaar. Voor de toepassing van dit protocol, portie 10,5 ul van de juiste gelabeld dUTP en 10,5 ul ongelabelde nucleotiden en random primers aan elk putje.
- Ontdooi de kant-en-klare 96-well plaat nucleotiden en primers bij 4 ° C gedurende 1 uur, beschermd tegen licht.
- Eenmaal ontdooid, evenwicht deze plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, beschermd tegen licht.
- Equilibreer DNA monsters bij 60 ° C gedurende ten minste 15 min.
- Met een vloeistof handlingrobot afzien nuclease-vrij water aan elk putje van een 96-wells plaat.
OPMERKING: De hoeveelheid water is afhankelijk van de concentratie van elke ingang DNA monster en die volstaat om een eindconcentratie van 50 ng / ul te zijn. - Met een vloeistof hanDLoad robot, pipet 1 ug DNA in een putje van de plaat met 96 putjes (zie 1.5) om het totale volume op 20 ui te brengen.
OPMERKING: Kleinere hoeveelheden DNA kan worden gebruikt, hoewel de kwaliteit van de verkregen gegevens kunnen worden aangetast (edele monsters ingang DNA hoeveelheden tot 400 ng worden gebruikt). - Met een vloeistof handlingrobot, overdracht 20 ul van het evenwicht nucleotiden en primers in elk putje van de plaat verdunde DNA.
- Verzegeling van de 96-well plaat met strip caps (een goede afdichting is van cruciaal belang).
- Denatureren het DNA bij 99 ° C gedurende 10 min in een PCR-machine met een verwarmd deksel en koel vervolgens snel op ijs gedurende 5 minuten te hybridiseren primers.
- Met behulp van een liquid handling robot, voeg 10 ul van Klenow- Exo DNA polymerase enzym om elke DNA's en pipet mix grondig.
OPMERKING: Het totale volume moet 50 pi. - Sluit de plaat met 96 putjes en incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.
OPMERKING: Een kortere incubatie van 4 uur voldoende is echter een O / N incubation kan handiger. - Met een vloeistof handlingrobot, voeg 5 ul stopbuffer aan elk putje.
OPMERKING: Een samenvatting van de reagentia voor etikettering reactie is weergegeven in tabel 1.
2. Verwijdering van opgenomen nucleotiden
- Verwijder ingebouwde nucleotiden met silicagel membraan spin kolommen en een goede spinkolom verwerking robot (de spinkolommen kan ook handmatig worden verwerkt). Volg de instructies van de fabrikant.
- De inhoud van elk putje naar een 2 ml buisje; pre-label deze met goed ID's.
Opmerking: Deze stap kan handmatig of bij voorkeur uitgevoerd met een liquid handling robot. - Bij gebruik van een spin kolom verwerking robot, laad dan de robot met 2 ml buisjes, DNA-zuivering spinkolommen en bijbehorende buffers.
- Voeg 250 ul hoog zoutgehalte, DNA bindende buffer (buffer PB) de etikettering reactie op het gemerkte DNA binden aan het siliciumdioxidemembraan.
- Het verwijderen van verontreinigingen door het wassen van het membraan tweemaal met 500 ul wasbuffer (buffer PE).
- Voeg 15 ul laag zout elutiebuffer (buffer EB) aan het membraan aan de gezuiverde, gelabelde DNA herstellen een volume van ~ 12 ul.
- De inhoud van elk putje naar een 2 ml buisje; pre-label deze met goed ID's.
3. Combineer Hyb Pairs
- Combineer de juiste paren van cyanine 3 en 5 gelabeld DNA, COT-1 DNA, een fabrikant geleverde blokkeren mix en een fabrikant hybridisatiebuffer met een vloeistof handlingrobot.
LET OP: Deze hyb paren kunnen een monster en een referentie, of monster vs monster zijn als gedeeld CNV zijn geen probleem (bijvoorbeeld, we routinematig koppelen fenotype-mismatch monsters, zoals een renale dysplasie patiënt versus een craniosynostosis patiënt, want ze zijn erg waarschijnlijk hebben dezelfde klinisch significante CNV). Bij gebruik van een DNA, is een commerciële DNA aanvoer aanbevolen en dient naast het monster verwerkt.- Met een vloeistofverwerking robot, voeg COT-1 DNA (3333 ng / gl), de fabrikant geleverde blokkerende mix en hybridisatie buffer aan elk putje van een plaat met 96 putjes zodat elk putje bevat 1,1 gl COT-1 DNA, 4,95 pl blokkerende mix en 24.75 gl hybridisatiebuffer.
- Voeg 9.35 pl van de geschikte cyanine 3-gemerkte DNA in elk putje. Pre-nat elke tip om te verbeteren pipetteren nauwkeurigheid.
- Voeg 9.35 ul van de juiste cyanine 5-gemerkte DNA in elk putje. Pre-nat elke tip om te verbeteren pipetteren nauwkeurigheid.
- Sluit de plaat met 96 putjes en vortex gedurende 1 minuut. Spin 96-putjesplaat inhoud verzamelen op de bodem van elk putje.
4. Hybridisatie
- Verwarm een hybridisatie oven voor op 65oC en voorverwarmen één steun glijbaan en een hybridisatie kamer voor elke array dia.
- Denatureren het gemerkte DNA in een pre-hybridisatie incubatie alvorens aanbrengen van de arrays. Voer hybridisatie in een roterende oven gedurende 24 uur.
- Incubeer de plaat met 96 putjes bij 70 ° C gedurende 30 minuten en laat bij 37 ° C gedurende ten minste 5 minuten.
- Werken op een verwarmd platform bij 42 ° C, telkens wordt geladen tracks glijden in een hybridisatiekamer vóór gebruik. Zorg ervoor dat het transparante deel van de pakking dia lijn ligt met de 'windowed' deel van de hybridisatie kamer.
- Pipet 42 ul van de hybridisatiemengsel voorheen opgesteld (zie paragraaf 3) op de juiste positie op de array back-dia. Pre-nat elke tip om te verbeteren pipetteren nauwkeurigheid. Pipet langzaam op het midden van elke positie, zorg ervoor dat de vloeistof niet de rubberen ring grens raken.
- Zodra alle posities op de backing dia zijn gevuld, kantel de serie dia op en monteer de hybridisatie kamer. Zorg ervoor dat de zijde van de array met het schrijven op het wordt geconfronteerd met de backing glijbaan. Zorg ervoor dat u de hybridisatiekamer schroef helemaal vast.
- Inspecteer de geassembleerde hybridisatie kamer. ENSure dat er geen lekkage van hybridisatie mix buiten de rubberen ring grenzen en elke luchtbel ~ 4 mm hoog bij de hybridisatie kamer wordt rustte op de verticaal. Draai de hybridisatie kamer en controleren of er geen luchtbellen die vast zitten in de positie en niet bewegen. Als er een van deze, geven de kamer een scherpe tik op de bank. Controleer of alle luchtbellen bewegen.
- Plaats de hybridisatiekamer in de draaiende oven bij 65 ° C gedurende 24 uur. Zorg ervoor dat de oven rotor is evenwichtig; Gebruik andere lege kamers indien nodig.
5. Wassen en scannen van dia's
- Was arrays om overtollig gelabelde DNA te verwijderen en vervolgens scannen naar fluorescentie van elke probe meten.
- Neem hybridisatie kamers uit de oven en uit elkaar te halen. De array en pakking slides zullen aan elkaar kleven; dompel deze in wasbuffer 1 en gebruik een paar plastic, platte randen tang om ze uit elkaar te wrikken.
- Discard de pakking dia en plaats de reeks dia in een rek ondergedompeld in buffer 1.
- Was de matrix dia ~ 700 ml verse wasbuffer 1 gedurende 5 minuten krachtig roeren (gebruik een vlo en een magnetische roerder).
- Breng de reeks dia naar ~ 700 ml wasbuffer 2 en was voor 90 sec, krachtig roeren. Til de array schuift uit wasbuffer 2, moeten ze droog te voorschijn komen.
- Laad de reeks dia in een dia houder van de scanner, met behulp van een dia beschermer. Laad de schuif in de array scanner en scan de instructies van de fabrikant array.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elke probe op een matrix gehybridiseerd wordt gevisualiseerd als een mengsel van rode en groene fluorochromen (zie figuur 1). De verhouding van rood naar groen fluorescent signaal voor elke probe wordt gekwantificeerd door de scanner en de bijbehorende software uitzet deze als log2 afstemmen op hun genomische positie en gebieden identificeert die buiten ingestelde grenzen. De resulterende array sporen laten interpretatie van de regio's geïdentificeerd als genomically onevenwichtig. Bijvoorbeeld, het spoor van een kind met Williams syndroom, een terugkerend microdeletie syndroom veroorzaakt door lage kopie herhalingen in het proximale gebied van chromosoom 7, wordt geïllustreerd in figuur 2. Deze onevenwichtigheid werd geïdentificeerd door de software en aangegeven door een rode lijn.
Probe fluorescerende log verhoudingen dienen nauwkeurig cluster rond 0, zie figuur 2, hetgeen een groen / rood verhouding van 1: 1 voor normale gebieden van het genoom. Verspreid scala sporen kunnen Resul t in onnauwkeurige roeping van abnormale gebieden, of het uitblijven van genomische onbalans te identificeren (zie figuur 3). Deze spreiding kan worden veroorzaakt door een aantal factoren, waaronder DNA slechte kwaliteit of de aanwezigheid van verhoogde niveaus van ozon in de atmosfeer. Monitoring van de ozonconcentraties wordt aanbevolen, en waar verhoogde ozonconcentraties zijn problematisch, gewijd ozon uitsluiting kasten zijn beschikbaar; gebruik van deze kasten leidt in de regel aanmerkelijk verbeterd scala kwaliteit.
Figuur 1. Afbeelding van een array na hybridisatie. De witte doos toont een vergroot gebied, waar rood sondes en groene sondes kunnen worden gevisualiseerd (met vermelding van onbalans voor de regio's vertegenwoordigd door deze sondes), tegen een achtergrond van gele sondes (met vermelding van evenwichtige genomische regio ).
Figuur 2. (A) Voorbeeld trace voor chromosoom 7 in een monster met een 1,7 MB deletie, blijkt uit een gemiddelde verhouding -0,8 43 opeenvolgende probes. De verwijderde regio in dit geval wordt geassocieerd met Williams-Beuren syndroom, in overeenstemming met de verwijzing indicatie van dysmorphic features, een hartafwijking en verstandelijke beperking. (B) De verwijderde gebied boven weergegeven in de USCS genoom browser, die de genen binnen de verwijderde regio. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3.Voorbeeld van een verspreide scala trace voor chromosoom 7 in een monster met een slechte hybridisatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Reagens | Volume (pl) |
| Primers & reactiebuffer | 20 |
| DNA (1 ug) + water | 20 |
| Exonuclease Klenow DNA polymerase | 10 |
Tabel 1. Samenvatting van de reagentia voor etikettering reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Array CGH zal niet evenwichtig herschikkingen of ploidie afwijkingen zoals triploïdie detecteren. Bovendien kunnen lage niveau mozaïek onevenwichtigheden niet worden gedetecteerd. Echter, array CGH heeft een hogere resolutie voor CNV detectie dan G-gestreepte chromosoom analyse die het heeft vervangen in veel cytogenetica laboratoria. Daarom is de huidige gouden standaard voor genoom-brede CNV detectie. Zij kan worden vervangen door next-generation sequencing technologie in de toekomst, maar op dit moment, de kosten en de technische complexiteit in verband met het gebruik van korte leest voor CNV detectie betekenen dat dit nog niet een goed geschikt voor klinisch gebruik.
De hier beschreven protocol is in routinematig gebruik in onze klinische dienst laboratorium. Twee runs van 96 monsters elk worden verwerkt per week met behulp van een vloeibare handlingrobot en een speciale silica membraan spin-kolom verwerking robot. Automatisering is sterk aanbevolen om de samenhang te verbeteren en de kwaliteit te handhaven. DNA geëxtraheerd uit bloed, Speeksel, prenatale monsters (bijv chorion villi of amniotische vloeistof) of weefselmonsters kunnen zijn en routinematig gebruikte met dit protocol.
Ozon is bekend cyaninekleurstoffen afneemt en daardoor ozon bewaking en bescherming wordt aanbevolen. Seizoensgebonden variatie in de ozonconcentraties is ook gebruikelijk. Ons laboratorium controleert en registreert ozonconcentraties continu. Een muur gemonteerde ozon verwijdering eenheid wordt gebruikt om de ozonconcentraties en bijzonder gevoelige delen van het protocol te verminderen (dwz, wassen en scannen arrays) worden uitgevoerd in ozonvrije kappen. Indien mogelijk worden de ozonconcentraties onder 5 ppb gehouden.
De meeste reagentia worden gekocht zoals kits van fabrikanten om de kwaliteitscontrole effectief te besteden; Dit is gebleken een effectieve strategie. Echter, dit betekent niet dat de kwaliteitscontrole niet vereist. Inderdaad, zijn kwaliteit metrics zorgvuldig gecontroleerd op eventuele afwijkingen: afgeleide standaarddeviatie van log2 ratio (dlrs) moet worden below 0.2, moet cyanine- 3 en 5-signaalintensiteiten groter zijn dan 500 en cyanine 3 en 5-signaal-ruis verhouding moet> 30. Deze statistieken worden gegenereerd als onderdeel van de scanprotocol door de scansoftware en worden opgenomen voor de lange termijn monitoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
